ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

Summary

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

Abstract

כדי לגרום לזיהומים, חיידקים חייב ליישב המארח שלהם. חיידקים פתוגנים לבטא מולקולות שונות או מבנים מסוגל לקדם מצורף לארח תאים ^1. Adhesins אלה מסתמכים על אינטראקציות עם התא המארח הקולטנים או חלבונים מסיסים מתנהג כמו גשר בין חיידקים המארח. הידבקות היא צעד ראשון קריטי לפני הפלישה ו / או הפרשת רעלים, ולכן הוא אירוע מפתח להיחקר בפתוגנזה חיידקי. יתר על כן, לעתים קרובות חיידקים דבק לגרום להפליא מכויל התגובות הסלולר, המחקרים אשר הולידו בתחום ² "הסלולר מיקרוביולוגיה". מבחני עמידות עבור הידבקות חיידקים על תאים המארח הפלישה שלהם ולכן ממלאים תפקידים מרכזיים מחקרים בפתוגנזה חיידקים כבר מזמן משמשים רבים חלוץ במעבדות ^3,4. מבחני אלה התאמן היום על ידי רוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

כאן אנו מתארים assay דבקות תקן הממחישות את התרומה של adhesin ספציפיים. אנו משתמשים זן coli Escherichia 2787 ^5, זן פתוגניים האדם לבטא את autotransporter Adhesin מעורב דבקות מפוזר (AIDA). כמו שליטה, אנו משתמשים זן מוטנטי חסר את הגן אאידה, 2787Δ אאידה (פ Berthiaume ומ Mourez, לא פורסם), וכן מעבדה זן מסחרי של E. coli, C600 (ניו אינגלנד Biolabs). חיידקים נשארים לדבוק תאים מן השורה נפוץ HEP-2 תאים אנושיים אפיתל. Assay זו תוארה בהרחבה לפני פחות ^6.

Protocol

1. ראשוני: זני חיידקים ותאי אפיתל.

מניפולציות של תאים וחיידקים הם מתבצע בסביבה נקייה מחיידקים, מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.

1. טרי לבודד את ה coli זנים 2787, 2787Δ אאידה, ו C600 ממניות גליצרול על מרק Lysogeny (LB) צלחות אגר (1 tryptone%, 0.5% נתרן כלורי, תמצית שמרים 0.5%, אגר 1.5%) ו לגדול ב 37 ° C. כדי למזער משונות assay, מומלץ תמיד להשתמש זנים מצופה טרי לשמור על זנים ב 4 ° C חתום על צלחות פטרי בלבד לכל היותר כמה שבועות.
2. תרבות HEP-2 תאים (ATCC CCL-23) של גלוקוז השתנה Dulbecco גבוה של הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% מומת חום בסרום שור (איון חום מתבצע ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). במהלך התרבות שגרתי אנחנו גם להוסיף 10 U / ml פניצילין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
3. לגדול הפ-2 תאים על 37 מעלות צלזיוס בתא האינקובטור עם אווירה המכיל 5% CO _2. השתמש תקן תרבות נהלים התא כדי לשמור על התאים, אשר גדל ב 75 ס"מ ² צלוחיות זמן subcultured כל שהם מגיעים למפגש. אנו משתמשים בתאים בתרבית שלנו עד שהם מגיעים 30-40 קטעים, ואז להשליך אותם.
4. הכן assay כאשר HEP-2 תאים בקבוקון 75 ס"מ ² הם כמעט הגיעו למפגש, ולכן מוכנים assay דבקות.

