Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

PCR متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mPCR / RLB)

Published: August 6, 2011 doi: 10.3791/2781
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology, University of Sydney

Summary

وصفت وغير مكلفة ، وطريقة إنتاجية عالية للكشف في وقت واحد لمدة تصل إلى 43 أهداف الجزيئي. تطبيقات mPCR / RLB تشمل كتابة الجراثيم واكتشاف مسببات الأمراض متعددة من العينات السريرية.

Abstract

PCR المتعدد / عكس طخة تهجين مقايسة الخط يسمح للكشف عن ما يصل الى 43 اهداف في 43 عينات الجزيئي باستخدام أحد تفاعل PCR متعددة تليها التهجين دقق في غشاء النايلون ، والتي يمكن إعادة استخدامها. تحقيقات والأمينات 5 'تعديل للسماح لتثبيت الغشاء. الاشعال و5 'تعديل البيوتين الذي يسمح الكشف عن المنتجات المهجنة باستخدام PCR - streptavidin البيروكسيداز وركيزة chemiluminescent عبر الفيلم للضوء. مع الإعداد والتكاليف المنخفضة للاستهلاك ، وهذا أسلوب غير مكلف (حوالي 2 دولار أمريكي لكل عينة) ، إنتاجية عالية (يمكن معالجتها الأغشية متعددة في وقت واحد) ، وفترة زمنية قصيرة (حوالي 10 ساعة).

ويمكن استخدام هذه التقنية في عدد من الطرق. ويمكن تصميم عدة تحقيقات للكشف عن التباين تسلسل ضمن منتج واحد تضخيمها ، أو يمكن تضخيم منتجات متعددة في وقت واحد ، مع تحقيقات (أو أكثر) واحدة تستخدم للكشف عن لاحقة. ويمكن أيضا الجمع بين النهجين أن تستخدم في غضون مقايسة واحد. وتشمل القدرة على تحقيقات متعددة للتسلسل هدف واحد يجعل من الفحص محددة للغاية.

تطبيقات المنشورة mPCR / RLB تشمل الكشف عن الجينات المقاومة للمضادات الحيوية 1،2 ، كتابة من المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين 3-5 والسالمونيلا س 6 ، المصلي الجزيئي لل7،8 العقدية الرئوية ، العقدية القاطعة للدر 9 و 10،11 الفيروسات المعوية ، وتحديد س 12 من المتفطرة ، والكشف عن الأعضاء التناسلية والمسالك التنفسية 13-15 16 وغيرها من مسببات الأمراض والكشف عن 17 وتحديد mollicutes 18. ومع ذلك ، فإن براعة تقنية يعني تطبيقات غير محدودة تقريبا ، وليس مقتصرا على التحليل الجزيئي للكائنات الحية الدقيقة.

الخطوات الخمس في mPCR / RLB هي التمهيدي) وتصميم المسبار ، ب) استخراج الحمض النووي وPCR التضخيم ج) إعداد الغشاء ، د) التهجين والكشف ، وه) التجديد في الغشاء.

Protocol

ويجب النظر بعناية في التمهيدي وتصميم المسبار. وينبغي أن تستخدم جميع متواليات المتاحة من الأهداف من الاهتمام من قواعد البيانات مثل بنك الجينات لتحديد المجالات التي تحفظ أهداف مناسبة. حيث يجري تضخيم عدد كبير من الأهداف في مقايسة mPCR واحد ، وينبغي أن يكون كل تسلسل تضخيم طول مماثلة ، وينبغي ألا يتجاوز 300 أزواج قاعدة لتجنب المنافسة. تطبيق بديل من هذه الطريقة لتضخيم one يعد الهدف باستخدام بادئات ضد مناطق الحفظ واستخدام مجسات متعددة لتحديد تسلسل التباين داخل amplicon. في هذه الحالة ، قد يكون منتج PCR تضخيم لفترة أطول. وينبغي أن تكون درجات الحرارة التمهيدي الصلب جميعها متشابهة ، مع ظروف PCR تبعا لذلك. وينبغي تجنب الاشعال التي تشكل بنية قوية أو الثانوية ديمر التمهيدي. والدريتش سيغما DNA الحاسبة ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp يمكن استخدامها) للتنبؤ موثوق بها هذه الميزات.

