Summary
43 분자 타겟까지 동시 검출을위한 저렴, 높은 처리량 방법을 설명합니다. mPCR / RLB의 응용은 미생물 입력 및 임상 샘플에서 여러 병원균의 감지를 포함합니다.
Abstract
멀티 플렉스 PCR / 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석을 다시 사용할 수있는 나일론 막에 프로브 하이브 리다이 제이션 다음 한 멀티 플렉스 PCR 반응을 사용하여 43 샘플 43 분자 타겟까지 검색하실 수 있습니다. 프로브는 세포막에 고정을 허용하도록 수정 5 '아민 있습니다. Primers은 streptavidin - 퍼옥시데이즈 및 감광성의 영화를 통해 chemiluminescent 기판을 사용하여 hybridized PCR 제품의 검출을 허용 5 '비오틴 수정됩니다. 낮은 설치 및 소모품 비용이 기술은 저렴 (약 미국 2달러 샘플 당), 높은 처리량 (여러 세포막을 동시에 처리할 수)과 짧은 처리 시간 (약 10 시간)입니다.
기술은 여러 가지 방법으로 활용하실 수 있습니다. 여러 프로브는 단일 증폭 제품 내에 순서 변화를 감지하기위한 수 또는 여러 개의 제품은 후속 검색에 사용 하나 (혹은 이상) 프로브로 동시에 증폭하실 수 있습니다. 두 방법의 조합은 하나의 분석 시간에도 사용할 수 있습니다. 단일 대상 시퀀스에 대해 여러 프로브를 포함하는 능력은 분석은 매우 구체적인 수 있습니다.
mPCR / RLB의 게시 응용 프로그램 methicillin - 내성 포도상 구균 3-5과 살모넬라균 SP 6, 연쇄상 구균 pneumoniae 7,8, 연쇄상 구균 agalactiae 9 enteroviruses 10,11, 신분의 분자 serotyping의 타이핑, 항생제 저항 유전자의 1,2의 탐지를 포함 Mycobacterium SP 12, 생식기 및 호흡기 13-15 16 기타 17 병원체 및 감지 및 mollicutes 18 신분의 감지. 그러나, 기술의 융통성은 응용 프로그램이 거의 무한하고 미생물의 분자 분석에 국한되지 않습니다 것을 의미합니다.
mPCR / RLB에서 5 단계) 프리머 및 프로브 디자인, B) DNA 추출 및 PCR 증폭 C) 막의 작성, D) 하이브 리다이 제이션 및 감지되며, 분리막의 E) 리제.
Protocol
신중한 검토가 프라이머 및 프로브 디자인에 부여해야합니다. 같은 GenBank와 같은 데이터베이스에서 관심의 대상의 가능한 모든 시퀀스는 적합한 목표물 보존 영역을 식별하는 데 활용해야합니다. 목표의 많은 수의 단일 mPCR 분석에 증폭되고 어디에, 각 증폭 시퀀스와 비슷한 길이 있어야하고, 경쟁을 피하기 위해 300 기본 쌍을 초과해서는 안됩니다. 방법의 대안 응용 프로그램은 보존 지역에 대한 primers를 사용하여 하나 이상 목표를 증폭하고 amplicon 내에서 순서 변화를 식별하는 여러 개의 프로브를 사용하는 것입니다. 이 인스턴스에서 증폭된 PCR 제품은 더 이상있을 수 있습니다. 프라이머 어닐링 온도는 적절하게 조정 PCR 조건과 비슷한해야합니다. 강력한 보조 구조 또는 프라이머의 이합체 형성 Primers은 피해야한다. 시그마 알드리치 DNA 계산기 ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp는 ) 안정적으로 이러한 기능을 예측하는 데 사용할 수 있습니다.
