Summary
Questo protocollo è un test semplice adesione batterica che consiste nel contare il numero di unità formanti colonie batteriche che vengano rispettate su cellule in coltura. Il test è robusto, indipendente dal adesina studiato, e numerose varianti vengono utilizzate nella maggior parte dei laboratori che lavorano su patogenesi batterica.
Abstract
A causare infezioni, i batteri devono colonizzare il loro ospite. Batteri patogeni esprimere varie molecole o strutture in grado di promuovere l'attaccamento alle cellule ospite 1. Queste adesine si basano su interazioni con i recettori della cellula ospite superficie o proteine solubili che funge da ponte tra batteri e ospite. L'adesione è un primo passo fondamentale prima di invasione e / o secrezione di tossine, perciò è un evento chiave per essere studiato nella patogenesi batterica. Inoltre, i batteri aderito spesso squisitamente indurre risposte cellulari messo a punto, gli studi che hanno dato vita al campo di 2 'microbiologia cellulare'. Test robusti per l'adesione batterica su cellule ospiti e la loro invasione quindi giocare un ruolo chiave negli studi di patogenesi dei batteri e sono da tempo utilizzati in molti laboratori pioniere 3,4. Questi test sono ora praticata dalla maggior parte dei laboratori che lavorano su patogenesi batterica.
Qui, descriviamo un test standard di aderenza che illustrano il contributo di uno specifico adesina. Utilizziamo il ceppo di Escherichia coli 2787 5, un ceppo patogeno umano che esprime la autotransporter Adhesin Coinvolto in aderenza diffusa (AIDA). Come controllo, si utilizza un ceppo mutante privi del gene aida, 2787Δ Aida (F. e M. Berthiaume Mourez, inedito), e un ceppo di laboratorio commerciale di E. coli, C600 (New England Biolabs). I batteri sono lasciati di aderire alle cellule dal comunemente usati HEp-2 linea di cellule epiteliali umane. Questo test è stato meno ampiamente descritto in precedenza 6.
Protocol
1. Preliminare: ceppi batterici e le cellule epiteliali.
Manipolazioni di cellule e batteri vengono eseguite in modo asettico, sotto una cappa a flusso laminare.
- Appena isolare la E. coli 2787, 2787Δ Aida, e C600 dalle scorte glicerolo in brodo lisogenia (LB) piastre di agar (1 triptone%, cloruro di sodio allo 0,5%, estratto di lievito 0,5%, 1,5% agar) e crescono a 37 ° C. Per minimizzare la variabilità nel test, si consiglia di utilizzare sempre ceppi appena placcato e per mantenere i ceppi a 4 ° C in piastre di Petri chiusa solo per un massimo di un paio di settimane.
- Cultura cellule HEp-2 (ATCC CCL-23) in alto glucosio Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% siero bovino inattivato con il calore (inattivazione termica viene eseguita a 56 ° C per 30 min). Durante la cultura di routine aggiungiamo anche 10 U / ml di penicillina e 10 mg / ml di streptomicina.
- Crescere le cellule Hep-2 a 37 ° C in una cella incubatore con un'atmosfera contenente il 5% di CO 2. Utilizzare le procedure standard di coltura cellulare per mantenere le cellule, che vengono coltivate in 75 cm 2 palloni e subcoltura ogni volta che raggiungere la confluenza. Noi usiamo le nostre cellule in coltura fino a raggiungere 30-40 passaggi e poi disfarsene.
- Preparare un test quando la cellule HEp-2 in un centimetro 75 2 fiasco sono quasi raggiungendo confluenza e quindi sono pronti per un test di aderenza.
2. GIORNO 1: Preparare l'inoculo e le cellule epiteliali
- Lavare i-2 HEp cellule nel pallone una volta con fosfato caldo Dulbecco salina tamponata (DPBS: 8 g / L di NaCl, 0,2 g / L di KCl, 0,2 g / l KH 2 PO 4, 0,21 g / L di Na 2 HPO 4: 7H 2 O)
- Le cellule vengono incubate con il 0,05% tripsina - EDTA per 5 minuti prima di aggiungere nuovi media caldo completo. Dopo mezzo fresco viene aggiunto, le cellule sono risospese pipettando su e giù.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 2.000 giri per 5 minuti e risospendere il pellet in DPBS e centrifugare di nuovo.
- Risospendere le cellule in terreno fresco supplementato con 10% di siero, ma che non contiene antibiotici, ad una concentrazione di 2x10 5 cellule / ml.
- Semi di un millilitro di sospensione cellulare in tre serie di pozzetti in doppio (uno per ogni ceppo) al centro di un 24-pozzetti ed incubare la piastra di notte in una coltura cellulare incubatore.