وينبغي تصميم الحمض النووي لتحقيقات من الصلب درجات الحرارة قريبة من 60 درجة مئوية. لتحقيق أقصى قدر من التحديد ، يمكن إدراج تحقيقين لكل هدف من الاهتمام في فحص واحد التهجين الحمض النووي حبلا إلى الأمام المجاورة لموقع التمهيدي عكس ملزمة ، والآخر إلى عكس حبلا المجاورة لموقع التمهيدي قدما ملزمة. في هذه الحالة ، يجب على كلا الاشعال إلى الأمام وعكس البيوتين يكون وراثيا. إذا كان يتم استخدام واحد فقط في تحقيق هدف تضخم ، في حاجة واحدة فقط ثم يتم التمهيدي البيوتين تعديلها.

عند تصميم أجهزة الاشعال وتحقيقات للمقايسة mPCR / RLB ينصح بشدة لاستخدامها في أساليب التنبؤ السيليكو المنتجات PCR والتهجين لتحقيق ترتبط في نتائج المختبر. مثالي يتم ذلك باستخدام العزلات التي تسلسل الجينوم هو متاح. ويمكن استخدام برامج مثل FastPCR (متوفر في http://primerdigital.com/fastpcr.html) لهذا الغرض. ويمكن توقع ضعف أو غياب إشارة التحقيق فيها في التحليل يشير إلى عدم التطابق السيليكو الزوج قاعدة الناتجة في درجات الحرارة المنخفضة التحقيق الصلب.

وسوف تقنيات استخراج الحمض النووي تختلف تبعا لعينات يجري اختبارها ، وظروف PCR سيعتمد على التصميم التمهيدي. ويشار إلى القراء المنشورات المتعلقة المقايسات الفردية لمزيد من المعلومات حول استخراج الحمض النووي والكواشف PCR والشروط 1-19.

يتم تشغيل كل مقايسة مع الضوابط المناسبة لتوفير ما لا يقل أحدهما إيجابي والآخر سلبي التحقيق إشارة لكل المسبار على الغشاء ، فضلا عن الحمض النووي خالية من السيطرة عليها. وعلاوة على ذلك فإنه من المفيد أن تشمل التحقيق في الجزء العلوي من الغشاء الذي من المتوقع أن تكون إيجابية بالنسبة لجميع العينات (على سبيل المثال : نوع أو جنس معين التحقيق في حالة وجود الكائنات الدقيقة). هذا بمثابة مسبار مراقبة إيجابية ، ولكن أيضا من السهل على تصاريح التوجه للنتائج.