DNA 프로브은 60에 가까운 온도 ° C.를 어닐링되도록 설계되어야 특이성을 극대화하기 위해, 관심있는 각 대상의 두 가지 프로브는 분석, 반대 뇌관 바인딩 사이트에 인접한 앞으로의 DNA 가닥을 hybridizing 하나 그리고 앞으로 뇌관 바인딩 사이트에 인접한 반대 스트랜드에 다른 포함될 수 있습니다. 이 경우에 모두 순방향 및 역방향 primers은 비오틴 - 수정해야합니다. 증폭 대상마다 하나의 프로브가 사용되는 경우, 하나의 뇌관이 비오틴은 변경될 수 필요합니다.
primers 및 mPCR / RLB 분석을위한 프로브를 디자인할 때 그것은 강력하게 체외 결과와 연관시키는 것은 PCR 제품 및 프로브 하이브 리다이 제이션을 예측하는 silico 방법에 사용하는 것이 좋습니다. 이상적으로 이것은 전체 게놈 시퀀스를 사용할 수있는 격리를 사용하여 수행됩니다. 이러한 FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html보실 수 있습니다)와 같은 소프트웨어는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. silico 분석에 낮은 온도 프로브 어닐링의 결과로 기본 쌍의 불일치를 나타냅니다 약하거나 부재 프로브 신호가 예측할 수 있습니다.
DNA 추출 기술은 테스트중인 샘플에 따라 달라질 수 및 PCR 조건은 프라이머 설계에 의존합니다. 독자들은 DNA 추출 및 PCR 시약의 조건 1-19에 대한 자세한 내용은 개별 assays에 간행물라고합니다.
각각의 분석은 적어도 한 멤브레인 각 프로브에 대한 긍정적인 하나의 부정적인 프로브 신호뿐만 아니라 DNA없는 제어를 제공하기 위해 적절한 컨트롤로 실행됩니다. 또한 그것은 모든 샘플 (미생물의 경우에는 동물 또는 속 특정 프로브 등)에 대한 긍정적인 것으로 예상되는 멤브레인 상단의 프로브를 포함하는 유용합니다. 이것은 긍정적인 제어 프로브 역할뿐만 아니라, 결과를 쉽게 방향을 수 있습니다.
1. 분리막의 준비
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 100ml 0.5M NaHCO3 (산도 8.4)
- 100 ML 0.5M NaHCO 3
- 20 ML 16 % EDAC
- 250 ML 0.1 M NaOH
- 250 ML 2xSSPE
- 250 ML 2xSSPE/0.1 % SDS - 60 ° C에서 waterbath에서 개최
- 250 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산).
- 60 ° C. 미리 가열 오븐
- 70 % 에탄올로 Immunetics의 Miniblotter를 청소합니다.
- 2 pmol / μl의 최종 농도와 200 μl의 볼륨에 0.5 M NaHCO 3의 oligonucleotide 프로브를 희석.
- 15x15 cm에 BiodyneC 나일론 막 컷. 연필과 통치자를 사용하여 막의 맨 위에 0.5 cm 공간을 지배하고 여기에 세부 사항을 작성합니다.
- 20 ML과 비닐 봉투에 밀봉 막 갓 10 분 실온에서 16 % EDAC 솔루션과 바위했다.
- 30 초 동안 deionised 물에 막 씻으십시오.
- 멤브레인 (연필 라인에 평행)에 걸쳐 실행 채널 miniblotter에 넣어 막. 장소와 가까운 블로터에서 지원 쿠션을 넣어. 채널에서 유체 대기음.
- 150 μl 0.5 M NaHCO 3 차선 1 45 채웁니다. 공기 방울을 피하기 위해주의되는, 차선 순서에 2-44을 채우기 위해 각 프로브 솔루션 150 μl를 사용하십시오. 공기 방울이 자리에 피펫을 유지, 채널에 나타나지 않는 경우, 신속하게 공기 방울은 피펫의 상단에 부동 수 있도록 솔루션을 대기음 후 다시 시도하십시오. 5 분 실온에서 알을 품다.
- 프로브 솔루션을 기음, 멤브레인을 제거하고 구분을 위해 상온에서 250 ML 0.1 M NaOH로 씻으십시오.
- 30 초 동안 250 ML 2xSSPE에서 막 씻으십시오.
- 60 오븐에 250 ML 미리 예열 2xSSPE/0.1 % SDS에서 막 씻으 ° C 5 분.
