Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Summary

Een eenvoudige slot blot methode werd ontwikkeld voor de kwantificering van influenza virale hemagglutinine en neuraminidase met behulp van universele antilichamen gericht hun meest geconserveerde sequenties geïdentificeerd door middel van bioinformatica analyses. Deze innovatieve aanpak kan een nuttig alternatief voor de kwantitatieve bepaling van alle virale hemagglutinine en neuraminidase.

Abstract

Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn twee oppervlakte-eiwitten van influenza virussen waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in de virale levenscyclus en de inductie van beschermende immuunrespons ^1,2. Aangezien de belangrijkste doelstelling voor neutraliserende antistoffen, wordt HA momenteel gebruikt als het griepvaccin potentie marker en wordt gemeten door een radiale immunodiffusie (SRID) ^3. Echter, de afhankelijkheid van SRID op de beschikbaarheid van de overeenkomstige subtype-specifieke antisera zorgt voor een minimum van 2-3 maanden vertraging voor de introductie van elke nieuwe vaccin. Bovendien, ondanks de bewijzen dat NA ook beschermende immuniteit ^4, het aantal NA in griepvaccins is nog niet gestandaardiseerd te wijten aan een gebrek aan geschikte reagentia of analysemethode ⁵ induceert. Zo simpel alternatieve methoden in staat te kwantificeren HA en NA antigenen zijn wenselijk voor een snelle release en een betere kwaliteitscontrole van griepvaccins.

Universeel geconserveerde gebieden in alle beschikbare influenza-A-HA en NA sequenties werden geïdentificeerd door bioinformatica analyses ^6-7. Een sequence (aangeduid als Uni-1) werd geïdentificeerd in het enige universeel bewaard epitoop van HA, de fusiepeptide ^6, terwijl de twee geconserveerde sequenties werden geïdentificeerd in neuraminidases, een dicht bij de enzymatische actieve site (aangeduid als HCA-2) en de andere dicht bij de N-terminus (aangeduid als HCA-3) ^7. Peptiden met deze aminozuursequenties werden gesynthetiseerd en gebruikt om konijnen voor de productie van antilichamen immuniseren. Het antilichaam tegen de Uni-1 epitoop van HA in staat was om te binden tot en met 13 subtypen van het influenza A HA (H1-H13), terwijl de antistoffen tegen de HCA-2 en HCA-3 regio's van NA in staat waren bindend voor alle negen NA subtypes. Alle antilichamen toonde opmerkelijke specificiteit tegen de virale sequenties, zoals blijkt uit de constatering dat er geen kruisreactiviteit met eiwitten allantoïsche was gedetecteerd. Deze universele antilichamen werden vervolgens gebruikt om slot blot assays te ontwikkelen voor HA en NA in het influenza-A-vaccins te kwantificeren, zonder de noodzaak van specifieke antisera ^7,8. Vaccin monsters werden aangebracht op een PVDF-membraan met behulp van een slot blot apparaat samen met de referentie-normen verdund tot verschillende concentraties. Voor de detectie van HA, werden monsters en de standaard eerste verdund in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 4M ureum, terwijl voor het meten van de NA ze werden verdund in TBS met 0,01% Zwittergent als deze voorwaarden significant de detectie gevoeligheid verbeterd. Na de vaststelling van de HA en NA antigenen door immunoblotting met hun respectieve universele antilichamen werden signaal intensiteiten gekwantificeerd door densitometrie. Bedragen van de HA en NA in de vaccins werden vervolgens berekend met behulp van een standaardcurve opgesteld met het signaal intensiteit van de verschillende concentraties van de gebruikte referenties.

Gezien het feit dat deze antilichamen binden aan universele epitopen in HA of NA, kunnen geïnteresseerde onderzoekers gebruiken als research tools in immunoassays andere dan de sleuf blot alleen.