2. יום 1: הכנת inoculum ותאי אפיתל

1. שטפו את-2 HEP תאים הבקבוק פעם עם פוספט Dulbecco חם שנאגרו מלוחים (DPBS: 8 גרם / L NaCl, 0.2 גר '/ L KCl, 0.2 גר' / L KH ₂ PO _4, 0.21 גר '/ L Na ₂ HPO _4: 7H ₂ O)
2. התאים מודגרת עם טריפסין 0.05% - EDTA 5 דקות לפני הוספת טרי בינוני מלא חמה. לאחר בינוני טריים הוא הוסיף, התאים resuspended ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. צנטריפוגה ההשעיה תא בסל"ד 2000 דקות 5 ו resuspend את כדורי ב DPBS ו צנטריפוגות שוב.
4. Resuspend התאים בינוני טריים בתוספת סרום המכיל 10% אך ללא אנטיביוטיקה, בריכוז של ⁵ 2x10 תאים / מ"ל.
5. זרע אחד למיליליטר של השעיה תא שלושה סטים של בארות כפולות (אחד עבור כל זן) במרכז צלחת 24 באר ו דגירה את הצלחת לילה תרבות התא חממה.
   הערה: חשוב כי הסרום להיות decomplemented ביסודיות כי אנטיביוטיקה מושמטים אחרי השלב הזה. הימנעות מלעשות זאת עלולה להרוג את החיידקים הדבקה.
6. לחסן one מושבה מבודדת של כל זן חיידקי (2787, 2787Δ אאידה C600) ב 5 מ"ל של מרק LB (1 tryptone%, 0.5% נתרן כלורי, תמצית שמרים 0.5%) ו לגדול בין לילה בשעה 37 ° C עם רעד נמרץ (180 סל"ד ).

3. יום 2: זיהום של תאים

1. בדוק את HEP-2 תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא כי הם לפחות 90% ומחוברות ולא מזוהמים.
2. שטפו את התאים עם DPBS חם, זה היטב, להוסיף 1 מ"ל של מדיום טריים בתוספת סרום המכיל 10% אך ללא אנטיביוטיקה. כמו כן להוסיף בינוני טרי שלוש בארות ללא תאים. זה ישמש כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקים inoculum עבור כל זן.
3. מדוד את צפיפות אופטית ב 600 nm (OD _{0.600 ננומטר)} של התרבויות חיידקי. הוסף aliquot של כל תרבות חיידקי להגדיר אחד בארות כפול המכיל הפ-2 תאים אחד גם לא המכיל תאים. בדרך כלל אנו משתמשים בנפח של תרבות לילה המקביל ל 10 ⁶ יחידות המושבה להרכיב (CFU). זה מייצג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 05:01 (חיידקים: תאים). למרות שאנו ישירות להשתמש תרבויות הלילה שלנו, לפעמים רצוי בצנטריפוגה חיידקים resuspend אותם DPBS כדי למנוע השפעות מזיקות של מולקולות מופרש בהווה בתרבויות לילה (כגון cytotoxins, למשל)
   הערה: משרד הפנים יכול להשתנות בין 100:1 ו - 1:10. משרד הפנים גבוהה בתשואות השתנות גבוה ורקע וחיידקים נוטים לדבוק פלסטיק הצלחת. תחתון משרד הפנים גם תשואות שונות גבוהה. ברגע משרד הפנים נבחר, הכרחי להיות עקביים ולהמשיך זה למשרד הפנים.
4. דגירה תאים נגועים של תרבית תאים בחממה במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   הערה: ניתן גם צנטריפוגות בקצרה את הצלחת במהירות נמוכה (למשל 1000 XG 1-2 דקות), כדי להביא את כל החיידקים ישירות במגע עם התאים. זה כולל את היתרונות נוסף של סנכרון את הזיהום, ומאפשר פעמים הדגירה קצר (קצת כמו 15-30 דקות).
5. הסר את המדיום מן התאים הנגועים ולשטוף את התאים 3 פעמים עם DPBS חם. בשלב זה, חיידקים חסיד בדרך כלל ניתן לראות במיקרוסקופ רגיל אנו מבצעים בדיקה זו באופן שגרתי.
6. כדי lyse התאים ולנתק את BAC דבקteria, להוסיף 100 μl של 1% Triton X-100 זה טוב המכיל את התאים. דטרגנטים אחרים יכולים לשמש (כגון saponin למשל).
7. דגירה תאים עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 900 ​​μl של מדיום LB.
8. בעדינות homogenize השעיות חוזרות ונשנות על ידי מעלה מטה pipetting. בארות ללא התאים המכילים את inoculum הם דומה הומוגני בעדינות.
   הערה: חיידקים מסוימים עשויים להיות רגישים יותר מדי חומר ניקוי, במקרה שיש לנו לנתק את לתאי האפיתל על ידי הדגירה עם טריפסין 0.05% - EDTA במשך 20 דקות על 37 ° C. תאים יחד עם חיידקים דבק יכול להיות גם מגורד מבארות עם קצה פיפטה.
9. הכן סדרתי של פי 10 דילולים של המתלים של חיידקים דבק ו inoculum באמצעות מרק LB ו - 100 μl צלחת מ 3 דילולים (בדרך כלל דילולים 1:1,000, 1:10,000 ו - 1:100,000) על אגר LB ו דגירה לילה בשעה 37 ° C .