- 즉시 하이브 리다이 제이션을 위해 사용하지 않는 경우, 20 분 (나머지 10ml를 예약)에 상온에서 240 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 막을 세척 후, 나머지 10 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 스터와 비닐 봉투에 막을 인감4 냉장고에 E ° C.
- 세제와 브러쉬 Pyroneg와 miniblotter 씻으십시오. 린스 건조 수 있습니다.
2. 하이브 리다이 제이션 및 감지
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 250 ML 2xSSPE/0.1 % SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C.
- 500 ML 2xSSPE/0.5 % SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C
- 500 ML 2xSSPE/0.5 % SDS - 42에서 오븐에 저장 ° C
- 500 ML 2xSSPE - 실온에서 보관
- 500 ML 1퍼센트 SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C 초기 (3 단계)
- 250 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 상온에서 저장 (3 단계).
- 60 한 오븐 켜고 ° C 한 오븐 42 ° C. 열판에 큰 비커에 넣어 익히지 물을 가져와.
- 70 % 에탄올로 Miniblotter 클린 Immunetics.
- 작은 용기에 2xSSPE/0.1 % SDS의 나누어지는 10 ML. 번호 튜브 150 μl 2xSSPE/0.1 % SDS 각 PCR 제품의 20 μl를 추가합니다.
- 100 10 분에 대한 PCR 제품을 삶아 ° C 스티로폼 홀더를 사용하여. 적어도 5 분 즉시 얼음에 놓습니다.
- 60 240 ML 2xSSPE/0.1 % SDS를 나머지에 막 씻으 5 분 ° C 오븐.
- 배경 쿠션과 miniblotter에 넣어 막. 동쪽을 향하게하므로 채널 (수직 연필 선)를 수직으로 실행합니다.
- miniblotter 채널에서 흡입 초과 액체.
- 처음이자 마지막 채널 남은 150 μl 2xSSPE/0.1 % SDS를 추가합니다. 공기 방울을 피하기 위해주의하고, 시퀀스에 남아 채널 (2-44)에 삶은 PCR 제품을 추가합니다.
- 60 평면 플레이스 miniblotter 하이브리드화가 이루어지는 수 있도록 1 시간 ° C 오븐.
- 각 채널에서 대기음 액체 다음 miniblotter에서 막을 제거합니다.
- 10 분 60 ° C의 오븐에 prewarmed 250 ML 2xSSPE/0.5 % SDS 두 번 씻으십시오.
- 42 2xSSPE/0.5 % SDS와 나일론 메쉬 분리를 축축하게하다 ° C와 멤브레인을 올리고 그것을 사용합니다.
- 장소는 롤러 튜브로 막을 올리고, 그리고 멤브레인은 내부 표면을 맞닿아 있죠 있도록 펴다. 42 15 ML 2xSSPE/0.5 % SDS 3 μl streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 (로체 응용 과학)를 추가 ° C와 롤러 튜브에 추가합니다. 단단히에서 뚜껑을 비할 42 롤러 오븐에 품어 ° C를 60 분. 롤 방향 멤브레인가 강화하지 않는 등한지 확인하십시오. 누출 주기적으로 확인합니다.
- 세제와 물을 Pyroneg에 miniblotter 씻으십시오, 린스와 건조 수 있습니다.
- 롤러 튜브에서 막을 제거합니다. 42 2xSSPE/0.5 % SDS를 남은 ° C를 10 분 동안 두 번 씻으십시오.
- 5 분 상온에서 두 번 2xSSPE에 씻으십시오.
- 80까지 오븐 미리 따뜻하게 ° C 및 장소 500ml 1% SDS 오븐 인치 턴
- 15 ML 아머샴 ECL 탐지 솔루션 (솔루션의 7.5 ML를 및 솔루션 B의 7.5 ML)까지합니다. 2xSSPE 및 검색 솔루션을 추가 폐기하십시오. 솔루션을 막의 완전한 범위를 보장 2 분 동안 손으로 부드럽게 록. chemiluminescent 솔루션을 폐기하십시오.