Protocol

1. Voorbereiding van de reagentia en apparatuur

1. Voordat u begint met het slot blot procedure, voor te bereiden 20_mls van 4M ureum-oplossing in Tris-gebufferde zoutoplossing (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) voor het hemagglutinine, of HA, slot blot, of 20_mls van een 0,01% Zwittergent oplossing in TBS voor de neuraminidase, of NA, slot blot. Terwijl 4M ureum moet vers worden bereid elke keer, een 10% Zwittergent voorraad oplossing in dH ₂ O is stabiel gedurende ten minste 6 maanden bij kamertemperatuur en kan dus worden verdund tot 0,01% in TBS voor elke test.
2. Bereid 2000 ml van wasbuffer door het toevoegen van Tween-20 tot een TBS-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,1%. Bereid 80 ml van het blokkeren van buffer door het oplossen van magere melkpoeder (blotting kwaliteit niet-vette droge melk) tot een uiteindelijke concentratie van 5% w / v in wasbuffer.
3. Activeer de PVDF membraan (pre-cut naar een 9 x 12 cm formaat) in methanol gedurende 15 seconden, gevolgd door een 2 minuten spoelen in DDH ₂ O. Geniet van het membraan in TBS tot gebruik. Pre-nat drie vellen van Bio-Dot SF filtreerpapier in TBS tot gebruik.

2. De voorbereiding van influenza vaccin monsters en referentie voor HA slot blot

Griepvaccin referentienormen met vooraf vastgestelde HA inhoud overeenkomt met de vaccinstammen te testen werden verkregen van het Centrum voor Biologics Evaluation and Research (CBER / FDA, USA) en het Nationaal Instituut voor Biologische Standard and Control (NIBSC, VK) en worden gebruikt voor de kwantificering van HA slot blot. De onderzoekers kunnen ook de voorbereiding van hun eigen antigeen normen volgens vaste procedures, zoals beschreven in de referenties 9 en 10.

1. Voor HA referentie-antigenen en test vaccin monsters: Verdun de referentie-antigeen HA voorraad in 4M ureum / TBS naar de volgende concentraties: 0, 0.0938, 0.1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3 en 6 ug HA / ml. Meng goed. Vervolgens verdunnen testvaccin monsters voor menselijk gebruik verkregen van vaccin producenten of in eigen huis gemaakt voor wetenschappelijk onderzoek in 4M ureum / TBS en meng goed. Terwijl duplicaten van de referentie-antigeen en vaccin monsters kunnen worden uitgevoerd, zijn triplo voorkeur. Bereid drie verdunningen van elk monster (2-voudig verschil), zodat het monster concentratie te vallen binnen de standaard curve. Bereid 450 ul of 650 ul van elke referentie-antigeen of vaccin te testen monster te verdunnen tot duplicaten rennen of triplo respectievelijk. Monovalente influenza-A-vaccins kunnen worden getest met dit slot blot methode. De HA inhoud van het referentie-antigenen werd eerder bepaald met behulp van SRID dat is het momenteel gebruikte standaard test op influenza vaccin preparaten. De HA-gehalte bepaald door SRID werd gebruikt als de eerste referentie-antigeen HA voorraad concentratie voor de bereiding van de verdunningen voor de sleuf blot standaardcurve.

3. De voorbereiding van influenza vaccin monsters en referentie voor NA slot blot

Griepvaccin referentienormen die overeenkomt met de vaccinstammen te testen werden verkregen van het Centrum voor Biologics Evaluation and Research (CBER / FDA, USA) en het Nationaal Instituut voor Biologische Standard and Control (NIBSC, Verenigd Koninkrijk) en worden gebruikt voor de NA kwantificering door de sleuf blot. De NA inhoud van deze referentie-monsters werd bepaald door SDS-PAGE-analyse van deglycosylated monsters in combinatie met densitometrie scanning analyse, zoals eerder beschreven ^9, met lichte wijzigingen ^10. In het kort werden de deglycosylated vaccin referentiemonsters (5 ug) gemengd met monsterbuffer en geladen op de gel. De gel werd uitgevoerd bij 20 mA voor ongeveer 90 min tot het volgen van kleurstof alleen nog maar uit de gel, gevolgd door Sypro kleuring. Densitometrie kwantificering van eiwitten werd uitgevoerd met behulp van een Fluorchem gel documentatiesysteem (Alpha Innotech). De hoeveelheid van de NA werd bepaald op basis van de verhouding van de NA eiwitten om de totale eiwitten zoals bepaald door de Lowry assay. Referentiemonsters bereid met behulp van deze methode kan vervolgens worden gebruikt in slot blot voor de kwantificering van de NA inhoud vaccin monsters van vaccins fabrikanten.