4. יום 3: ספירת CFU והצגת נתונים.

1. ספירת מושבות על הצלחות ועל לחשב את מספר CFU של חיידקים דבק של inoculum על ידי חישוב ממוצע כל סדרה של דילולים. רק צלחות עם מושבות בין 10-300 צריכה להיות מנה.

5. נציג התוצאות:

הטבלה הבאה מציגה תוצאות אופייני CFU ספירה של חיידקים דבק ו inoculum מ - 3 ניסויים שבוצעו בימים שונים:

התוצאות ניתן לדווח ישירות דבק כמו CFU, כפי שמוצג באיור 1 א. מאז בגדלים inoculum יכול להשתנות בין זנים בגלל הבדלים בשיעורי הצמיחה או טעויות pipetting, היא לעתים קרובות רצוי לדווח על תוצאות כאחוז של חיידקים דבק. האחוז של חיידקים דבק יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר CFU של חיידקים דבקו במספר CFU של inoculum, כפי שמוצג באיור 1 ב. על ידי ביצוע צעד ANOVA חוזרות Bonferroni שלאחר בדיקות להשוות את כל העמודות של 1B איור, אנו יכולים לראות כי ישנם הבדלים משמעותיים (p <0.05) בין 2787 ו 2787Δ אאידה, וכן בין 2787 ו - C600, אבל אין הבדל משמעותי בין 2787Δ אאידה C600.

באיור 1. ייצוג התוצאות כפי CFU של חיידקים דבק (א) או שיעור של חיידקים דבק (ב)

אחוז ההיענות נצפו לעתים קרובות תלויים מאוד הניסוי הגדרת (ובמידה פחותה, על הניסוי). חשוב במיוחד הם הפנים ומספר שוטף, כך אחוז אין לפרש פשוטו כמשמעו.

חיידקים inoculum יכולים לפעמים לצמוח הרבה יותר מהר מאשר את החיידקים בנוכחות של תאים, שתשבש את גודל inoculum בהשוואה למספר הכולל האמיתי של חיידקים בארות עם תאים. כדי להקל על בעיה זו, מומלץ גם: (i) להשתמש בבארות עם תאים כדי לקבוע את inoculum: HEP-2 תאים זרע היטב נוספים נגועים. בסוף assay, במקום להשליך supernatant ועל כביסה, 100 μl של טריטון 10% X-100 הוא הוסיף היטב. התאים יהיה lyse ואת lysate המכיל חיידקים דבק ולא דבק הוא הומוגני בעדינות על ידי חזרה מעלה ומטה pipetting;. או (ii) לאסוף את supernatants של תאים נגועים בסוף assay, כמו גם מן supernatants DPBS שוטף ולקבוע את מספר CFU באותם supernatants ונקווה. זו תניב את מספר CFU של חיידקים שאינם דבק. האחוז של חיידקים דבק אז יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר CFU של חיידקים דבק על ידי תוספת של מספר CFU של חיידקים דבק ולא דבק.