1. إعداد الأغشية

  1. إعداد الحلول التالية :
    • 100ML NaHCO3 0.5M (الرقم الهيدروجيني 8.4)
    • 100 مل NaHCO 0.5M 3
    • 20 مل EDAC 16 ٪
    • 250 مل هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M
    • 250 مل 2xSSPE
    • 250 مل SDS 2xSSPE/0.1 ٪ -- في مكان بالحمام المائي عند 60 درجة مئوية
    • 250 مل 20 ملي EDTA.
  2. قبل حرارة الفرن الى 60 درجة مئوية.
  3. تنظيف Miniblotter Immunetics مع الايثانول 70 ٪.
  4. تمييع التحقيقات في قليل النوكليوتيد NaHCO M 0.5 3 إلى تركيز النهائي من 2 بمول / ميكرولتر وبلغ حجم التداول 200 ميكرولتر.
  5. قطع غشاء النايلون BiodyneC 15x15 سم ل. باستخدام القلم والمسطرة ، وحكم الخروج على مسافة 0.5 سم في أعلى الغشاء والكتابة التفاصيل هنا.
  6. غشاء الختم في كيس من البلاستيك مع 20 مل الطازجة 16 ٪ حل EDAC والصخور على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  7. يغسل الغشاء deionised في الماء لمدة 30 ثانية.
  8. الغشاء في مكان miniblotter مع قنوات يمر عبر الغشاء (خط مواز لقلم رصاص). وضعت وسادة الدعم في مكان ونشافة وثيق. نضح السوائل من القنوات.
  9. سد الممرات 1 و 45 مع 150 ميكرولتر 0.5 م 3 NaHCO. استخدام 150 ميكرولتر من كل حل التحقيق لملء الممرات 2-44 في التسلسل ، والحرص على تجنب فقاعات الهواء. إذا كان لا تظهر فقاعة الهواء في القناة ، والحفاظ على ماصة في مكان ، نضح الحل سريعا للسماح للفقاعة الهواء لتطفو إلى أعلى ماصة ، ثم إعادة المحاولة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  10. نضح حلول التحقيق ، وإزالة الغشاء ، ويغسل في 250 مل من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M في درجة حرارة الغرفة لمدة 9 دقائق.
  11. يغسل الغشاء في 2xSSPE 250 مل لمدة 30 ثانية.
  12. يغسل الغشاء في 250 SDS قبل تحسنت مل 2xSSPE/0.1 ٪ في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  13. إذا لم يتم استخدامها لتهجين على الفور ، ويغسل الغشاء في 240 مل EDTA 20 ملي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة (المتحفظة 10ML المتبقية) ، ثم ختم الغشاء في كيس من البلاستيك مع المتبقية 10 مل EDTA 20 ملي وستوره في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
  14. غسل miniblotter مع Pyroneg المنظفات والفرشاة. شطف والسماح ليجف.

2. التهجين وكشفها

  1. إعداد الحلول التالية :
    • 250 مل SDS 2xSSPE/0.1 ٪ -- تخزين المياه في الحمام عند 60 درجة مئوية.
    • 500 مل SDS 2xSSPE/0.5 ٪ -- تخزين المياه في الحمام عند 60 درجة مئوية
    • 500 مل SDS 2xSSPE/0.5 ٪ -- مخزن في الفرن على درجة حرارة 42 درجة مئوية
    • 500 مل 2xSSPE -- إبقاء على درجة حرارة الغرفة
    • SDS 500 مل 1 ٪ -- تخزين المياه في الحمام على 60 درجة مئوية في البداية (على الخطوة 3)
    • 250 مل 20 ملي EDTA -- تخزين في درجة حرارة الغرفة (على الخطوة 3).
  2. بدوره على واحد في الفرن 60 درجة مئوية وفرن واحد إلى 42 درجة مئوية. جلب الماء لغلي في دورق كبير على موقد.
  3. Immunetics نظيفة Miniblotter مع الايثانول 70 ٪.
  4. قسامة 10 مل من SDS 2xSSPE/0.1 ٪ في وعاء صغير. إضافة 20 ميكرولتر كل منتج PCR لSDS 150 ميكرولتر 2xSSPE/0.1 ٪ في أنابيب مرقمة.
  5. تغلي المنتجات PCR لمدة 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية باستخدام أصحاب الستايروفوم. مكان على الجليد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق.
  6. يغسل الغشاء المتبقية في 240 مل SDS 2xSSPE/0.1 ٪ في 60 درجة مئوية الفرن لمدة 5 دقائق.
  7. الغشاء في مكان miniblotter مع وسادة دعم. قنوات توجيه ذلك تشغيل عموديا (عموديا على خط قلم رصاص).
  8. شفط السوائل الزائدة من القنوات miniblotter.
  9. إضافة 150 ميكرولتر المتبقية SDS 2xSSPE/0.1 ٪ إلى القنوات الأولى والأخيرة. إضافة المغلي PCR المنتجات إلى قنوات المتبقية (2-44) في التسلسل ، والحرص على تجنب فقاعات الهواء.
  10. miniblotter مكان مسطح 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 1 ساعة للسماح التهجين لتأخذ مكان.
  11. السائل نضح من كل قناة ثم إزالة غشاء من miniblotter.
  12. تغسل مرتين في prewarmed SDS 250 مل 2xSSPE/0.5 ٪ في 60 فرن درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  13. بلل شبكة النايلون فصل مع SDS 2xSSPE/0.5 ٪ في 42 درجة مئوية ، واستخدامه لنشمر عن الغشاء.
  14. توالت مكان حتى في الغشاء أنبوب أسطواني ، ونشر راية لضمان غشاء يتاخم السطح الداخلي. إضافة 3 - ميكرولتر streptavidin البيروكسيداز المتقارن (روش العلوم التطبيقية) إلى 15 مل SDS 2xSSPE/0.5 ٪ عند 42 درجة مئوية وإضافة إلى أنبوب أسطواني. المسمار على الغطاء بإحكام واحتضان الدوارة في الفرن حوالي 42 دقيقة لمدة 60 درجة مئوية. ضمان اتجاه لفة من هذا القبيل أن الغشاء لا تشديد. فحص دوري للكشف عن التسربات.
  15. غسل miniblotter في Pyroneg المنظفات والماء ، وشطف والسماح ليجف.
  16. إزالة غشاء من أنبوب أسطواني. تغسل مرتين في 2xSSPE/0.5 ٪ المتبقية SDS في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  17. تغسل مرتين في 2xSSPE في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  18. بدوره فرن تصل إلى 80 درجة مئوية ومكان 500ml SDS 1 ٪ في الفرن لتدفئة المسبق.
  19. يشكلون 15 مل الكشف ECL أمرشام حل (7.5 مل من محلول A و 7.5 مل من محلول B). تجاهل 2xSSPE وإضافة محلول الكشف. صخرة بلطف باليد لمدة 2 دقيقة ضمان تغطية كاملة للغشاء مع الحل. تجاهل حل chemiluminescent.
  20. قطع لوحين من البلاستيك الشفافية لاحتواء خرطوشة التعرض. غشاء مكان بين أوراق اثنين والمكان الى خرطوشة التعرض.
  21. انتقل إلى غرفة مظلمة. تحت الضوء الأحمر ، إضافة إلى الكشف عن فيلم ECL خرطوشة وفضح لمدة 5 دقائق. الكلب الأذن الزاوية اليمنى السفلى من الفيلم على إزالة للسماح للاتجاه الصحيح عند المشاهدة.
  22. وضع الفيلم مع المطور الآلي أو الحمامات الكيميائية وتوجيهات المصنع في ل.
  23. تكرار التعرض مع أوقات التعرض أطول أو أقصر إذا لزم الأمر.

