Summary
هذا البروتوكول هو بسيط مقايسة التصاق البكتيريا التي تتكون في عد الأرقام من مستعمرة بكتيرية تشكيل الوحدات التي انضمت على الخلايا المستنبتة. درس مستقل للadhesin للمقايسة وقوية ، وتستخدم العديد من الاختلافات في معظم المختبرات تعمل على المرضية البكتيرية.
Abstract
تسبب الالتهابات ، ويجب أن البكتيريا تستعمر المضيفة لهم. التعبير عن مسببات الأمراض البكتيرية الجزيئات المختلفة أو هياكل قادرة على تعزيز مرفق لاستضافة الخلايا 1. هذه التفاعلات تعتمد على adhesins مع مستقبلات سطح الخلية المضيفة أو البروتينات القابلة للذوبان ، بوصفها جسرا بين البكتيريا والمضيف. التصاق هو خطوة أولى حاسمة قبل الغزو و / أو إفراز السموم ، وبالتالي فإنه يعد حدثا رئيسيا للدراسة في المرضية البكتيرية. علاوة على ذلك ، انضمت البكتيريا كثيرا ما تدفع بشكل رائع صقل الاستجابات الخلوية ، والدراسات التي وضعن في ميدان 2 'الميكروبيولوجيا الخلوية. المقايسات قوية لالتصاق البكتيريا في الخلايا المضيفة وغزوهم بالتالي تلعب دورا رئيسيا في الدراسات المرضية البكتيرية ومنذ فترة طويلة استخدمت في العديد من المختبرات الرائدة 3،4. وتمارس هذه المقايسات الآن من قبل معظم المختبرات تعمل على المرضية البكتيرية.
هنا ، نحن تصف مقايسة التقيد القياسية توضح مساهمة من adhesin محددة. نستخدم سلالة القولونية 2787 5 ، سلالة الإنسان معربا عن Adhesin شاحنة نقل سيارات شارك في الانضمام منتشر (AIDA). كعنصر تحكم ، ونحن نستخدم سلالة طافرة تفتقر إلى الجين عايدة ، 2787Δ عايدة (F. بيرثيوم وMourez M. ، غير منشورة) ، وسلالة والمختبرات التجارية E. القولونية ، C600 (نيو إنجلاند Biolabs). وتترك هذه البكتيريا على الانضمام إلى الخلايا من يشيع استخدامها HEP - 2 خط الخلايا الظهارية البشرية. وقد تم هذا الاختبار على نطاق واسع أقل صفها قبل 6.
Protocol
1. الأولي : سلالات بكتيرية والخلايا الظهارية.
وتجرى المناورات من الخلايا والبكتيريا جو معقم و مطهر ، تحت غطاء تدفق الصفحي.
- عزل حديثا في E. سلالات القولونية 2787 ، 2787Δ عايدة ، وC600 من المخزونات الجلسرين على مرق Lysogeny (LB) لوحات أجار (1 تريبتون ٪ ، و 0.5 ٪ كلوريد الصوديوم ، و 0.5 ٪ مستخلص الخميرة ، أغار 1.5 ٪) ، وتنمو بمعدل 37 درجة مئوية. لتقليل التباين في الفحص ، فإنه ينصح دائما استخدام سلالات مطلية حديثا ، وإبقاء الضغوط على 4 درجات مئوية على لوحات بتري مختومة فقط لمدة أقصاها أسبوعين.
- ثقافة HEP - 2 الخلايا (ATCC CCL - 23) في النسر ارتفاع الجلوكوز في Dulbecco متوسطة التعديل (DMEM) تستكمل مع المصل المعطل 10 ٪ الحرارة البقري (يتم تنفيذ تعطيل الحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). خلال الثقافة الروتينية نضيف أيضا 10 U / البنسلين مل و 10 الستربتوميسين ميكروغرام / مل.
- تنمو الخلايا التهاب الكبد - 2 في 37 درجة مئوية في حاضنة زنزانة مع جو تحتوي على 5 ٪ CO 2. استخدام معيار إجراءات زراعة الخلايا للحفاظ على الخلايا ، والتي تزرع في 75 سم 2 وقوارير subcultured في كل مرة أن تصل إلى نقطة التقاء. نحن لدينا استخدام الخلايا المستزرعة حتى تصل 30-40 الممرات ومن ثم التخلص منها.
- إعداد مقايسة عندما الخلايا HEP - 2 في قارورة 75 2 سم تقريبا تصل التقاء وبالتالي فهي مستعدة لفحص الالتزام.