Nota: è importante che il siero venga accuratamente decomplemented e che gli antibiotici sono stati omessi, dopo questa fase. In caso contrario potrebbe uccidere i batteri infettante. - Inoculare una colonia isolata di ogni ceppo batterico (2787, 2787Δ aida e C600) in 5 ml di brodo LB (1 triptone%, cloruro di sodio allo 0,5%, estratto di lievito 0,5%) e crescono durante la notte a 37 ° C con agitazione vigorosa (180 giri al minuto ).
3. 2 ° GIORNO: infezione delle cellule
- Ispezionare la cellule HEp-2 sotto un microscopio invertito per accertare che sono almeno il 90% confluenti e non contaminati.
- Lavato le cellule con DPBS caldo e, in ogni pozzetto, aggiungere 1 ml di terreno fresco supplementato con 10% di siero, ma che non contiene antibiotici. Aggiungete anche mezzo fresco di tre pozzi senza cellule. Questo sarà utilizzato per determinare il numero totale di batteri nel inoculo per ogni ceppo.
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 0,600 nm) di colture batteriche. Aggiungere un'aliquota di ogni coltura batterica in una serie di pozzetti in doppio che contiene le cellule Hep-2 e ad un bene che non contengono cellule. Di solito, si usa un volume di cultura durante la notte che corrisponde a 10 6 unità formanti colonia (ufc). Questo rappresenta una molteplicità di infezione (MOI) di 5:1 (batteri: le cellule). Anche se siamo utilizzare direttamente le nostre culture durante la notte, a volte è consigliabile centrifugare i batteri e risospendere in DPBS per evitare gli effetti deleteri di molecole secrete presenti nelle culture durante la notte (come citotossine, per esempio)
Nota: il MOI può variare tra 100:1 e 1:10. MOI più alto rendimento maggiore variabilità e lo sfondo e batteri tenderà ad aderire alla plastica della piastra. MOI rendimenti inferiori anche elevata variabilità. Una volta che un MOI è scelto, è indispensabile essere coerenti e mantenere questa MOI. - Incubare le cellule infette nella cella cultura incubatore per 3 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
Nota: E 'anche possibile di centrifugare brevemente la piastra a bassa velocità (ad esempio 1.000 xg per 1-2 min), al fine di portare tutti i batteri direttamente a contatto con le cellule. Questo ha l'ulteriore vantaggio di sincronizzare l'infezione, e consentendo tempi di incubazione più breve (non più di 15-30 min). - Rimuovere il supporto da parte delle cellule infettate e lavare le cellule 3 volte con DPBS caldo. In questa fase, i batteri aderenti di solito può essere visto con un microscopio standard e di routine che esegue questo controllo.
- Per lisare le cellule e staccare il aderito bacteri, aggiungere 100 ml di 1% Triton X-100 in ciascun pozzetto contenente le cellule. Altri detergenti possono essere utilizzati (come ad esempio saponina, per esempio).
- Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente e poi aggiungere 900 ml di LB medium.
- Delicatamente omogeneizzare le sospensioni da ripetute su e giù pipettaggio. I pozzi senza cellule contenenti l'inoculo sono altrettanto delicatamente omogeneizzato.
Nota: alcuni batteri potrebbe essere troppo sensibile al detergente, in questo caso si staccano le cellule epiteliali di incubazione con tripsina 0,05% - EDTA per 20 minuti a 37 ° C. Insieme le cellule con i batteri aderito possono anche essere raschiato dai pozzi con la punta della pipetta. - Preparare seriale 10-diluizioni delle sospensioni di batteri aderito e l'inoculo utilizzando brodo LB e la piastra di 100 ul da 3 diluizioni (di solito il diluizioni 1:1.000, 1:10.000 e 1:100.000) su agar LB ed incubare una notte a 37 ° C .
4. GIORNO 3: conteggio cfu e presentazione dei dati.
- Contare le colonie sulle piastre e calcolare il numero di cfu di batteri aderito e dell'inoculo la media ciascuna serie di diluizioni. Piatti unici con tra 10-300 colonie dovrebbero essere contate.
5. Rappresentante dei risultati:
La tabella seguente mostra i risultati tipici di ufc conteggio dei batteri aderito e l'inoculo da 3 esperimenti eseguiti in giorni diversi:
I risultati possono essere riportati direttamente come aderito cfu, come mostrato nella Figura 1A. Dal momento che le dimensioni inoculo può variare tra i ceppi a causa delle differenze nei tassi di crescita o errori di pipettamento, è spesso consiglia di segnalare i risultati come percentuale di batteri aderito. La percentuale di batteri aderito può essere calcolato dividendo il numero di cfu di batteri aderito per il numero di cfu di inoculo, come mostrato nella Figura 1B. Eseguendo una misura ripetuta ANOVA e Bonferroni post-test per confrontare tutte le colonne di Figura 1B, possiamo vedere che ci sono differenze significative (p <0,05) tra il 2787 e 2787Δ aida, così come tra 2787 e C600, ma nessuna differenza significativa tra 2787Δ aida e C600.