3. تجديد الأغشية

  1. يغسل الغشاء في SDS 250 مل من 1 ٪ الى 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مرتين.
  2. يغسل الغشاء في 240 مل EDTA 20 ملي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. غشاء الختم في كيس من البلاستيك مع 10 مل EDTA 20 ملي وبردت في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها في المستقبل.

4. ممثل النتائج :

وينظر إلى أفضل النتائج من خلال وضع الفيلم على شبكة المطبوعة ، أو مسح آخر للصورة والمستوردة في صناعة البرمجيات مثل BioNumerics (الرياضيات التطبيقية ، سينت مارتنز - Latem ، بلجيكا). ينبغي أن تفسر كل نتيجة التحقيق مع الإشارة إلى تحقيقات السيطرة الإيجابية والسلبية. تصنف أفضل النتائج على النحو السلبي ، وضعف أو إيجابية. نتائج ايجابية وفيها إشارة قوية مثل أو أقوى من تحقيق السيطرة إيجابية. النتائج السلبية حيث إشارة غائبة أو مساوية لسيطرة سالبة (في حالة إشارة الخلفية). النتائج الضعيفة حيث تكون الإشارة أكثر خفوتا من التحقيق مراقبة إيجابية ، ولكن أقوى من سيطرة سلبية. النتائج الضعيفة قد يكون نتيجة لطفرات تؤدي إلى نقطة الربط التحقيق ضعيفة ، أو بسبب إشارات غير محددة من تشكيل ديمر التمهيدي. ويمكن استخدام تحقيقين في مصلحة الهدف من تحسين النوعية ، حيث يمكن بأمان نتيجة واحدة أن تفسر على أنها ضعيفة غير محددة الإشارة. إذا يبقى أي شك ، ويمكن إجراء تفاعل PCR المفرد نوع plex مع الجل القائم على الكشف وتتابع أي أمبيرlified المنتج لتحديد ما إذا كانت النتيجة إيجابية حقا. ويرد نتيجة ممثل في الشكل 2.