1. Voor NA referentie-antigenen en test vaccin monsters: Verdun de NA referentie-antigeen voorraad in 0,01% Zwittergent / TBS naar de volgende concentraties: 0, 0,039, 0,078, 0,1562, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 en 10 microgram NA / ml. Meng goed. Vervolgens verdunnen testvaccin monsters voor menselijk gebruik verkregen van vaccin producenten of in eigen huis gemaakt voor wetenschappelijk onderzoek in 0,01% Zwittergent / TBS en meng goed. Terwijl duplicaten van de referentie-antigeen en vaccin monsters kunnen worden uitgevoerd, zijn triplo voorkeur. Bereid drie verdunningen van elk monster (2-voudig verschil), zodat het monster concentratie te vallen binnen de standaard curve. Bereid 450 ul of 650 ul van elke referentie-antigeen of vaccin te testen monster te verdunnen tot duplicaten rennen of triplo respectievelijk. Monovalente influenza-A-vaccins kunnen worden getest with dit slot blot methode.

4. Montage van de Bio-Dot SF Microfiltratie apparatuur en blotting van de monsters op PVDF-membraan

1. Monteer een vooraf gereinigd en gedroogd Bio-Dot SF Microfiltratie apparaat. Plaats de pakking steunplaat in het vacuum spruitstuk en plaats de afdichting op top.Place de drie vochtige vellen van Bio-Dot SF filter papier over de pakking, gevolgd door de pre-geweekte PVDF membraan. Plaats het monster sjabloon op de top van het membraan en vinger-draai de vier schroeven met een diagonale oversteek patroon voor een uniforme toepassing van de druk op het membraanoppervlak te verzekeren.
2. Controleer of de 3-weg klep is ingesteld om het vacuüm verdeelstuk bloot te stellen aan het vacuüm bron alleen voor het inschakelen van de pomp en het aansluiten van de vacuüm.
3. Zet de pomp aan en maak verbinding met de Bio-Dot apparaat. Zorg ervoor dat de doorstroombegrenzer is geplaatst op een lager niveau dan het monster putten voor een snelle en goede drainage van de monsters in de volgende stappen.
4. Herhaal de schroef aandraaien stap met behulp van de diagonale oversteek patroon. Aandraaien van de schroeven, terwijl het vacuüm wordt aangebracht zorgt voor een strakker afdichting en voorkomt kruisbesmetting tussen de putten.
5. Wijzig de flow ventiel om het vacuüm spruitstuk bloot aan de lucht en uit te schakelen van de pomp.
6. Breng 100 ul van TBS om alle putten met behulp van een multichannel pipet aan het membraan waardoor een uniforme binding van het antigeen te hydrateren. Zorg moeten worden genomen om de vorming van luchtbellen te voorkomen en om de oplossing toe te passen in het midden van de put, zo dicht mogelijk bij de bodem als mogelijk, om de sleuf gelijkmatig te dekken. Burst een luchtbel per ongeluk geïntroduceerd met een pipet tip.
7. Wijzig de stroomklep om de vele bloot te stellen aan zowel de lucht en het vacuüm, op de pomp beurt, en zachtjes de buffer afvoer uit de bronnen door er een vinger over de haven blootgesteld aan de lucht tot het bedrag van vacuüm te reguleren.
8. Wijzig de stroomklep om de vele bloot aan de lucht zodra de buffer volledig heeft uitgeput van alle putten. Zet de pomp of de stekker uit het vacuüm.
9. Van toepassing zijn 200 ul van elke standaard of vaccin monsterverdunning per well. Pipet monsters een voor een, in het midden van elk putje, zo dicht mogelijk bij de bodem mogelijk te maken, en zorg ervoor voorkomen dat er luchtbellen. Burst een luchtbel per ongeluk geïntroduceerd met een pipet tip. Doe 200 ul van monsterverdunning buffer (4M ureum / TBS of 0,01% Zwittergent / TBS) in ongebruikte putten om een ​​goede stofzuiger ervoor te zorgen dat de putten in gebruik is.
10. Stel het debiet ventiel om het verdeelstuk bloot te stellen aan zowel de lucht en het vacuüm. Zet de pomp (of sluit het vacuüm) en voorzichtig laat de monsters volledig uit de bronnen afvoer door de hoeveelheid van het vacuüm met een vinger over de haven blootgesteld aan lucht. Haal de vinger van de haven naar het vacuüm op te heffen zodra alle monsters hebben afgevoerd.
11. Onmiddellijk voeg 200 ui van TBS aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Breng een zachte vacuüm drain en de putjes te wassen door de hoeveelheid van het vacuüm met een vinger over de haven blootgesteld aan lucht.
12. Herhaal de wasstap beschreven in stap 4.11. Zodra de putten volledig zijn drooggelegd, draait u de schroeven van het monster sjabloon en zet de stofzuiger om te voorkomen uitdrogen van de putten. Onmiddellijk naar het membraan te verwijderen.
13. Plaats het membraan in blokkeerbuffer en incubeer overnacht bij 4 ° C, met zachte wiegen. Gebruik voldoende blokkeerbuffer volledig te bedekken het membraan.

