Summary
En billig, hög genomströmning metod för samtidig detektering av upp till 43 molekylära mål beskrivs. Tillämpningar av mPCR / RLB inkluderar mikrobiell skriva och detektering av flera patogener från kliniska prover.
Abstract
Multiplex PCR / bakåt Linje Blot Hybridisering analysen möjliggör detektering av upp till 43 molekylära mål i 43 prover med hjälp av en multiplex PCR-reaktionen följt av sond hybridisering på en nylon membran, som kan återanvändas. Sonder 5 "amin ändras så att fixering till membranet. Primers 5 "biotin modifierad som tillåter detektion av hybridiseras PCR-produkter som använder streptavidin-peroxidas och ett kemiluminiscent substrat via ljuskänslig film. Med låga inställningar och förbrukningsvaror kostnader är denna teknik billig (cirka USD 2 per prov), hög genomströmning (flera membran kan bearbetas samtidigt) och har en kort handläggningstid (cirka 10 timmar).
Tekniken kan utnyttjas på flera sätt. Flera givare kan utformas för att upptäcka sekvens variation inom ett förstärkt enda produkt eller flera produkter kan förstärkas samtidigt, med en (eller flera) prober som används för senare identifiering. En kombination av båda metoderna kan också användas inom en och samma analys. Möjligheten att inkludera flera sonder för en målsekvens gör analysen mycket specifika.
Publicerad tillämpningar av mPCR / RLB inkluderar detektion av gener för antibiotikaresistens 1,2, inskrivning av meticillinresistenta Staphylococcus aureus 3-5 och Salmonella sp 6, molekylär serotypning av Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 och enteroviruses 10,11, identifiering av Mycobacterium sp 12, upptäckt av genitala 13-15 och andningsvägarna 16 och andra 17 patogener och upptäckt och identifiering av mollicutes 18. Dock innebär den mångsidighet av tekniken ansökningarna är praktiskt taget obegränsad och inte begränsat till molekylär analys av mikroorganismer.
De fem stegen i mPCR / RLB är en) Primer och Probe design, b) DNA-extraktion och PCR-amplifiering c) utarbetande av membranet, d) hybridisering och detektion, samt e) Regeneration av membranet.
Protocol
Noggrann hänsyn måste tas till grundfärg och sond design. Alla tillgängliga sekvenser av målen av intresse från databaser som GenBank bör utnyttjas för att identifiera bevarade områden som är lämpliga mål. Om ett stort antal mål förstärks i en enda mPCR analys bör varje förstärks sekvensen av liknande längd och bör inte överstiga 300 baspar att undvika konkurrens. Ett alternativ tillämpning av metoden är att förstärka en längre målet genom att använda primers mot konserverade regioner och att använda flera sonder för att identifiera sekvensen variation inom amplicon. I detta fall kan den förstärkta PCR-produkten vara längre. Primer glödgning temperaturer bör alla vara lika, med PCR-förhållanden anpassas därefter. Grundfärger som utgör starka sekundär struktur eller primer dimer bör undvikas. Sigma Aldrich DNA-kalkylator ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) kan användas för att tillförlitligt förutsäga dessa funktioner.
DNA-prober bör utformas för att ha glödgning temperaturer nära 60 ° C. För att maximera specificitet, kan två sonder för varje mål av intresse att ingå i analysen, en hybridisering till framåt DNA-strängen i anslutning till den omvända primer bindningsställe, och den andra till den omvända del i anslutning till framåt primer bindningsställe. I detta fall måste både framåt och bakåt grundfärg vara biotin-ändras. Om endast en sond per förstärks målet används, då endast en primer behöver biotin ändras.
Vid utformningen av primers och prober för mPCR / RLB analys är det starkt rekommenderat att använda i silico metoder för att förutsäga PCR-produkter och sond hybridisering att korrelera med in vitro-resultat. Helst Detta görs med hjälp isolerar som hela arvsmassa är tillgänglig. Program som FastPCR (finns på http://primerdigital.com/fastpcr.html) kan användas för detta ändamål. Svag eller obefintlig sond signalen kan förutsägas var i silico analys visar obalanser baspar vilket resulterar i låga sond glödgning temperaturer.
DNA-extraktion teknikerna varierar beroende på de prover som testas, och PCR villkor kommer att vara beroende av primer design. Läsarna hänvisas till publikationer om enskilda analyser för mer information om DNA-extraktion och PCR-reagens och villkor 1-19.