2. DAY 1 : إعداد اللقاح والخلايا الظهارية
- غسل - 2 HEP الخلايا في قارورة واحدة مع الفوسفات Dulbecco الدافئة مخزنة المالحة (DPBS : 8 ز / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام / بوكل L ، 0.2 غرام / لتر KH 2 PO 4 ، 0.21 غ / ل نا 2 هبو 4 : 7H 2 O)
- يتم تحضين الخلايا مع التربسين 0.05 ٪ -- EDTA لمدة 5 دقائق قبل ان يضيف جديدا المتوسطة كاملة الدافئة. بعد إضافة المتوسطة الطازجة ، ومعلق الخلايا التي pipetting صعودا وهبوطا.
- تعليق الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة خلية لمدة 5 دقائق وresuspend الكريات في DPBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
- Resuspend الخلايا في متوسطة جديدة تستكمل مع المصل 10 ٪ ولكن لا تحتوي على المضادات الحيوية ، وعلى تركيز خلايا 2x10 5 / مل.
- البذور ميللتر من تعليق خلية في ثلاث مجموعات من الآبار مكررة (واحد لكل سلالة) في وسط لوحة 24 جيدا واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في خلية حاضنة الثقافة.
ملاحظة : من المهم أن يكون جيدا decomplemented المصل والمضادات الحيوية التي يتم حذف بعد هذه المرحلة. قد فشل في القيام بذلك تقتل البكتيريا اصابة. - تلقيح one مستعمرة معزولة من كل سلالة بكتيرية (2787 ، 2787Δ عايدة وC600) في 5 مل من مرق LB (1 تريبتون ٪ ، و 0.5 ٪ كلوريد الصوديوم ، و 0.5 ٪ مستخلص الخميرة) وتنمو بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي (180 دورة في الدقيقة ).
3. يوم 2 : العدوى من الخلايا
- تفقد الخلايا HEP - 2 تحت المجهر المقلوب للتأكد من أنها لا يقل عن 90 ٪ متكدسة والملوثة لا.
- غسلت الخلايا مع DPBS الدافئة ، وإلى كل بئر ، إضافة 1 مل من المتوسط الطازجة تستكمل مع المصل 10 ٪ ولكن لا تحتوي على المضادات الحيوية. أيضا إضافة جديدة لمتوسط ثلاثة آبار دون الخلايا. وسيتم استخدام هذا لتحديد العدد الكلي للبكتيريا في قيحة لكل سلالة.
- قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (نانومتر OD 0،600) من الثقافات البكتيرية. إضافة قسامة كل ثقافة البكتيرية لمجموعة واحدة من الآبار التي تحتوي على تكرار التهاب الكبد - 2 الخلايا والخلايا بشكل جيد واحد لا تحتوي. عادة ، ونحن نستخدم وحدة الثقافة بين عشية وضحاها الموافق 10 6 وحدات تشكيل مستعمرة (كفو). ويمثل هذا التعدد من العدوى (وزارة الداخلية) من 5:01 (البكتيريا : الخلايا). على الرغم من أننا استخدام ثقافاتنا مباشرة بين عشية وضحاها ، بل هو أحيانا من المستحسن الطرد المركزي للبكتيريا وresuspend DPBS منهم في تجنب الآثار الضارة للجزيئات يفرزها موجودة في الثقافات بين عشية وضحاها (مثل cytotoxins ، على سبيل المثال)
ملاحظة : وزارة الداخلية يمكن أن تتفاوت بين 100:1 و01:10. ارتفاع عائدات أعلى تقلب وزارة الداخلية والخلفية والبكتيريا سوف تميل إلى التمسك البلاستيكية من لوحة. انخفاض عائدات وزارة الداخلية أيضا التباين العالي. مرة واحدة يتم اختيار وزارة الداخلية ، لا بد أن تكون متسقة وإبقاء هذه وزارة الداخلية. - احتضان الخلايا المصابة في الخلية الحاضنة الثقافة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
ملاحظة : ومن الممكن أيضا أن أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لوحة على سرعة منخفضة (على سبيل المثال 1000 x ج لمدة 1-2 دقيقة) ، من أجل جمع كل هذه البكتيريا على اتصال مباشر مع الخلايا. هذا يحتوي على فوائد إضافية تزامن العدوى ، والسماح للأقصر الأوقات الحضانة (ما لا يزيد عن 15-30 دقيقة). - إزالة متوسطة من الخلايا المصابة والخلايا يغسل 3 مرات مع DPBS الدافئة. في هذه الخطوة ، يمكن عادة أن ينظر البكتيريا الملتصقة مع المجهر القياسية ونقوم بشكل روتيني هذا الاختيار.