5. Immunoblotting van de HA en NA-antigenen

1. Naar aanleiding van de overnacht incubatie in het blokkeren van buffer, twee keer was het membraan gedurende 5 minuten met TBS/0.1% Tween-20 wasbuffer. Voor alle wassingen en incubaties, zorgen voor de membraan is volledig bedekt met de oplossing.
2. Incubeer het membraan met een universele konijn antilichaam tegen HA (zoals Uni-1) of NA (zoals HCA-2 of HCA-3) verdund in 5% w / v BSA in wasbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur, met een zacht schommelen. Optimale antilichaamconcentraties behoeft te worden vastgesteld voor elk antilichaam voorraad. Verdunningen van 1:4000 van konijn anti-serum gaf optimale resultaten voor de bovengenoemde antilichamen.
3. Was het membraan drie keer, bij kamertemperatuur met een zacht schommelen gedurende 15 minuten per keer, op een ongebonden primaire antilichamen te verwijderen.
4. Incubeer het membraan met een HRP-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam. Gebruik een 1:50000 verwatering van de Thermo ImmunoPure geit anti-konijn IgG, peroxidase geconjugeerd antilichaam in de blokkeerbuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten met zachte wiegen.
5. Was het membraan drie keer, schommelen gedurende 15 minuten per keer, bij kamertemperatuur met wasbuffer aan een ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
6. Was het membraan met TBS gedurende 5 minuten met een zachte wiegen van de resterende Tween-20 reinigingsmiddel te verwijderen van het membraanoppervlak.
7. Bereid de ondergrond met 3 ml van elk reagent van de Supersignal West Dura langere duur Substrate kit van Thermo Scientific en meng goed.
8. Plaats het membraan op een droge tissue papier om voorzichtig te verwijderen overtollig TBS-buffer.
9. Overdracht van het membraan tot een droge container en voeg de ondergrond om de hele membraan te dekken. Incubeer 5 minuten met zachte wiegen, bij kamertemperatuur.
10. Verwijder de overmaat substraat door voorzichtig blotting het membraan op vloeipapier.
11. Expose het membraan van een chemiluminescentie film. De lengte van de blootstelling zal moeten worden geoptimaliseerd om het signaal verzadiging te voorkomen, maar zal doorgaans variëren van 10 seconden tot 10 minuten.
12. Voer densitometrie analyses over de ontwikkelde film met behulp van een gel imaging apparaat zoals de Fluorchem gel documentatiesysteem (Alpha Innotech) volgens de instructies van de fabrikant. De dichtheid waarden voor elke set van herhalingen van de referentie-antigenen en testen vaccin monsters worden vervolgens gemiddeld. Terwijl het antigeen normen en vaccin monsters kunnen worden uitgevoerd in duplo, triplo zijn voorkeur. Densiteitswaarden voor de duplo's moeten zeer vergelijkbaar zijn. Significante verschillen tussen repliceert duiden op een waarschijnlijke technisch probleem tijdens de procedure. Een concentratie-afhankelijke