Varje analys drivs med lämpliga kontroller för att tillhandahålla minst ett positivt och ett negativt sond signalen för varje sond på membranet, samt en DNA-fri kontroll. Dessutom är det fördelaktigt att ta med en sond på toppen av membranet som förväntas vara positivt för alla prover (t.ex. en art eller ett släkte specifika sond i händelse av en mikroorganism). Detta fungerar som en positiv kontroll sond, men också tillåter enkel orientering av resultaten.
1. Beredning av Membrane
- Förbered följande lösningar:
- 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8,4)
- 100 ml 0,5 M NaHCO 3
- 20 ml 16% EDAC
- 250 ml 0,1 M NaOH
- 250 ml 2xSSPE
- 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - plats i vattenbad vid 60 ° C
- 250 ml 20 mM EDTA.
- Värm ugnen till 60 ° C.
- Rengör Immunetics Miniblotter med 70% etanol.
- Späd oligonukleotid sonder i 0,5 M NaHCO 3 till en slutlig koncentration av 2 pmol / l och en volym på 200 l.
- Skär ett BiodyneC nylon membran till 15x15 cm. Med hjälp av en penna och linjal, regel av en 0,5 cm fritt utrymme runt toppen av membranet och skriva detaljer här.
- Täta membran i plastpåse med 20 ml gjorde nyligen 16% EDAC lösning och sten vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Tvätta membran i avjoniserat vatten i 30 sekunder.
- Placera membranet i miniblotter med kanaler som kör över membranet (parallellt med penna linje). Sätt stödkudde på plats och stäng läskpapper. Aspirera vätska från kanaler.
- Fyll körfält 1 och 45 med 150 l 0,5 M NaHCO 3. Användning 150 l av varje prob-lösning för att fylla körfält 2-44 i sekvens, som är noga med att undvika luftbubblor. Om en luftbubbla visas i kanalen, hålla pipetten på plats, snabbt aspirera lösningen så att luftbubblan att flyta till toppen av pipetten och sedan försöka igen. Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Aspirera sond lösningar, ta bort membran och tvätta i 250 ml 0,1 M NaOH i rumstemperatur i 9 minuter.
- Tvätta membran i 250 ml 2xSSPE i 30 sekunder.
- Tvätta membran i 250 ml förvärmda 2xSSPE/0.1% SDS i ugn vid 60 ° C i 5 minuter.
- Om den inte används för hybridisering omedelbart, tvätta membran i 240 ml 20 mM EDTA vid rumstemperatur i 20 minuter (reservera återstående 10 ml), sedan försegla membran i plastpåse med resterande 10 ml 20 mM EDTA och lagringE i kylskåp vid 4 ° C.
- Tvätta miniblotter med Pyroneg diskmedel och borste. Skölj och låt torka.
2. Hybridisering och detektion
- Förbered följande lösningar:
- 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - butik i vattenbad vid 60 ° C.
- 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - butik i vattenbad vid 60 ° C
- 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - butik i ugn vid 42 ° C
- 500 ml 2xSSPE - Håll i rumstemperatur
- 500 ml 1% SDS - butik i vattenbad vid 60 ° C från början (för steg 3)
- 250 ml 20 mM EDTA - Förvara i rumstemperatur (för steg 3).
- Sätt på en ugn vid 60 ° C och en ugn till 42 ° C. Ta med vatten att koka i en stor bägare på en värmeplatta.
- Rengör Immunetics Miniblotter med 70% etanol.
- Alikvotera 10 ml 2xSSPE/0.1% SDS i en liten behållare. Tillsätt 20 l av varje PCR-produkt till 150 l 2xSSPE/0.1% SDS i numrerade provrör.
- Koka PCR-produkter i 10 min vid 100 ° C med hjälp av frigolit innehavare. Placera på is omedelbart i minst 5 minuter.
- Tvätta membran i resterande 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS i 60 ° C ugn i 5 minuter.
- Placera membranet i miniblotter med stöd kudde. Orientera så kanaler som löper vertikalt (vinkelrätt mot penna linje).
- Sug överflödig vätska från miniblotter kanaler.
- Tillsätt resterande 150 l 2xSSPE/0.1% SDS för första och sista kanaler. Lägg kokt PCR-produkter till övriga kanaler (2-44) i en följd, att vara noga med att undvika luftbubblor.
- Placera miniblotter lägenhet i 60 ° C ugn i 1 timme så att hybridisering ske.