Figura 1. Rappresentazione dei risultati come UFC di batteri aderito (A) o la percentuale di batteri aderito (B)
La percentuale di adesione osservati è spesso molto dipende dal set-up sperimentale (e, in misura minore, sul sperimentatore). Particolarmente importanti sono il MOI e il numero di lavaggi, per cui la percentuale non deve essere interpretata letteralmente.
I batteri nel inoculo a volte può crescere molto più velocemente rispetto ai batteri in presenza di cellule, alterando le dimensioni dell'inoculo rispetto al reale numero totale di batteri in pozzi con le cellule. Per ovviare a questo problema, si consiglia di: (i) utilizzare i pozzi con le cellule per determinare l'inoculo: cellule HEp-2 sono seminati in un pozzo supplementare e infetti. Alla fine del test, invece di scartare il surnatante e lavare, 100 ml di 10% di Triton X-100 si aggiunge al pozzo. Lisare le cellule e il lisato contenente batteri aderito e non è gentilmente aderito omogeneizzato da ripetuti su e giù pipettaggio;. O (ii) raccogliere i surnatanti delle cellule infettate, alla fine del test, così come i surnatanti di la lava DPBS e determinare il numero di cfu in quelle surnatanti pool. Questo produrrà il numero di cfu di batteri non aderito. La percentuale di batteri aderito può essere calcolato dividendo il numero di cfu di batteri aderito con l'aggiunta del numero di cfu di batteri aderito e non aderito.
Per illustrare la robustezza del test, possiamo confrontare questo protocollo con il test effettuato con S4074, un adesivo suina di ceppo patogeno Actinobacillus pleuropneumoniae 7, incubate con cellule provenienti da una linea di recente costituzione tracheale cellula maialino, NPTr 8. A parte le differenze nel supporto richiesto per la crescita dei batteri e le cellule, l'unica differenza è che i batteri sono usati per l'infezione da una cultura in crescita esponenziale, e non da una fase stazionaria cultura durante la notte. Con A. pleuropneumoniae è anche molto importante rispettare un MOI di 10:1 e di non superare 3 ore di infezione, altrimenti la secrezione di tossine che causano la morte cellulare e pregiudizi dei risultati. Inoltre, questo ceppo di A. pleuropneumoniae possono facilmente aderire alla plastica quindi è importante utilizzare le cellule confluenti e verificare visivamente che le cellule non sono sloughing off.
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Discussion
Questo protocollo descrive un dosaggio standard di aderenza dei batteri che possono essere modificati per studiare l'invasione (ad esempio usando gentamicina saggio di protezione 3). Il conteggio delle unità formanti colonie consente la quantificazione, a confronto con approcci affidamento su tecniche di visualizzazione standard di sotto un microscopio, come la colorazione Giemsa. Quest'ultimo fornisce una visione qualitativa di adesione, ma spesso è un complemento utile dal momento che può differenziare i vari modelli di adesione e dare spunti mechanistical 9. Per esempio un Giemsa eseguita con un inoculo di 10 7 cfu del 2787 è illustrato nella figura 2 e indica una diffusa adesione sulla superficie delle cellule intero, caratteristica del Aderendo Escherichia coli diffusamente 10.
Nonostante l'aspetto quantitativo di questo protocollo, va sottolineato che i risultati sono generalmente variabili. C'è una differenza abbastanza costante tra controlli positivi e negativi, con un controllo negativo tipicamente avere tra i 10 - e livelli inferiori di 100 volte di adesione rispetto ai controlli positivi. Ma di giorno in giorno, la percentuale di adesione può variare fino a 2 volte. Pertanto, è spesso consigliabile usare 2-3 replicare per esperimento, il piano di diversi esperimenti ed eseguire analisi statistiche utilizzando misure ripetute o test accoppiati (o ANOVA o test t di Student).
Un altro punto chiave è la lava dopo l'adesione dei batteri. Bisogna fare attenzione a non staccare le cellule epiteliali. Se le cellule slough off allora ci sarà meno batteri aderito a quel pozzo. Lava più o meno può essere utilizzato e il numero di batteri aderito è molto correlato con il numero di lavaggi (di solito tra i 2 e 4) e dipende molto da come lo sperimentatore esegue la lava. Il numero minimo di lavaggi che consente a un fondo a bassa dovrebbe essere usata. Non importa quanti lavaggi vengono scelti, è della massima importanza per impiegare lo stesso numero di lavaggi per tutti i pozzetti e di ripetere gli stessi gesti ogni volta che si esegue un lavaggio.
Figura 2. Giemsa di batteri E. ceppo coli 2787 aderito a cellule HEp-2.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Lavoro nei laboratori degli autori è sostenuto da finanziamenti della scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, gli Istituti di Canada Health Research, e il Canada Research Chairs programma. JL è sostenuto da una borsa di studio dal Groupe d'Étude des Membranaires Protéines (GEPROM) attraverso i finanziamenti del Fonds de Recherche en Santè du Québec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