standaard curve wordt vastgesteld door het plotten van de gemiddelde dichtheid van waarden ten opzichte van de hoeveelheid (in ng) van HA of NA antigeen zetten in elke sleuf, van de referentie-standaard. Met behulp van geschikte calibratie curve fitting in immunoassays is van cruciaal belang voor het kwantificeren van HA en NA nauwkeurig. Lineaire regressie, verkregen door het uitzetten van de respons (y) ten opzichte van de concentratie (x) met behulp van het lineaire gedeelte van de respons curve (y = mx + b) is de eenvoudigste methode voor de kwantificering van de analyten. Als er een breder scala van analyten wordt beschouwd voor de concentratie berekenen, moeten de vier parameter logistiek (4PL) model voor immunoassays op dit moment geaccepteerd worden gebruikt. Een verscheidenheid aan software is beschikbaar voor geïnteresseerde onderzoekers om te overwegen. In het geval van de beschreven slot blot-test, het omzetten van de x-as waarden op schaal loggen kan de bocht mee naar een 4-PL-model en het gebruik van een variabele helling niet-lineaire regressie te passen aan de uitgewist hoeveelheden HA en NA berekenen de geteste vaccin monsters is dus mogelijk. We daarom routinematig gebruiken dit model voor onze analyses. Als de test vaccin monsters werden verdund in een van beide 4M ureum / TBS of 0,01% Zwittergent / TBS alvorens te worden uitgewist op het membraan, de verdunningsfactor voor elk monster moet rekening worden gehouden met het bepalen van de HA en NA de inhoud van de originele test vaccin monsters. Er wordt gesuggereerd dat elke test vaccin monster worden uitgevoerd op drie verschillende verdunningen (2-voudig verschil) om voor een set van de dichtheid van waarden vallen binnen de standaard curve. Dichtheid van hogere waarden dan de standaard curve bereik voor alle geteste verdunningen van het vaccin monsters moet verder worden verdund voor een nauwkeurige HA of NA kwantificering. Als dichtheid van waarden onder de laagste einde van de curve, te testen monsters worden verdund tot een lagere verdunningsfactor.

6. Representatieve resultaten:

Bioinformatica analyses van alle beschikbare influenza-A-HA sequenties bevestigd dat de N-terminus van de HA2 subeenheid (de fusie peptide) als de enige geconserveerd gebied van HA. Figuur 1 toont het behoud tarief voor elk aminozuur positie van de geïdentificeerde consensus sequentie. Twee varianten werden geïdentificeerd op de posities 2 (L-> I) en 12 (G-> N) van de 14 N-terminale aminozuren van HA2, maar dergelijke afwijkingen werden gevonden niet aan de binding tussen de antilichamen en de peptide varianten ^zes invloed . De Uni-1 epitoop (GLFGAIAGFIEGGW) werd gekozen om een ​​universele antistof te ontwikkelen tegen HA. Dit antilichaam toonde opmerkelijke specificiteit voor virale sequenties en is in staat te binden aan 13 verschillende subtypes van het influenza A HA (H1-H13) (figuur 2).