- Aspirera vätska från varje kanal bort då membran från miniblotter.
- Tvätta två gånger i uppvärmd 250 ml 2xSSPE/0.5% SDS i 60 ° C ugn i 10 minuter.
- Fukta nylon separera mesh med 2xSSPE/0.5% SDS vid 42 ° C och använd den för att rulla upp membran.
- Placera rullas upp membranet i rullen rör, och rulla för att se membranet gränsar insidan. Tillsätt 3 l streptavidin-konjugat (Roche Applied Science) till 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS vid 42 ° C och lägga till rulle rör. Skruva locket på ordentligt och inkubera i rulle ugn vid 42 ° C i 60 minuter. Se till riktning kastet är sådan att membranet inte dras åt. Kontrollera regelbundet för läckor.
- Tvätta miniblotter i Pyroneg diskmedel och vatten, skölj och låt torka.
- Ta bort membran från rulle rör. Tvätta två gånger i resterande 2xSSPE/0.5% SDS vid 42 ° C i 10 minuter.
- Tvätta två gånger i 2xSSPE vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Sätt ugnen upp till 80 ° C och placera 500 ml 1% SDS i ugnen för att förvärma.
- Späd 15 ml Amersham ECL upptäckt lösning (7,5 ml av lösning A och 7,5 ml av lösning B). Kasta 2xSSPE och lägga upptäckt lösning. Rock försiktigt för hand i 2 minuter garanterar fullständig täckning av membran med lösning. Kasta kemiluminiscent lösning.
- Skär två skivor av plast öppenhet för att passa exponering kassett. Placera membran mellan två ark och placera i exponering kassett.
- Fortsätt till mörkrum. Enligt rött ljus, lägga ECL upptäckt film till patron och exponera i 5 minuter. Dog-ear nedre högra hörnet på filmen när det tagits upp så att rätt orientering när visning.
- Utveckla film med automatiserad utvecklare eller bad kemiska enligt tillverkarens anvisningar.
- Upprepad exponering med längre eller kortare exponeringstid vid behov.
3. Förnyelse av Membrane
- Tvätta membran i 250 ml 1% SDS vid 80 ° C i 30 minuter två gånger.
- Tvätta membran i 240 ml 20 mM EDTA i rumstemperatur i 15 minuter.
- Täta membran i plastpåse med 10 ml 20 mM EDTA och kyla vid 4 ° C för framtida återanvändning.
4. Representativa resultat:
Resultaten är bäst genom att placera filmen över en tryckt galler, annars scanning på bilden och importera till program som BioNumerics (tillämpad matematik, Sint-Martens-Latem, Belgien). Varje probe resultat bör tolkas med hänvisning till positiv och negativ kontroll sonder. Resultaten är bäst klassificeras som negativa, svaga eller positiv. Positiva resultat är där signalen är lika stark som eller starkare än den positiva kontrollen sonden. Negativa resultat där signalen är frånvarande eller lika med den negativa kontrollen (i fråga om bakgrunden signal). Svagt resultat där signalen är svagare än den positiva kontrollen sonden, men starkare än den negativa kontrollen. Svagt resultat kan vara resultatet av punktmutationer leder till svag sond bindande, eller på grund av icke-specifika signaler från primer dimer bildas. Med hjälp av två sonder per tavla av intresse kan förbättra specificitet, där en enda svaga resultat kan säkert tolkas som icke-specifik signal. Om tvivel kvarstår, kan en enda komplex PCR-reaktion ske med gel-baserad detektering och sekvensering av AMPlad produkt för att avgöra om resultatet verkligen är positivt. En representant Resultatet visas i figur 2.
Figur 1. MPCR / RLB principer (P1) steg 1,9. Amine modifierad prober binds kovalent till en nylon membran. (P2) Steg 2,10. Biotin modifierad PCR-produkter är hybridiseras till sonder. (P3) Steg 2,14. Streptavidin, märkt med peroxidas, inkuberas med membranet och binder till biotin. (P4) steg från 2,19 till 2,21. Peroxidas katalyserar en reaktion i ECL upptäckt reagenser, som producerar ljus som ljuskänslig film är utsatt för. Membranet är sedan tvättas för återanvändning.