- 노출 카트리지에 맞게 플라스틱 투명 두 시트를 자르고. 두 시트 및 노출 카트리지에 장소 사이 막.
- 암실로 진행합니다. 빨간 불빛 아래 카트리지에 ECL 검출 필름을 추가하고 5 분 노출. 볼 때 올바른 방향을 수 있도록 제거시 필름의 강아지 귀 오른쪽 아래 모퉁이.
- 마다 제조 업체의 지시로 자동 개발자 또는 화학 욕조와 필름을 개발.
- 필요한 경우 길거나 짧게 노출 시간과 노출을 반복합니다.
3. 분리막의 재생
- ° C 30 분 동안 두 번 80 250 ML 1% SDS에서 막 씻으십시오.
- 15 분 동안 상온에서 240 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 막 씻으십시오.
- 시일 10 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 비닐 봉지에 막과 ° C 향후 다시 사용할 수 있도록 4 냉장.
4. 대표 결과 :
결과는 최고의 인쇄된 격자를 통해 영화를 배치하거나, 다른 이미지를 스캔과 같은 BioNumerics (응용 수학, 신트 - 마틴스 - Latem, 벨기에)와 같은 소프트웨어로 가져와서 볼 수 있습니다. 각 프로브 결과는 긍정적이고 부정적인 제어 프로브 참조로 해석해야합니다. 결과는 최고 부정적 약하거나 긍정적으로 등급입니다. 신호가처럼 강한하거나 긍정적인 제어 프로브보다 강한 어디에 긍정적인 결과입니다. 신호가 없거나 부정적인 제어 (배경 신호의 경우)에 동일한 어디에 부정적인 결과입니다. 약한 결과는 신호가 긍정적인 제어 프로브보다 약해요하지만, 대조군보다 강한 어디에 있습니다. 약한 결과는 약한 프로브 구속력이나 뇌관의 이합체 형성 이외의 특정 신호로 인해 이어지는 점 돌연변이의 결과 수 있습니다. 관심 대상마다이 프로브를 사용하면 하나의 약한 결과가 안전하지 않은 특정 신호로 해석될 수있는 특이성을 향상시킬 수 있습니다. 의심이 남아있을 경우, 단일 플렉스 PCR 반응은 어떤 A의 젤 기반 감지 및 시퀀싱과 함께 수행할 수결과가 정말 긍정적인 있는지 확인하기 위해 제품을 lified. 대표 결과는 그림 2에 표시됩니다.
그림 1. mPCR / RLB 원칙 (P1)은 1.9 단계. 아민 수정 프로브는 나일론 막에 covalently 바운드 있습니다. (P2) 단계 2.10. 비오틴 수정 PCR 제품은 프로브에 hybridized입니다. (P3) 단계 2.14. 퍼옥시데이즈으로 표시 Streptavidin은, 멤브레인와 incubated과 비오틴에 바인딩됩니다. (P4) 2.19-2.21 단계를 반복합니다. 퍼옥시데이즈는 빛이있는 조명 민감한 필름을 노출하기 위해 생산, ECL 검색 시약의 반응을 catalyses. 막 그런 다음 다시 사용하는 세탁 수 있습니다.
그림 2. 대표 mPCR / RLB 결과. 1-6 샘플 1 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다 - 그들 사이의 43 프로브 각각에 대해 적어도 하나의 긍정적인 프로브 신호가 있습니다. 각 대상 시퀀스 (U를 통해 A) 특이성을 최대화하기 위해 두 가지 프로브와 함께 발견됩니다. 프로브 A1과 A2는 각 샘플에 대해 긍정하고 필름을 orienting 도와 것으로 예상되는 종의 특정 프로브를 나타냅니다. 프로브 A1은 막의 하단에 반복됩니다. 샘플 7 8 부정적인 컨트롤입니다. 프로브 Q1이 Q2, T1과 T2가 primers 또는 뇌관 이합체의 제품의 가능성이 특이 현상이 바인딩을 나타내는 부정적인 컨트롤에 신호를 가지고 있습니다. 이러한 프로브 또는 primers의 다시 설계해야 할 것입니다. 프로브 C1, D1과 streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 또는 chemiluminescent 기판의 일부가 아닌 구체적인 이해로 인해 가능성 멤브레인 전체 줄이 F1 쇼, 그러나 이것은 쉽게 진정한 긍정적인 프로브 신호를 구분할 수 있습니다. 프로브 D1과 D2는 다른 프로브에 비해 상대적으로 약한 신호를 가지고이 덜 효율적으로 증폭에 이르는 큰 amplicons 때문일 수 있습니다. 프로브 J2는 부정적인 것은 프로브 J1가 좋은 몇 가지 샘플 (1, 3, 4, 6, 39)입니다. 이것은 대부분이 샘플에 대한 J2 바인딩 사이트에서 돌연변을 나타냅니다.