- ليز إلى الخلايا وفصل البكالوريا التقيدteria ، إضافة 100 ميكرولتر من 1 ٪ تريتون X - 100 التي تحتوي على كل جانب من الخلايا. ويمكن استخدام المنظفات الأخرى (مثل سابونين على سبيل المثال).
- احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم تضيف 900 ميكرولتر من LB المتوسطة.
- التجانس بلطف الإيقاف المتكررة التي تصل إلى أسفل وpipetting. وبالمثل الآبار دون الخلايا التي تحتوي على قيحة المتجانس بلطف.
ملاحظة : بعض أنواع البكتيريا قد تكون حساسة جدا من المنظفات ، ونحن في هذه الحالة فصل الخلايا الظهارية التي الحضانة مع التربسين 0.05 ٪ -- لمدة 20 دقيقة EDTA عند 37 درجة مئوية. ويمكن أيضا خلايا البكتيريا مع التقيد يكون كشط من الآبار مع طرف ماصة. - يعد المسلسل 10 أضعاف التخفيفات للمعلقات من البكتيريا والتقيد به قيحة ومرق LB ميكرولتر 100 لوحة من 3 التخفيفات (عادة 1:1،000 التخفيفات ، و1:100،000 1:10،000) على آجار LB واحتضان ليلا 37 درجة مئوية .
4. اليوم 3 : كفو العد وعرض البيانات.
- عد المستعمرات في الأطباق وحساب عدد من البكتيريا كفو والالتزام من اللقاح عن طريق حساب متوسط كل سلسلة من التخفيفات. وينبغي أن تحسب لوحات فقط ما بين 1-30 المستعمرات.
5. ممثل النتائج :
الجدول التالي يوضح نتائج نموذجية من CFU عد من البكتيريا وانضمت في الفترة من 3 قيحة التجارب التي أجريت على أيام مختلفة :
يمكن الابلاغ عن نتائج مباشرة كما انضمت CFU ، كما هو مبين في الشكل 1A. منذ أحجام قيحة يمكن أن تختلف بين سلالات بسبب الاختلافات في معدلات النمو أو أخطاء pipetting ، غالبا ما يكون من المستحسن أن يقدم تقريرا عن نتائج كنسبة مئوية من البكتيريا الالتزام. ويمكن حساب نسبة البكتيريا الالتزام بقسمة عدد من البكتيريا CFU التزمت من قبل عدد من CFU من اللقاح ، كما هو مبين في الشكل 1B. قبل تنفيذ المتكررة ANOVA قياس واختبارات بعد Bonferroni لمقارنة جميع أعمدة 1B الشكل ، يمكننا أن نرى أن هناك فروق ذات دلالة إحصائية (P <0.05) بين 2787 و 2787Δ عايدة ، وكذلك بين 2787 و C600 ، ولكن لا يوجد فرق كبير 2787Δ بين عايدة وC600.
الشكل 1. تمثيل النتائج على النحو CFU من البكتيريا الالتزام (A) أو نسبة مئوية من البكتيريا الالتزام (B)
النسبة المئوية للانضمام لوحظ في كثير من الأحيان تعتمد كثيرا على انشاء التجريبية (وإلى حد أقل ، على المجرب). أهمية خاصة هي وزارة الداخلية وعدد من يغسل ، لذلك لا ينبغي أن تفسر النسبة حرفيا.
يمكن للبكتيريا في قيحة تنمو في بعض الأحيان بشكل أسرع بكثير من البكتيريا في وجود خلايا ، انحراف حجم قيحة بالمقارنة مع العدد الإجمالي الحقيقي من البكتيريا في الآبار مع الخلايا. للتخفيف من حدة هذه المشكلة ، فمن المستحسن إما إلى : (ط) استخدام الآبار مع الخلايا لتحديد قيحة : هي المصنفة HEP - 2 الخلايا في بئر إضافية والمصابين. في نهاية الفحص ، بدلا من التخلص من طاف والغسيل ، و 100 ميكرولتر من تريتون 10 ٪ X - 100 يتم إضافتها إلى البئر. والخلايا ليز والمتجانس بلطف lysate تحتوي على البكتيريا وعدم التقيد التقيد - المتكررة التي تصل إلى أسفل وpipetting ؛ أو (ب) جمع supernatants من الخلايا المصابة في نهاية الفحص ، فضلا عن أن من supernatants ويغسل DPBS وتحديد عدد CFU في تلك supernatants المجمعة. هذا سوف تسفر عن عدد من CFU من البكتيريا غير الالتزام. ويمكن بعد ذلك أن نسبة البكتيريا انضمت يحسب بقسمة عدد من البكتيريا CFU الالتزام من خلال إضافة عدد من البكتيريا CFU الالتزام وعدم الالتزام بها.