Figur 2. Representant mPCR / RLB resultat. Prov 1 till 6 representerar positiva kontroller - mellan dem finns minst ett positivt sond signalen för varje av de 43 sonder. Varje målsekvens (A till E) upptäcks med två olika sonder för att maximera specificitet. Sonder A1 och A2 representerar artspecifika sonder som förväntas vara positivt för varje prov och hjälpa till med orientera filmen. Probe A1 upprepas på botten av membranet. Prover 7 och 8 är negativa kontroller. Observera att Sonder Q1, Q2, T1 och T2 har signal i de negativa kontrollerna, vilket tyder sannolikt icke-specifik bindning av primer eller primer dimer produkt. Re-design av dessa sonder eller primer skulle krävas. Sonder C1, D1 och F1 visa strimmor över membranet sannolikt på grund av vissa icke-specifik upptag av streptavidin-konjugat eller kemiluminiscent substrat, men detta är lätt skiljas från äkta positiva sond signaler. Sonder D1 och D2 har en relativt svag signal jämfört med andra sonder, kan detta bero på att större amplicons leder till mindre effektiv förstärkning. Probe J2 är negativt är flera prov (1, 3, 4, 6, 39) där sonden J1 är positiv. Det mest sannolika är en mutation i J2 bindningsstället för dessa prover.
Discussion
Den mPCR / RLB metod tillåter samtidig detektering av ett stort antal PCR amplicons. Grund av den höga känsligheten hos kemiluminiscent probe-baserad detektering kan en enda multiplex PCR-reaktionen med ett stort antal primerpar användas för att förstärka DNA-mall.
Om ingen givare signaler fås med ett eller flera prov, utföra gelelektrofores med eventuell kvarvarande PCR-produkten kan skilja på om det är problem med PCR-amplifiering eller sond hybridisering. Om alla givare signaler på membranet är svag eller obefintlig, men gelelektrofores indikerar framgångsrik PCR-amplifiering, möjligheter är problem med märkning av membranet, felaktig förnyelse av membranet efter tidigare användning, felaktig temperatur under hybridisering eller streptavidin inkubation, eller defekt streptavidin- konjugat eller detektering reagens.
Om kontrollprover visar att enskilda givare kan producera falska negativa signaler, enstaka PCR med gel-baserad detektering och efterföljande sekvensering kan utföras för att verifiera förstärkningen av PCR-produkt och att leta efter sekvensen variation vid sonden bindningsställe. Svag eller obefintlig sond signalen kan bero på att stora amplicon storlek: om möjligt alla amplicons bör vara av liknande längd och mindre än 300 bp. Sekundär DNA-strukturer amplicons kan också ge dålig sond bindande, och kan kräva re-design av primers. Individuella primer eller koncentrationer sond kan också varieras för att optimera signalstyrkan.
Falskt positiva signaler på grund av sond bindning av nonamplified grundfärg eller primer-dimer produkt kan undersökas genom att utföra samma PCR med gel-baserad detektering och efterföljande sekvensering. Om detta inträffar, omdesign av sonderna kan krävas. Punktmutationer i sond bindningsställen kan leda till svaga eller frånvarande signaler. Att låta två sonder för varje förstärkt produkt blir enkelt att upptäcka. Denna egenskap kan utnyttjas med noggrann primer och sond design för att upptäcka små sekvens variationer i mål-DNA.
Sammanfattningsvis, medan det finns många metoder för följande produkt upptäckt multiplexa PCR-reaktioner som finns har mPCR / RLB fördelen av att vara hög genomströmning och billigt med låg setup-kostnaderna. Flexibiliteten i metoden medger dess användning i ett brett spektrum av applikationer.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Matthew O'Sullivan och Fei Zhou är mottagare av Australiens nationella hälso-och medicinska forskningsrådet Postgraduate Medical Stipendier forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5’ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
| 20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
| BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm | Pall Corporation | 74480C | |
| Deionised, purified water | |||
| Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
| Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche Group | 11 089 153 001 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
| Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
| Ice | |||
| Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay. | |||
| Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
| The Belly Dancer rocking platform | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | Euro BDbo | |
| Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
| Water bath | |||
| Suction | |||
| Hot plate | |||
| Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
| X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film | ||
| Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay. | |||
References
- O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp. J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).
- Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay. Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).
- Cai, Y. Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).
- Cai, L. A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing. J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).
- O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay. J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).
- Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization. J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).
- Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay. J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).
- Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes. J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).
- Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization. J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).
- Zhou, F. Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay. J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).
- Zhou, F. Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses. J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).
- Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species. J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).
- Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens. Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).
- McKechnie, M. L. Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay. J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).
- Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).
- Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia. Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).
- Wang, Y. Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens. Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).
- Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization. Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool. Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).