الشكل 1
الشكل 1. المبادئ mPCR / RLB (P1) الخطوة 1.9. لا بد أمين تحقيقات تعديل تساهميا لغشاء النايلون. (P2) الخطوة 2.10. يتم تعديل المنتجات المهجنة البيوتين PCR للتحقيقات. (P3) الخطوة 2.14. وحضنت Streptavidin ، المسمى مع البيروكسيداز ، مع الغشاء ويربط البيوتين. (P4) الخطوات 2،19-2،21. البيروكسيداز يحفز رد الفعل في الكواشف ECL ، المنتجة للفيلم الذي ظل يتعرض الحساسة للضوء. ثم يغسل الغشاء لإعادة استخدامها.

الشكل 2
الشكل 2. الممثل mPCR / RLB النتيجة. عينات من 1 إلى 6 تمثل الضوابط الإيجابية -- بينهما هناك واحد على الأقل إشارة إيجابية لتحقيق كل من التحقيقات 43. تم الكشف عن كل تسلسل الهدف (A خلال U) مع اثنين من تحقيقات مختلفة لتحقيق أقصى قدر من الخصوصية. تحقيقات A1 ​​و A2 تمثل أنواعا معينة من الحيوانات تحقيقات التي من المتوقع أن تكون إيجابية بالنسبة لكل عينة والمساعدة في توجيه الفيلم. ويتكرر التحقيق A1 في الجزء السفلي من الغشاء. 7 و 8 عينات ضوابط السلبية. علما بأن مجسات Q1 ، Q2 ، T1 و T2 يكون إشارة سلبية في الضوابط ، مشيرا ملزم غير محدد من المرجح الاشعال أو التمهيدي المنتج ديمر. ستكون هناك حاجة لإعادة تصميم هذه التحقيقات أو الاشعال. تحقيقات C1 ، D1 ، وتظهر F1 streaking عبر الغشاء على الأرجح بسبب امتصاص بعض المنظمات غير محددة من المتقارن streptavidin - البيروكسيداز أو الركيزة chemiluminescent ، ومع ذلك يتميز بسهولة هذا صحيح من الإشارات الإيجابية التحقيق. تحقيقات D1 و D2 وإشارة ضعيفة نسبيا مقارنة مع تحقيقات أخرى ، وهذا قد يكون راجعا إلى أكبر مما يؤدي إلى تضخيم amplicons أقل كفاءة. المسبار J2 أمر سلبي عدة عينات (1 ، 3 ، 4 ، 6 ، 39) حيث التحقيق J1 إيجابي. هذا على الأرجح يمثل طفرة في موقع الربط J2 لهذه العينات.

Discussion

الأسلوب mPCR / RLB تصاريح الكشف المتزامن لعدد كبير من amplicons PCR. نظرا لحساسية عالية للكشف التحقيق المستندة chemiluminescent ، يمكن استخدام واحد تفاعل PCR متعددة مع عدد كبير من أزواج التمهيدي لتضخيم قالب الحمض النووي.

ويمكن الحصول عليها إذا لم إشارات التحقيق مع واحد أو أكثر من العينات ، وأداء الكهربائي للهلام مع أي منتج PCR المتبقية مساعدة على تمييز ما إذا كانت المشكلة هي مع التضخيم PCR أو التهجين التحقيق. حيث كل إشارات التحقيق على الغشاء ضعيفة أو غائبة ، لكنها تشير إلى نجاح هلام إستشراد PCR التضخيم ، وتشمل الاحتمالات مشاكل مع وسم الغشاء ، والتجديد غير صحيح من الغشاء بعد الاستخدام السابقة ، ودرجات حرارة غير صحيحة أثناء حضانة التهجين أو streptavidin ، أو معيبة ، streptavidin المتقارن البيروكسيداز أو كاشف الكشف.