כדי להמחיש את חוסנו של assay, אנחנו יכולים להשוות את זה עם פרוטוקול assay שבוצעה עם S4074, חזירי דבק פתוגניים זן של Actinobacillus pleuropneumoniae ^7, מודגרות עם תאים קו הקימה לאחרונה תא קנה הנשימה חזרזיר, NPTr ^8. מלבד ההבדלים בתקשורת נדרש צמיחה של חיידקים לתאים, ההבדל היחיד הוא כי חיידקים המשמשים זיהום הם מתרבות גדל באופן אקספוננציאלי, ולא מן התרבות נייח שלבים לילה. עם א pleuropneumoniae זה גם חשוב מאוד לכבד את הפנים של 10:01 ולא יעלה על 3 שעות של זיהום, אחרת את הפרשת רעלים יגרום למוות התא הטיה בתוצאות. בנוסף, זן זה של A. pleuropneumoniae יכול בקלות לדבוק פלסטיק ולכן חשוב להשתמש בתאי ומחוברות ולוודא ראייה כי התאים אינם ומשילה מעליה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר assay תקן היצמדות חיידקית כי ניתן לשנות ללמוד הפלישה (למשל באמצעות גנטמיצין assay הגנה ^3). ספירת יחידות המושבה להרכיב מאפשרת כימות, על ידי השוואה עם גישות להסתמך על טכניקות להדמיה תקן תחת מיקרוסקופ, כגון מכתים Giemsa. זה האחרון רק נותן תצוגה איכותית של הידבקות אך לעיתים קרובות משלימים שימושי שכן הוא יכול להבחין בדפוסים שונים של הדבקה ולתת תובנות mechanistical ^9. למשל Giemsa הכתם הופיע עם inoculum של 10 ⁷ CFU של 2787 מוצג באיור 2 ו מצביע על הידבקות מפוזר על פני התא שלמים, האופייניים coli Escherichia diffusely דבקות ^10.

למרות ההיבט הכמותי של פרוטוקול זה, יש להדגיש כי התוצאות הן בדרך כלל משתנה. יש הבדל די קבועה בין בקרות חיוביות ושליליות, עם שליטה שלילית בדרך כלל שיש בין 10 - 100 פי רמות נמוכות יותר של הידבקות מאשר שולטת חיובית. אבל מיום ליום, אחוז ההידבקות יכול להשתנות עד פי 2. לכן לעיתים קרובות מומלץ להשתמש 2-3 לשכפל לכל ניסוי, תוכנית מספר ניסויים ולבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות אמצעים או בדיקות חוזרות ונשנות זיווג (או ANOVA או מבחן t של סטודנט).

נקודה נוספת המפתח הוא רוחץ לאחר הידבקות של חיידקים. יש להקפיד שלא לנתק את לתאי האפיתל. אם התאים נושרים אז יהיו פחות חיידקים דבק בכך גם כן. שוטף פחות או יותר ניתן להשתמש ומספר חיידקים דבק קשורה מאוד עם מספר שוטף (בדרך כלל בין 2 ל 4) ו תלוי בכבדות על איך הניסוי מבצעת שוטף. המספר המינימלי של שוטף המאפשר רקע נמוך אמור לשמש. לא משנה כמה שוטף רבים הם בחרו, זה הוא בעל חשיבות עליונה להעסיק את אותו מספר של שוטף עבור כל בארות לחזור על אותן מחוות בכל פעם לשטוף מבוצע.

2. איור Giemsa מכתים של חיידקים E. coli זן 2787 דבק HEP-2 תאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High glucose DMEM	GIBCO, by Life Technologies	12430-054
DDPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Bovine Growth Serum	Hyclone	SH3054
Penicillin/Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140-148
24 well plates	Corning	3337
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100