Discussion
mPCR / RLB 방법은 PCR의 amplicons 다수의 동시 감지를 허용합니다. 때문에 chemiluminescent 프로브 기반 탐지의 높은 감도의 프라이머 쌍 다수와 함께 하나의 멀티 플렉스 PCR 반응은 DNA 템플릿을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다.
더 프로브 신호가 남아있는 PCR 제품과 겔 전기 영동을 수행하는 하나 이상의 샘플과 취득이 없으면 문제가 PCR의 증폭이나 프로브 하이브 리다이 제이션과 함께인지 여부를 구별할 수 있습니다. 멤브레인 모든 프로브 신호가 약하거나 부재하지만, 겔 전기 영동이 성공적으로 PCR 증폭을 나타냅니다 어디에, 가능성은 멤브레인의 상표 문제, 이전에 사용 후 막의 잘못된 재생, 하이브리드화 또는 streptavidin 부화하는 동안 잘못된 온도, 또는 결함이 포함 streptavidin을 퍼옥시데이즈의 공액 또는 검출 시약.
컨트롤 샘플 개별 프로브가 거짓 부정적인 신호, 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR은 PCR 제품의 증폭을 확인하고 프로브 바인딩 사이트에서 순서 변화를 찾는 수행할 수 있습니다 생산있을 수 나타내는 경우. 약하거나 부재 프로브 신호는 대형 amplicon 크기 때문일 수 있습니다 : 가능하면 모든 amplicons 비슷한 길이 미만 300 BP의해야합니다. amplicons의 보조 DNA 구조는 또한 가난한 프로브 바인딩을 생산 수 있으며, primers의 다시 디자인을 할거 수 있습니다. 개인 프라이머 또는 프로브 농도는 신호의 강도를 최적화하기 위해 다양한 수 있습니다.
nonamplified primers 또는 뇌관 이합체 - 제품의 바인딩 프로브에 의한 거짓 긍정적인 신호는 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR를 수행하여 조사 수 있습니다. 이런 경우, necessitated 수있는 프로브의 재설계. 프로브 구속력이 사이트에 포인트 돌연변이 약하거나 결석 신호가 발생할 수 있습니다. 각각의 증폭 제품의 두 가지 프로브를 허용하면 검색이 쉽습니다. 이 특성은 신중 뇌관 및 대상 DNA의 작은 시퀀스 변화를 감지 프로브 디자인으로 악용될 수 있습니다.
사용 가능한 제품 검색 다음의 멀티 플렉스 PCR 반응의 많은 방법이 있지만 요약, mPCR / RLB 낮은 설정 - 비용으로 높은 처리량과 저렴한되는 장점이 있습니다. 방법의 유연성은 어플 리케이션의 광범위한에서의 사용을 허용합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
매튜 오설리번 및 페이 만주국은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 대학원 의학 연구 장학금을받는 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5’ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
| 20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
| BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm | Pall Corporation | 74480C | |
| Deionised, purified water | |||
| Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
| Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche Group | 11 089 153 001 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
| Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
| Ice | |||
| Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay. | |||
| Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
| The Belly Dancer rocking platform | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | Euro BDbo | |
| Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
| Water bath | |||
| Suction | |||
| Hot plate | |||
| Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
| X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film | ||
| Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay. | |||
References
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