لتوضيح مدى متانة مقايسة ، يمكن لنا أن نقارن هذا البروتوكول مع إجراء مقايسة مع S4074 ، وهي ممرضة لاصقة سلالة من الخنازير الجنبية المشعشعة 7 ، حضنت مع خلايا المنشأ حديثا من القصبة الهوائية خنزير صغير خط الخلية ، NPTr 8. وبصرف النظر عن الاختلافات في وسائل الإعلام اللازمة لنمو البكتيريا وخلايا ، والفرق الوحيد هو أن البكتيريا المستخدمة لعدوى من تنامي ثقافة أضعافا مضاعفة ، وليس من ثقافة ثابتة التدريجي بين عشية وضحاها. مع أ. الجنبية من المهم أيضا للغاية لاحترام وزارة الداخلية من 10:01 وألا تتجاوز 3 ساعات من العدوى ، وإلا فإن إفراز السموم سوف يسبب موت الخلايا والتحيز في النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، هذه السلالة من ألف ويمكن بسهولة أن تلتزم الجنبية البلاستيك ولذلك فمن المهم استخدام خلايا متكدسة والتحقق بصريا أن الخلايا لا تتمزق قبالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول معيارا مقايسة التقيد البكتيرية التي يمكن تعديلها لدراسة الغزو (مثل استخدام الجنتاميسين حماية مقايسة 3). عد من وحدات تشكيل مستعمرة يسمح الكمي ، وذلك بالمقارنة مع الأساليب التي تعتمد على تقنيات التصوير القياسية تحت المجهر ، مثل تلطيخ بالغيمزا. هذا الأخير يعطي سوى وجهة نظر النوعية للالتصاق ولكن غالبا ما يكون مكملا مفيدا لأنه يمكن تمييز أنماط مختلفة من الالتصاق وإعطاء رؤى mechanistical 9. ويظهر على سبيل المثال وصمة عار إجراء بالغيمزا مع قيحة CFU من 7 10 من 2787 في الشكل (2) ويدل على التصاق المنتشر على سطح الخلية بأكملها ، سمة مميزة للالقولونية التمسك منتشرة 10.
على الرغم من الجانب الكمي من هذا البروتوكول ، ينبغي التأكيد على أن النتائج عادة ما تكون متغيرة. هناك فرق ثابتة إلى حد ما بين الضوابط الإيجابية والسلبية ، مع وجود سيطرة السلبية عادة بين 10 -- و 100 أضعاف مستويات أقل من التصاق من الضوابط الإيجابية. بل من يوم إلى يوم ، يمكن أن تختلف النسبة المئوية للالتصاق تصل إلى أضعاف - 2. ولذلك غالبا ما يكون من المستحسن استخدام 2-3 في تكرار التجربة ، وخطة تنفيذ العديد من التجارب والتحليلات الإحصائية باستخدام تدابير المتكرر أو المقترن الاختبارات (إما أو اختبار ANOVA الطالب ر).
نقطة أخرى هو المفتاح يغسل بعد التصاق البكتيريا. ويجب الحرص على عدم فصل الخلايا الظهارية. إذا كانت الخلايا تنصل من ثم سيكون هناك أقل من البكتيريا التقيد في ذلك أيضا. ويمكن استخدام يغسل أكثر أو أقل ، ويرتبط جدا عدد البكتيريا انضمت مع عدد من يغسل (عادة ما بين 2 و 4) وتعتمد بدرجة كبيرة على الكيفية التي ينفذ يغسل المجرب. وينبغي استخدام الحد الأدنى لعدد يغسل تسمح خلفية منخفضة. لا يهم كم يغسل ويتم اختيار ، فإنه من الأهمية القصوى لتوظيف عدد من يغسل نفسه بالنسبة لجميع الآبار والإيماءات لتكرار نفسه في كل مرة يتم تنفيذ عملية الغسيل.
تلطيخ بالغيمزا الرقم 2. البكتيريا من E. القولونية 2787 انضمت الى سلالة خلايا HEP - 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم العمل في المختبرات من المؤلفين من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية ، وبرنامج كراسي البحث كندا. معتمد من قبل JL الزمالة من ديفوار جروب القطعة الموسيقية Membranaires Protéines قصر (GEPROM) من خلال التمويل من ان فون بحوث دي سانتي دو كيبيك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