Met behulp van een soortgelijke aanpak, werden twee universeel geconserveerde sequenties die in alle influenza A-NA, een dicht bij het enzymatisch actieve site (HCA-2) (figuur 3A) en de andere aan de N-terminus (HCA-3) (Figuur 3B) . Peptiden met deze aminozuursequenties werden gebruikt als antigenen om de universele antistoffen tegen NA genereren. De antilichamen tegen zowel epitopen in staat waren te binden aan alle negen subtypen van NA en toonde weinig kruisreactiviteit voor allantoïsche of cellulaire eiwitten, aldus aan te tonen een hoge specificiteit voor virale NA sequenties (figuur 4).

Figuur 5 geeft een overzicht van de sleuf blot methode voor de kwantificering van influenza HA en NA.

Voorbeelden van HA en NA antigeen-slot-blot-analyse zijn weergegeven in de figuren 6 en 7. Figuur 6A en 6C toont representatieve resultaten na de detectie van het antigeen HA in een griepvaccin referentiestandaard en vaccin monsters respectievelijk. Elk monster (standaard of vaccin) werd gelopen in tweevoud, in aangrenzende putten. Duplicaten moet blijken similar intensiteiten na detectie. Optimalisatie van antilichaam verdunningen, incubatie en belichtingstijd kan nodig zijn afhankelijk van de gebruikte antilichamen.

Een voorbeeld van een typische standaardcurve verkregen na de ontdekking van verschillende concentraties van HA van een vaccin referentiestandaard monster wordt weergegeven in figuur 6B. De concentratie van HA-antigen is evenredig met de intensiteit van het signaal volgende chemiluminescentie detectie van de sleuf blot en past in het 4-PL curve fitting model voor deze concentratie bereik (0,0938 tot 6 microgram HA / ml).

Figuur 7 toont representatieve resultaten van de detectie van de NA antigeen in een griepvaccin referentie-standaard en in het vaccin monsters. Dichtheid analyse toonde aan dat de intensiteit van het signaal dat wordt verkregen door het detecteren van de NA antigen in verschillende verdunningen van een vaccin referentie-standaard door sleuf blot is evenredig aan de concentratie van NA (Fig. 7A). De resulterende standaardcurve past een 4-PL model voor deze concentratie range (0,039 tot 10 microgram NA / ml), zoals weergegeven in figuur 7B. Figuur 7C toont een voorbeeld van een slot blot analyse van de NA-gehalte in griepvaccin monsters. Elk monster werd in tweevoud, in aangrenzende putten.

Figuur 1. Behoud tarief van de Uni-1 epitoop in de fusiepeptide gebied van influenza A HA.
Bioinformatica analyses van alle beschikbare influenza-A-HA sequenties bevestigd dat de fusie peptide (gelegen aan de N-terminus van de HA2 subunit) is het enige universeel geconserveerd gebied van HA. Merk op dat de twee varianten op positie 2 (L-> I) en 12 (G-> N) bleken nog niet aan het antilichaam binden ^zes beïnvloeden. Een universele antilichaam dat in staat is te binden 13 verschillende subtypes van het influenza A HA (H1-H13) werd ontwikkeld met behulp van de Uni-1 epitoop (GLFGAIAGFIEGGW).

Figuur 2. Detectie van 13 subtypen van HA door de universele antilichaam tegen HA.
Allantoïsvocht van 13 subtypen van het influenza A-virussen gekweekt in bevruchte eieren werden gefractioneerd in SDS-PAGE, gevolgd door detectie van de HA-eiwitten met behulp van de universele antilichaam tegen de Uni-1 epitoop van HA. NP eiwit werd gedetecteerd als het laden van controle met behulp van een konijn polyklonaal NP-specifiek antilichaam. Negatieve controle (-) was allantoïsvocht van niet-geïnfecteerde eieren. Positieve controle (+) was een referentiestandaard van H1 uit NIBSC, Verenigd Koninkrijk

Figuur 3. Sequentiehomologie van influenza A NA de buurt van het enzymatisch actieve plaats en de N-terminus.
Twee universeel geconserveerde sequenties werden geïdentificeerd in het influenza A NA's door bio-informatica, een in de buurt van de enzymatische actieve plaats (HCA-2) (Panel A), de andere op de N-terminus (HCA-3) (Panel B). Peptiden met deze geconserveerde aminozuursequenties werden gesynthetiseerd en gebruikt om universele antistoffen tegen NA genereren.

Figuur 4. Detectie van 9 subtypen van NA door NA antilichamen.
Allantoïsvocht van negen NA subtypes van het influenza A-virussen gekweekt in bevruchte eieren werden gefractioneerd in SDS-PAGE, gevolgd door detectie van de NA eiwitten met behulp van de HCA-2 (Panel A) en HCA-3 (Panel B) antilichamen. NP eiwit werd gedetecteerd als het laden van controle met behulp van een konijn polyklonaal NP-specifiek antilichaam (Panel C). Negatieve controle (-) was allantoïsvocht van niet-geïnfecteerde eieren. Positieve controle (+) was allantoïsvocht verrijkt met rNA1 van de A / New Caledonia/20/99 en gemerkt met de bijbehorende antisera.

Figuur 5. Stroomschema van de sleuf blot procedure voor de kwantificering van de HA en NA antigenen in griepvaccins.
De buffers die nodig is voor monsterverdunning evenals voor het wassen en het blokkeren van het slot blot membraan worden eerst voorbereid en de PVDF-membraan en filter papieren die nodig zijn voor de assemblage van de Bio-Dot SF microfiltratie apparatuur zijn pre-doorweekt. Griepvaccin en referentie standaard monsters worden verdund in de optimale buffers voor HA of NA detectie door sleuf blot. De Bio-Dot SF microfiltratie apparatuur is gemonteerd volgens instructies van de fabrikant en de monsters worden aangebracht op het PVDF membraan. HA en NA antigenen worden gedetecteerd met behulp van de universele antilichamen tegen elk antigeen. Densitometrie analyse is uitgevoerd op de chemiluminescentie signalen verkregen voor kwantificering van HA en NA in de geteste monsters.

Figuur 6. Detectie van de HA-antigeen in griepvaccin monsters en verwijzenlingen standaard.
Paneel A toont een vertegenwoordiger blot verkregen na immunodetectie van de HA antigeen. De HA referentie-antigeen werd verdund tot concentraties 0-6 microgram HA / ml en de vaccins waren om een ​​concentratie van 0,375 microgram HA / ml verdund in 4M ureum / TBS alvorens te worden toegepast op een PVDF membraan met een Bio-Dot SF microfiltratie apparatuur . De HA antigen werd vervolgens gedetecteerd met behulp van de Uni-1 universele antilichaam. Panel B geeft een voorbeeld van een standaard curve verkregen door het detecteren van signalen van verschillende HA concentraties van een vaccin referentiestandaard. De intensiteit van het signaal is evenredig met de concentratie van de HA en de curve past een 4-PL-model.

Figuur 7. Detectie van de NA antigeen in griepvaccin monsters en referentie-standaard.
Paneel A en B tonen vertegenwoordiger signalen verkregen na de ontdekking van NA in een griepvaccin referentiestandaard verdund tot NA concentraties van 0 tot 10 pg NA / ml in 0,01% Zwittergent / TBS en de daaruit voortvloeiende 4-PL standaard curve volgende densitometrie analyses. Een voorbeeld van de typische chemiluminescentie signalen waargenomen na een slot-blot-analyse van NA antigeen in vaccin tegen griep monsters is te zien in Configuratiescherm C. Influenza vaccin monsters werden verdund tot een concentratie van 1 ug HA / ml in 0,01% Zwittergent / TBS en werden geblot op een PVDF membraan met behulp van een Bio-Dot SF microfiltratie apparatuur. Verdunningen van de overeenkomstige vaccin referentie-standaard, met concentraties variërend van 0 tot 2,5 pg NA / ml, werden opgenomen op dezelfde blot om een ​​standaard curve voor de kwantificering van de NA antigeen in het vaccin monsters vast te stellen. De NA antigen werd gedetecteerd met de HCA-2 universele antilichaam tegen NA en densitometrie analyse van de chemiluminescentie signalen verkregen werd uitgevoerd. De hoeveelheid van NA in elk vaccin monster kan worden berekend ten opzichte van de 4-PL standaard curve verkregen door het uitzetten van de signaal intensiteit van waarden ten opzichte van de NA concentratie voor het vaccin referentiestandaard.

Discussion

Kwantitatieve bepaling van influenza virale HA en NA zijn van cruciaal belang voor het onderzoek naar vaccins en ontwikkeling sinds deze twee oppervlakte-eiwitten zijn de belangrijkste virale componenten induceren van immuunreacties ^6-11. Eerder gerapporteerde immunologische methoden voor de detectie van deze eiwitten nodig stam specifieke antilichamen. De eenvoudige, reproduceerbare en snelle slot blot methode om de HA en NA-antigenen hier beschreven kwantificeren zijn geschikt voor alle influenza-A-virale HA en NA eiwitten, omdat de antilichamen herkennen hun enige universeel geconserveerde epitopen ^6-8. De enige moeilijkheid voor onderzoekers geïnteresseerd zijn in deze methode zou kunnen zijn dat zij geen universele antistoffen in huis te hebben. Echter, het genereren van deze antilichamen met behulp van peptiden als antigenen is een routine procedure. Terwijl de geïnteresseerde wetenschappers kunnen de antilichamen zelf te maken volgens de beschreven procedures, omdat de varianten peptiden concurreren even goed onderling voor binding aan de gegeven peptide in een competitieve ELISA ^6-8, kunnen zij ook contact opnemen met de auteurs voor de HA en NA antilichamen worden gebruikt in hun verkennend onderzoek.

Voor zover de sleuf blot test betreft, is het nogal eenvoudig, met speciale aandacht nodig is op slechts een steenworp afstand, zoals hierboven beschreven. Hoewel de HA en NA konden beide worden ontdekt in onbehandelde monsters, werd een verhoogde gevoeligheid bereikt door een voorbehandeling van de monsters.

Ondanks de voordelen van eenvoud, snelheid en reproduceerbaarheid, de universele antilichaam-gebaseerde slot blot hier beschreven methoden hebben bepaalde beperkingen. Bijvoorbeeld, zijn ze niet ontworpen om verschillende HA of NA subtypes te onderscheiden en als zodanig, zijn mogelijk meer geschikt voor in-proces kwaliteitscontrole en / of analyses van monovalent vaccin preparaten. De SRID test blijft dus de methode van keuze om subtypes van virale HA identificeren griepvaccins ^3.

Kortom, de sterk geconserveerde sequenties in HA en NA geselecteerd om mono-specifieke antilichamen, die kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve analyses van vrijwel alle stammen van het influenza virus HA en NA te genereren. Hoewel de wijze waarop slot blot-procedure met deze universele antilichamen tegen HA en NA wordt hier gepresenteerd, kunnen geïnteresseerde onderzoekers gebruiken ze als een fundamenteel onderzoek tool in andere soorten immunoassay, gezien het feit dat ze opmerkelijke specificiteit tegen virale sequenties aangetoond zonder aantoonbare cross-reactiviteit met allantoïs of cellulaire eiwitten. Ook van belang is dat de universele antilichamen tegen HA HA kan detecteren in natieve conformatie in virus-geïnfecteerde celculturen ^12, die een breder scala van toepassingen van deze antilichamen als fundamenteel onderzoek tools hoogtepunten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus	Bio-Rad	170-6542
Bio-Dot SF Filter paper	Bio-Rad	162-0161
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF)	EMD Millipore	IPFL00010
Vacuum pump	EMD Millipore	WP6111560
Chemiluminescence BioMax Light Film	Kodak	178 8207
FluorChem Gel Documentation System	Alpha Innotech	29-008-1896X
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens		Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA)	Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen	CBER/FDA or NIBSC
Influenza vaccine samples			Commonly available in most countries
Urea	Sigma-Aldrich	U1250
Zwittergent 3-14 Detergent	Calbiochem	693017
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated	Thermo Fisher Scientific, Inc.	31460
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34075