إذا تبين أن عينات مراقبة تحقيقات الفردية قد يكون منتجا لا يمكن أن يؤديها إشارات سلبية كاذبة ، واحد مع PCR جل المستندة إلى الكشف عن وتسلسلها لاحقة للتحقق من التضخيم من الناتج PCR والبحث عن الاختلاف في موقع تسلسل التحقيق ملزم. قد ضعف أو غياب إشارة التحقيق يكون راجعا إلى حجم كبير amplicon : إذا كان ذلك ممكنا ينبغي أن تكون جميع amplicons طول مماثلة وغليان أقل من 300. قد هياكل الحمض النووي الثانوي amplicons تنتج أيضا الفقراء ملزمة التحقيق ، وربما يستلزم إعادة تصميم أجهزة الاشعال. ويمكن أيضا التمهيدي الفردية أو تركيزات التحقيق تكون متنوعة لتحسين قوة الإشارة.

ويمكن التحقيق إشارات إيجابية كاذبة بسبب التحقيق ملزم الاشعال nonamplified أو منتج التمهيدي - PCR ديمر عن طريق أداء واحد مع الجل القائم على الكشف وتسلسلها لاحقة. إذا حدث هذا ، إعادة تصميم تحقيقات قد يلزم. قد الطفرات نقطة في مواقع التحقيق ملزم يؤدي إلى إشارات ضعيفة أو غائبة. السماح تحقيقين لكل منتج تضخيم هذا يجعل من السهل اكتشافها. ويمكن استغلال هذه الخاصية مع الحذر والتصميم التمهيدي التحقيق للكشف عن تغيرات في الحمض النووي تسلسل الصغيرة المستهدفة.

باختصار ، في حين أن هناك العديد من الأساليب للكشف عن المنتجات التالية متعددة تفاعلات PCR المتاحة ، mPCR / RLB لديها ميزة كونها عالية الإنتاجية وغير مكلفة مع انخفاض تكاليف الإعداد. المرونة في طريقة تسمح باستخدامه في لطائفة واسعة من التطبيقات.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ماثيو اوسوليفان وتشو فاي يتلقون الوطنية للصحة والبحوث الطبية الاسترالية مجلس البحوث الطبية منح الدراسات العليا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5’ amine C6 modified oligonucleotide probes Sigma-Aldrich
NaHCO3 Sigma-Aldrich S-8875 0.5 M solution made up to pH 8.4
NaOH Sigma-Aldrich S5881 0.1M solution
20xSSPE buffer Amresco 0810-4L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L-4390 Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884 Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) Sigma-Aldrich E7750 Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm Pall Corporation 74480C
Deionised, purified water
Liquid Pyroneg detergent Johnson Diversey HH12291
Streptavidin-peroxidase conjugate Roche Group 11 089 153 001
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
OHP Transparency film Corporate Express EXP 504 OHP
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm GE Healthcare 28906837
Ice
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh Thermo Fisher Scientific, Inc. HBSNSRS220 Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use
The Belly Dancer rocking platform Stovall Life Sciences, IBI Sciences Euro BDbo
Miniblotter Immunetics MN100-45
Water bath
Suction
Hot plate
Exposure cartridge Sigma-Aldrich Z36,009-0
X-ray film developer Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp. J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).
  2. Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay. Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).
  3. Cai, Y. Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).
  4. Cai, L. A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing. J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).
  5. O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay. J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).
  6. Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization. J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).
  7. Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay. J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).
  8. Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes. J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).
  9. Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization. J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).
  10. Zhou, F. Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay. J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).
  11. Zhou, F. Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses. J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).
  12. Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species. J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).
  13. Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens. Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).
  14. McKechnie, M. L. Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay. J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).
  15. Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).
  16. Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia. Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).
  17. Wang, Y. Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens. Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).
  18. Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization. Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).
  19. Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool. Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).

Tags

علم الأحياء الجزيئية ، العدد 54 ، الكتابة ، هذه الجرثومة ، macroarray ، الجزيئية الوبائية
PCR متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mPCR / RLB)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, M. V. N., Zhou, F.,… More

O'Sullivan, M. V. N., Zhou, F., Sintchenko, V., Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB). J. Vis. Exp. (54), e2781, doi:10.3791/2781 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter