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Immunology and Infection

सभी इन्फ्लुएंजा के मात्रात्मक विश्लेषण सरल स्लॉट ब्लाट Assays में एक वायरल Hemagglutinins और यूनिवर्सल एंटीबॉडी का उपयोग कर Neuraminidases प्रकार

Published: April 4, 2011 doi: 10.3791/2784
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1,3,4, 1, 5, 5, 1,3
1Centre for Vaccine Evaluation, Biologics and Genetic Therapies Directorate, HPFB, Health canada, 2National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, The State Food and Drug Administration, Beijing, 3Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 4Microbiology Department, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University, 5National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

एक सरल स्लॉट दाग विधि इन्फ्लूएंजा वायरल hemagglutinin और neuraminidase सार्वभौमिक उनके सबसे संरक्षित जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के माध्यम से की पहचान दृश्यों लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी का उपयोग कर की मात्रा का ठहराव के लिए विकसित किया गया था. इस नए दृष्टिकोण सभी वायरल hemagglutinin और neuraminidase के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान कर सकता है.

Protocol

1. अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी

  1. स्लॉट दाग प्रक्रिया शुरू करने से पहले, Tris-buffered खारा (20 मिमी Tris, 137 मिमी NaCl, पीएच 7.6) Zwittergent (टीबीएस), या hemagglutinin हा, स्लॉट दाग, या 0.01% की 20_mls के लिए में 4M यूरिया समाधान के 20_mls तैयार neuraminidase के लिए टीबीएस, या NA, स्लॉट दाग में समाधान. है जबकि 4M यूरिया हर बार नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए, 10% 2 हे DH में Zwittergent शेयर समाधान कमरे के तापमान पर कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर है और इसलिए टीबीएस में 0.01% प्रत्येक परख से पहले पतला कर सकते हैं.
  2. टीबीएस 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता को हल करने के लिए 20-बीच जोड़ने द्वारा 2000 mls धोने बफर के तैयार हो जाओ. 80 mls के अवरुद्ध बफर बफर धोने में एक 5% की w / ध् अंतिम एकाग्रता के लिए मलाई निकाला दूध पाउडर (ग्रेड गैर वसा शुष्क दूध सोख्ता) भंग करके तैयार करें.
  3. 15 सेकंड के लिए मेथनॉल में PVDF झिल्ली (एक 9 x 12 सेमी आकार के लिए पूर्व में कटौती), एक 2 मिनट द्वारा बाद सक्रिय DDH ओ 2 में कुल्ला टीबीएस में उपयोग करें जब तक झिल्ली लेना. पूर्व गीला जैव डॉट टीबीएस में एस एफ फिल्टर पेपर के 3 चादरें जब तक इस्तेमाल किया.

2. इन्फ्लूएंजा टीका नमूने और हा स्लॉट दाग के लिए संदर्भ मानक तैयार

पूर्व निर्धारित हा टीका उपभेदों के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए इसी सामग्री के साथ इन्फ्लूएंजा टीका संदर्भ मानकों Biologics मूल्यांकन और रिसर्च (CBER / एफडीए, संयुक्त राज्य अमरीका) या जैव मानक और नियंत्रण के लिए राष्ट्रीय संस्थान (NIBSC, ब्रिटेन) के लिए केंद्र से प्राप्त किया गया और स्लॉट दाग द्वारा हा मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया कर रहे हैं. जांचकर्ताओं को भी अपने स्वयं के प्रतिजन की स्थापना के रूप में संदर्भ 9 और 10 में वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग कर मानकों को तैयार कर सकता है.

  1. हा संदर्भ एंटीजन परीक्षण और टीके के नमूने के लिए: 0, .०,९३८, ०.१८७५, 0.375, 0.75, 1.5, 3 और 6 μg हा / मिलीलीटर: निम्न सांद्रता 4M यूरिया / टीबीएस में हा संदर्भ प्रतिजन शेयर पतला. अच्छी तरह मिक्स. फिर, परीक्षण टीका निर्माताओं से प्राप्त या 4M यूरिया / टीबीएस में वैज्ञानिक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए घर में बनाया मानव उपयोग के लिए वैक्सीन के नमूने पतला और मिश्रण अच्छी तरह से. जबकि संदर्भ प्रतिजन और वैक्सीन के नमूने के डुप्लिकेट को चलाया जा सकता है, triplicates पसंद कर रहे हैं. प्रत्येक नमूने के 3 dilutions (2 गुना अंतर) तैयार नमूना एकाग्रता मानक वक्र के भीतर गिर करने के लिए अनुमति देते हैं. 450 प्रत्येक संदर्भ प्रतिजन या परीक्षण टीका नमूना डुप्लिकेट चलाने या क्रमशः triplicates कमजोर पड़ने के μl या 650 μl तैयार करें. Monovalent इन्फ्लूएंजा एक टीके इस स्लॉट दाग विधि के साथ परीक्षण किया जा सकता है. संदर्भ प्रतिजनों के हा सामग्री पहले SRID है जो वर्तमान में इस्तेमाल किया इन्फ्लूएंजा टीका की तैयारी के लिए मानक परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था. हा सामग्री SRID द्वारा निर्धारित प्रारंभिक संदर्भ स्लॉट दाग मानक वक्र के लिए dilutions की तैयारी के लिए प्रतिजन शेयर हा एकाग्रता के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

3. इन्फ्लूएंजा टीका नमूनों और संदर्भ मानक के एनए स्लॉट दाग के लिए तैयार

इन्फ्लूएंजा टीका टीका उपभेदों के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए इसी संदर्भ मानकों Biologics मूल्यांकन और रिसर्च (CBER / एफडीए, संयुक्त राज्य अमरीका) या जैव मानक और नियंत्रण (NIBSC, ब्रिटेन) के लिए राष्ट्रीय संस्थान के लिए केन्द्र से प्राप्त किया गया और एनए मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया कर रहे हैं स्लॉट दाग के द्वारा. इन नमूनों की संदर्भ सामग्री एनए densitometry स्कैनिंग विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में एसडीएस पृष्ठ deglycosylated नमूनों का विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, के रूप में 9 पहले से मामूली 10 संशोधनों के साथ वर्णित है. संक्षेप में, deglycosylated टीका संदर्भ नमूने (5 μg) नमूना बफर के साथ मिलाया गया और जेल पर लोड. जेल 20 मा लगभग 90 मिनट के लिए चलाया गया था ट्रैकिंग डाई तक सिर्फ जेल के बाहर चला, Sypro धुंधला द्वारा पीछा किया. प्रोटीन की मात्रा का ठहराव Densitometry Fluorchem जेल प्रलेखन प्रणाली (अल्फा Innotech) का उपयोग किया गया. एनए की राशि एनए प्रोटीन की कुल के रूप में Lowry परख द्वारा निर्धारित प्रोटीन के अनुपात पर आधारित निर्धारित किया गया था. संदर्भ इस पद्धति का उपयोग करने के लिए तैयार नमूने तो टीके निर्माताओं से एनए सामग्री का टीका नमूनों में मात्रा का ठहराव के लिए स्लॉट दाग में इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. एनए संदर्भ एंटीजन परीक्षण और टीके के नमूने के लिए: 0, 0.039, 0.078, .१५६२, .3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 और 10 μg / एनए मिलीलीटर: 0.01% में / Zwittergent टीबीएस निम्न सांद्रता के एनए संदर्भ प्रतिजन शेयर पतला. अच्छी तरह मिक्स. फिर, परीक्षण टीका निर्माताओं से प्राप्त या 0.01% Zwittergent टीबीएस / में वैज्ञानिक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए घर में बनाया मानव उपयोग के लिए वैक्सीन के नमूने पतला और मिश्रण अच्छी तरह से. जबकि संदर्भ प्रतिजन और वैक्सीन के नमूने के डुप्लिकेट को चलाया जा सकता है, triplicates पसंद कर रहे हैं. प्रत्येक नमूने के 3 dilutions (2 गुना अंतर) तैयार नमूना एकाग्रता मानक वक्र के भीतर गिर करने के लिए अनुमति देते हैं. 450 प्रत्येक संदर्भ प्रतिजन या परीक्षण टीका नमूना डुप्लिकेट चलाने या क्रमशः triplicates कमजोर पड़ने के μl या 650 μl तैयार करें. Monovalent इन्फ्लूएंजा एक टीके बुद्धि परीक्षण किया जा सकता हैज इस स्लॉट दाग विधि.

4. जैव डॉट एस एफ Microfiltration और नमूने के तंत्र सोख्ता PVDF झिल्ली पर विधानसभा

  1. पहले साफ और सूखे जैव डॉट एस एफ Microfiltration तंत्र इकट्ठा. वैक्यूम कई गुना गैसकेट समर्थन में थाली प्लेस और 3 पाल बांधने की रस्सी से अधिक जैव डॉट एस एफ फिल्टर पेपर शीट सिक्त top.Place पर सील गैसकेट जगह पूर्व लथपथ PVDF झिल्ली के द्वारा पीछा किया. झिल्ली और उंगली कस चार screws एक विकर्ण पार पैटर्न का उपयोग करने के लिए झिल्ली सतह पर दबाव के समान आवेदन को सुनिश्चित करने के शीर्ष पर नमूना टेम्पलेट रखें.
  2. सत्यापित करें कि 3 तरह वाल्व पंप पर मोड़ और वैक्यूम जोड़ने से पहले ही वैक्यूम स्रोत वैक्यूम कई गुना का पर्दाफाश करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
  3. पंप पर मुड़ें और जैव - डॉट तंत्र से कनेक्ट. यकीन है कि प्रवाह वाल्व नमूना नमूने के तेजी से और उचित जल निकासी के लिए निम्न चरणों में कुओं के नीचे एक स्तर पर तैनात है.
  4. पेंच कस विकर्ण पार पैटर्न का उपयोग कर कदम दोहराएँ. शिकंजा कस जबकि निर्वात लागू किया जाता है एक तंग सील यह सुनिश्चित करता है और कुओं के बीच पार संक्रमण से बचाता है.
  5. हवा वैक्यूम कई गुना बेनकाब और बंद पंप बारी प्रवाह वाल्व बदलें.
  6. टीबीएस के 100 μl सभी एक multichannel pipettor का उपयोग करने के लिए इस प्रकार प्रतिजन की वर्दी बाध्यकारी सुनिश्चित करने झिल्ली rehydrate के कुओं को लागू करें. देखभाल के लिए बुलबुले के गठन से बचने के लिए और अच्छी तरह से बीच में समाधान को लागू करने के लिए, के रूप में नीचे के करीब संभव के रूप में लिया जाना चाहिए क्रम में स्लॉट समान रूप से कवर. Accidently एक pipettor टिप के साथ शुरू किसी भी हवाई बुलबुले फट.
  7. बदलें प्रवाह वाल्व कई गुना करने के लिए दोनों हवा और वैक्यूम करने के लिए पर्दाफाश, पंप पर बारी, और हवा के संपर्क में वैक्यूम की राशि को विनियमित पोर्ट पर एक उंगली डाल कर धीरे कुओं से बफर नाली.
  8. बदलें प्रवाह वाल्व हवा के लिए कई गुना के रूप में जल्द ही के रूप में बफर पूरी तरह से सभी कुओं से सूखा है बेनकाब. बंद पंप चालू या वैक्यूम डिस्कनेक्ट.
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति टीका या नमूना कमजोर पड़ने मानक के 200 μl लागू करें. Pipet एक समय में प्रत्येक अच्छी तरह के केंद्र में एक नमूने के रूप में संभव के रूप में नीचे के करीब है, हवाई बुलबुले शुरू करने से बचने के ख्याल रख रही. Accidently एक pipettor टिप के साथ शुरू किसी भी हवाई बुलबुले फट. प्रयोग में कुओं को उचित निर्वात सुनिश्चित नमूना अप्रयुक्त कुओं में कमजोर पड़ने बफर (4M यूरिया टीबीएस / या 0.01% Zwittergent / टीबीएस) के 200 μl रखो.
  10. प्रवाह वाल्व समायोजित दोनों हवा और वैक्यूम के लिए कई गुना बेनकाब. पंप (या वैक्यूम रीकनेक्ट) पर मुड़ें और धीरे नमूने पूरी तरह से हवा के संपर्क में पोर्ट पर एक उंगली के साथ वैक्यूम की राशि को नियंत्रित करने के द्वारा कुओं से नाली की अनुमति है. बंदरगाह से उंगली निकालें निर्वात रिलीज के रूप में जल्द ही के रूप में सभी नमूनों सूखा है.
  11. तुरंत अच्छी तरह से एक multichannel pipettor का उपयोग कर प्रत्येक करने के लिए टीबीएस के 200 μl जोड़ें. नाली और हवा के संपर्क में पोर्ट पर एक उंगली के साथ वैक्यूम की राशि को नियंत्रित करने के द्वारा कुओं धोने के लिए एक सौम्य निर्वात लागू करें.
  12. धोने 4.11 कदम में वर्णित कदम दोहराएँ. जैसे ही कुओं पूरी तरह से सूखा है, नमूना टेम्पलेट का शिकंजा ढीला और बंद वैक्यूम बारी कुओं overdrying से बचने के. तुरंत झिल्ली को दूर करने के लिए आगे बढ़ें.
  13. बफर अवरुद्ध में झिल्ली प्लेस और 4 में रात सेते ° सी, कोमल कमाल के साथ. पर्याप्त अवरुद्ध बफर का प्रयोग पूरी तरह से झिल्ली को कवर.

5. हा और एनए प्रतिजनों के Immunoblotting

  1. अवरुद्ध बफर में रातोंरात ऊष्मायन के बाद, झिल्ली TBS/0.1% बीच-20 धोने बफर के साथ दो बार 5 मिनट के लिए धो. सभी धोने और incubations के लिए सुनिश्चित करने के लिए, झिल्ली समाधान के साथ पूरी तरह से कवर किया जाता है.
  2. 5% w / v कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए बफर धोने में BSA में पतला हा (जैसे 1 विश्वविद्यालय के रूप में) या NA (जैसे HCA-2 या HCA-3) के खिलाफ एक सार्वभौमिक खरगोश एंटीबॉडी के साथ झिल्ली कोमल के साथ, सेते कमाल है. इष्टतम प्रतिरक्षी सांद्रता के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी स्टॉक के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है. 1:4000 विरोधी सीरम खरगोश के dilutions उपरोक्त एंटीबॉडी के लिए इष्टतम परिणाम दे दी है.
  3. झिल्ली तीन बार धो, 15 मिनट प्रत्येक समय के लिए कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर, किसी भी अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी हटाने.
  4. एक एचआरपी संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं. थर्मो ImmunoPure बकरी आईजीजी विरोधी खरगोश, peroxidase कोमल कमाल के साथ 30 मिनट के लिए बफर और कमरे के तापमान पर सेते हैं अवरुद्ध में संयुग्मित एंटीबॉडी के एक 1:50000 कमजोर पड़ने का उपयोग करें.
  5. झिल्ली तीन बार धो, 15 मिनट के लिए हर बार घोड़ा, कमरे के तापमान पर वाशिंग बफर के साथ किसी भी अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी हटाने.
  6. कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए टीबीएस के साथ झिल्ली धो झिल्ली सतह से अवशिष्ट बीच 20 डिटर्जेंट हटायें.
  7. प्रत्येक आर के 3 मिलीलीटर के साथ सब्सट्रेट तैयारपश्चिम Supersignal Dura थर्मो वैज्ञानिक और मिश्रण अच्छी तरह से विस्तारित अवधि सब्सट्रेट किट से eagent.
  8. प्लेस एक सूखी टिशू पेपर पर झिल्ली को धीरे से किसी भी अतिरिक्त टीबीएस बफर हटायें.
  9. एक सूखी कंटेनर के लिए झिल्ली स्थानांतरण और सब्सट्रेट जोड़ने के लिए पूरे झिल्ली को कवर. कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं.
  10. धीरे टिशू पेपर पर झिल्ली सोख्ता द्वारा अतिरिक्त सब्सट्रेट निकालें.
  11. Chemiluminescence फिल्म झिल्ली बेनकाब. जोखिम की लंबाई करने के लिए संकेत संतृप्ति से बचने, लेकिन आम तौर पर 10 सेकंड से 10 मिनट के लिए लेकर जाएगा अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी.
  12. विकसित एक जेल इमेजिंग Fluorchem जेल प्रलेखन निर्माता के निर्देशों का पालन प्रणाली (अल्फा Innotech) के रूप में इस तरह के तंत्र का उपयोग कर फिल्म पर densitometry विश्लेषण प्रदर्शन करना. संदर्भ एंटीजन परीक्षण और टीके के नमूने की प्रतिकृति के प्रत्येक सेट के लिए घनत्व मान तो औसतन हैं. जबकि प्रतिजन मानकों और वैक्सीन के नमूने डुप्लिकेट में चला जा सकता है, triplicates पसंद कर रहे हैं. प्रतिकृति के लिए घनत्व मान बहुत समान होना चाहिए. के बीच महत्वपूर्ण मतभेद प्रतिकृति प्रक्रिया के दौरान एक संभावित तकनीकी समस्या से संकेत मिलता है. एक एकाग्रता पर निर्भर मानक वक्र हा या NA संदर्भ मानक से प्रत्येक स्लॉट में डाल, प्रतिजन (एनजी) की राशि की तुलना में औसतन घनत्व मूल्यों की साजिश रचने के द्वारा स्थापित है. Immunoassays में उपयुक्त अंशांकन वक्र ढाले का उपयोग हा और एनए सही बढ़ाता के लिए महत्वपूर्ण है. रेखीय प्रतिगमन, एकाग्रता (एक्स) प्रतिक्रिया वक्र (y = mx + ख) के रैखिक भाग का उपयोग कर बनाम प्रतिक्रिया (y) की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त analytes की मात्रा का ठहराव के लिए सरल तरीका है. यदि analytes की एक व्यापक रेंज एकाग्रता की गणना के लिए माना जाता है, वर्तमान में स्वीकार immunoassays के लिए चार पैरामीटर रसद मॉडल (4PL) किया जाना चाहिए. सॉफ्टवेयर की एक किस्म पर विचार करने के लिए रुचि रखते जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध है. वर्णित स्लॉट दाग परख के मामले में, x-अक्ष मान पैमाने पर करने के लिए लॉग इन परिवर्तित वक्र एक 4-पी एल मॉडल और एक चर ढलान गैर रेखीय प्रतिगमन का उपयोग फिट करने में हा और एनए के blotted मात्रा की गणना की अनुमति देता है परीक्षण वैक्सीन के नमूने इस प्रकार संभव है. इसलिए हम नियमित रूप से हमारे विश्लेषण के लिए इस मॉडल का उपयोग करें. परीक्षण वैक्सीन के नमूने के रूप में या तो 4M यूरिया / टीबीएस या 0.01% / Zwittergent टीबीएस जा रहा है झिल्ली पर blotted करने से पहले पतला थे, प्रत्येक नमूना के लिए कमजोर पड़ने कारक को ध्यान में रखा जाना चाहिए हा और मूल परीक्षण के एनए सामग्री का निर्धारण वैक्सीन के नमूने. यह सुझाव दिया है कि प्रत्येक परीक्षण टीका नमूना घनत्व मूल्यों का एक सेट के लिए आदेश में तीन अलग अलग dilutions (2 गुना अंतर) में चलाए जा मानक वक्र के भीतर गिर. घनत्व मूल्यों वैक्सीन के नमूने के सभी परीक्षण dilutions के लिए मानक वक्र सीमा से अधिक सटीक हा या NA मात्रा का ठहराव के लिए आगे पतला होने की जरूरत है. यदि घनत्व मान वक्र के सबसे कम अंत से नीचे हैं, परीक्षण के नमूने कम कमजोर पड़ने कारक पर पतला होना चाहिए.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

बायोइनफॉरमैटिक्स सभी उपलब्ध इन्फ्लूएंजा ए हा दृश्यों के विश्लेषण केवल हा के संरक्षित क्षेत्र के रूप में HA2 सबयूनिट (संलयन पेप्टाइड) के एन टर्मिनस पुष्टि की. चित्रा 1 की पहचान की आम सहमति अनुक्रम के प्रत्येक एमिनो एसिड की स्थिति के लिए संरक्षण की दर से पता चलता है. दो रूपांतरों के दो पदों (एल> मैं) और 14 HA2 के एन टर्मिनल अमीनो एसिड (जी> एन) 12 में पहचान की गई है, लेकिन ऐसे परिवर्तनों एंटीबॉडी और पेप्टाइड 6 वेरिएंट के बीच बंधन को प्रभावित नहीं पाया गया . मिलान विश्वविद्यालय-1 (GLFGAIAGFIEGGW) हा के खिलाफ एक सार्वभौमिक एंटीबॉडी विकसित करने के लिए चुना गया था. इस एंटीबॉडी वायरल दृश्यों के लिए उल्लेखनीय विशिष्टता का प्रदर्शन किया और इन्फ्लूएंजा ए हा (H1 H13) (चित्रा 2) के 13 अलग अलग subtypes के लिए बाध्य करने में सक्षम है.

एक समान दृष्टिकोण का प्रयोग, दो सार्वभौमिक संरक्षित दृश्यों सभी एक एनए इन्फ्लूएंजा, enzymatically सक्रिय साइट (HCA-2) के लिए करीब (चित्रा 3A) और टर्मिनस एन (HCA-3) अन्य (3B चित्रा) में पहचान की गई . एनए के खिलाफ सार्वभौमिक एंटीबॉडी उत्पन्न इन एमिनो एसिड दृश्यों के साथ पेप्टाइड्स एंटीजन के रूप में इस्तेमाल किया गया. दोनों epitopes के खिलाफ एंटीबॉडी एनए के सभी 9 उपप्रकारों के लिए बाध्य करने में सक्षम थे और allantoic या सेलुलर प्रोटीन के लिए बहुत कम पार जेट से पता चला है, इस प्रकार वायरल एनए दृश्यों (चित्रा 4) के लिए उच्च विशिष्टता का प्रदर्शन.

चित्रा 5 इन्फ्लूएंजा हा और एनए की मात्रा का ठहराव के लिए स्लॉट दाग विधि के एक सिंहावलोकन से पता चलता है.

हा और एनए प्रतिजन स्लॉट धब्बा विश्लेषण के उदाहरण 6 और 7 के आंकड़े में दिखाया जाता है. चित्रा 6A और एक इन्फ्लूएंजा टीका संदर्भ मानक और वैक्सीन के नमूने क्रमशः में हा प्रतिजन का पता लगाने के बाद 6C प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है. प्रत्येक नमूना (मानक या टीका) दो प्रतियों में आसन्न कुओं में चलाया गया था. डुप्लिकेट simila दिखाने चाहिएपता लगाने के बाद तीव्रता आर. एंटीबॉडी dilutions, ऊष्मायन और जोखिम समय के अनुकूलन इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के आधार पर आवश्यक हो सकता है.

एक ठेठ मानक वक्र प्राप्त एक टीका संदर्भ मानक नमूना से हा के विभिन्न सांद्रता का पता लगाने के के बाद का एक उदाहरण चित्र 6B में दिखाया गया है. हा प्रतिजन की एकाग्रता स्लॉट दाग की chemiluminescence पता लगाने के बाद संकेत तीव्रता के लिए आनुपातिक है और इस एकाग्रता रेंज (०.०,९३८ से 6 μg / हा मिलीलीटर) के लिए 4-पी एल वक्र ढाले मॉडल फिट बैठता है.

7 चित्रा एक इन्फ्लूएंजा टीका संदर्भ मानक और टीका नमूनों में एनए प्रतिजन का पता लगाने के के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है. घनत्व विश्लेषण से पता चला है कि स्लॉट दाग द्वारा एक टीका संदर्भ मानक के विभिन्न dilutions में एनए प्रतिजन का पता लगाने के द्वारा प्राप्त संकेत की तीव्रता एनए (छवि 7A) की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है. परिणामस्वरूप मानक वक्र इस एकाग्रता रेंज (०.०३९ से 10 μg / एनए मिलीलीटर) के लिए एक 4-पी एल मॉडल के रूप में चित्रा 7B में दिखाया गया है फिट बैठता है. 7C शो इन्फ्लूएंजा टीका नमूनों में एक स्लॉट एनए सामग्री का धब्बा विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा. दो प्रतियों में प्रत्येक नमूना assayed आसन्न कुओं में.

चित्रा 1
चित्रा 1 विश्वविद्यालय 1 इन्फ्लूएंजा हा के संलयन पेप्टाइड क्षेत्र में मिलान के संरक्षण की दर .
सभी उपलब्ध इन्फ्लूएंजा ए हा पुष्टि की है कि संलयन पेप्टाइड (HA2 सबयूनिट के एन - टर्मिनस पर स्थित है) केवल हा की सार्वभौमिक संरक्षित क्षेत्र है दृश्यों के बायोइनफॉरमैटिक्स विश्लेषण. ध्यान दें कि स्थिति 2 में दो रूपों (एल> मैं) और 12 (जी> एन) 6 बाध्यकारी एंटीबॉडी को प्रभावित नहीं पाए गए . एक सार्वभौमिक बाध्यकारी इन्फ्लूएंजा एक हा (H1-H13) के 13 अलग अलग subtypes के लिए सक्षम एंटीबॉडी विश्वविद्यालय-1 मिलान (GLFGAIAGFIEGGW) का उपयोग कर विकसित किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2 हा खिलाफ सार्वभौमिक एंटीबॉडी द्वारा हा के 13 उपप्रकारों की जांच.
इन्फ्लूएंजा वायरस के 13 subtypes के Allantoic तरल पदार्थ embryonated अंडे में प्रचारित एसडीएस पृष्ठ में fractionated थे, हा हा के विश्वविद्यालय 1 मिलान के खिलाफ सार्वभौमिक एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा पीछा किया. एनपी प्रोटीन नियंत्रण लोड हो रहा है एक पॉलीक्लोनल खरगोश NP-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में खोजा गया था. नकारात्मक नियंत्रण (-) असंक्रमित अंडे से allantoic द्रव किया गया था. सकारात्मक नियंत्रण (+) NIBSC, ब्रिटेन से H1 की एक संदर्भ मानक था

चित्रा 3
चित्रा 3 इन्फ्लूएंजा एनए enzymatically सक्रिय साइट और एन टर्मिनस के पास के अनुक्रम समरूपता.
दो सार्वभौमिक संरक्षित दृश्यों में इन्फ्लूएंजा एनए एक जैव सूचना विज्ञान के द्वारा, एंजाइमी सक्रिय साइट (HCA-2) के पास स्थित (पैनल एक), एन टर्मिनस (HCA-3) (पैनल बी) पर अन्य की पहचान की गई. इन संरक्षित एमिनो एसिड दृश्यों के साथ संश्लेषित पेप्टाइड्स और एनए के खिलाफ सार्वभौमिक एंटीबॉडी पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4 एनए के 9 subtypes के एनए एंटीबॉडी द्वारा जांच.
इन्फ्लूएंजा वायरस के नौ एनए subtypes के Allantoic तरल पदार्थ embryonated अंडे में प्रचारित एसडीएस पृष्ठ में fractionated थे, एनए HCA-2 (एक पैनल) और HCA-3 (पैनल बी) एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा पीछा किया. एनपी प्रोटीन नियंत्रण लोड हो रहा है एक खरगोश पॉलीक्लोनल एनपी विशिष्ट एंटीबॉडी (पैनल सी) का उपयोग कर के रूप में खोजा गया था. नकारात्मक नियंत्रण (-) असंक्रमित अंडे से allantoic द्रव किया गया था. सकारात्मक नियंत्रण (+) allantoic rNA1 एक / नई Caledonia/20/99 के साथ बालीदार तरल पदार्थ था और इसी antisera के साथ जांच.

चित्रा 5
चित्रा 5 इन्फ्लूएंजा टीकों में हा और एनए प्रतिजनों के quantitation के लिए स्लॉट दाग प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट .
धोने और अवरुद्ध स्लॉट दाग झिल्ली के लिए के रूप में नमूना के रूप में अच्छी तरह से कमजोर पड़ने के लिए की जरूरत बफ़र्स पहले तैयार हैं और PVDF झिल्ली और फिल्टर जैव डॉट एस एफ microfiltration तंत्र की विधानसभा के लिए आवश्यक कागजात पूर्व भिगो कर रहे हैं. इन्फ्लूएंजा टीका और संदर्भ मानक नमूने हा या स्लॉट दाग द्वारा एनए का पता लगाने के लिए इष्टतम बफ़र्स में पतला कर रहे हैं. जैव डॉट एस एफ microfiltration उपकरण निर्माता के निर्देशों और नमूने हैं PVDF झिल्ली पर लागू करने के लिए अनुसार इकट्ठे है. हा और एनए प्रतिजनों प्रत्येक प्रतिजन के खिलाफ सार्वभौमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर पता चला रहे हैं. Densitometry विश्लेषण chemiluminescence हा और एनए के quantitation के लिए परीक्षण के नमूने में प्राप्त संकेतों पर किया जाता है.

चित्रा 6
चित्रा 6 हा प्रतिजन के इन्फ्लूएंजा टीका नमूनों में जांच और संदर्भित.खिलाडि़यों मानक.
कक्ष एक एक प्रतिनिधि दाग प्राप्त हा प्रतिजन के immunodetection के बाद से पता चलता है. हा संदर्भ प्रतिजन 0 से 6 μg से सांद्रता हा / मिलीलीटर और टीकों 4M यूरिया / टीबीएस में जैव डॉट एस एफ microfiltration तंत्र के साथ एक PVDF झिल्ली के लिए लागू किया जा रहा से पहले 0.375 μg / हा मिलीलीटर की एक एकाग्रता को पतला थे पतला था . हा प्रतिजन तो विश्वविद्यालय एक सार्वभौमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए पाया गया. पैनल बी एक मानक वक्र एक टीका संदर्भ मानक से विभिन्न हा सांद्रता के संकेतों का पता लगाने के द्वारा प्राप्त की एक उदाहरण दिखाता है. संकेत तीव्रता हा की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है और वक्र एक 4-पी एल मॉडल फिट बैठता है.

7 चित्रा
7 चित्रा इन्फ्लूएंजा टीका नमूनों और संदर्भ मानक में एनए प्रतिजन की जांच.
पैनल ए और बी शो प्रतिनिधि का संकेत है एक इन्फ्लूएंजा टीका संदर्भ NA 0.01% Zwittergent टीबीएस / और जिसके परिणामस्वरूप 4-पी एल मानक densitometry विश्लेषण निम्नलिखित वक्र में 0 से 10 μg / एनए मिलीलीटर को लेकर सांद्रता पतला मानक में एनए के पता लगाने के बाद प्राप्त है. ठेठ chemiluminescence इन्फ्लूएंजा टीका नमूनों में एक स्लॉट एनए प्रतिजन के दाग विश्लेषण के बाद पता चला संकेतों का एक उदाहरण पैनल सी. इन्फ्लुएंजा वैक्सीन के नमूने में दिखाया गया है थे 0.01% Zwittergent टीबीएस / में 1 μg / हा मिलीलीटर की एक एकाग्रता के लिए पतला और थे पर blotted PVDF झिल्ली जैव डॉट एस एफ microfiltration तंत्र का उपयोग कर. 0 से लेकर 2.5 μg / एनए मिलीलीटर सांद्रता के साथ इसी टीका संदर्भ मानक, के dilutions एक ही दाग ​​पर शामिल थे, क्रम में करने के लिए टीका नमूनों में एनए प्रतिजन के quantitation के लिए एक मानक वक्र स्थापित. एनए प्रतिजन एनए और chemiluminescence था प्रदर्शन प्राप्त संकेतों के densitometry विश्लेषण के खिलाफ HCA-2 सार्वभौमिक एंटीबॉडी के साथ पाया गया था. प्रत्येक वैक्सीन के नमूने में एनए की राशि 4-पी एल मानक एनए टीका संदर्भ मानक के लिए एकाग्रता की तुलना में संकेत तीव्रता मूल्यों की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त की वक्र के खिलाफ गणना की जा सकती है.

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Discussion

इन्फ्लूएंजा वायरल हा और एनए के मात्रात्मक निर्धारण के टीके के अनुसंधान और विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं के बाद से इन दो सतह प्रोटीन सबसे महत्वपूर्ण वायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6-11 उत्प्रेरण घटक हैं. इन प्रोटीनों का पता लगाने के के लिए पहले की रिपोर्ट प्रतिरक्षाविज्ञानी तरीकों तनाव विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता है. सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और तेजी स्लॉट दाग हा और एनए यहाँ वर्णित प्रतिजनों यों विधि सभी इन्फ्लूएंजा ए वायरल हा और एनए प्रोटीन के लिए उपयुक्त हैं के बाद से एंटीबॉडी उनके केवल सार्वभौमिक संरक्षित epitopes 6-8 पहचान . इस पद्धति में दिलचस्पी जांचकर्ताओं के लिए एकमात्र कठिनाई हो सकता है कि वे घर में ऐसी कोई सार्वभौमिक एंटीबॉडी है. हालांकि, इन एंटीबॉडी के एंटीजन के रूप में पेप्टाइड का उपयोग पीढ़ी के एक नियमित प्रक्रिया है. जबकि रुचि वैज्ञानिकों खुद एंटीबॉडी वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार क्योंकि वेरिएंट पेप्टाइड्स आपस में समान रूप से अच्छी तरह से एक प्रतिस्पर्धी 6-8 एलिसा में दिया पेप्टाइड के लिए बाध्य करने के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं, वे भी हा और एनए एंटीबॉडी के लिए लेखक से संपर्क हो सकता है उनकी खोजपूर्ण शोध में इस्तेमाल किया.

जहाँ तक के रूप में स्लॉट दाग परख का संबंध है, बल्कि यह स्पष्ट है, विशेष ध्यान के साथ केवल कुछ ही कदम पर आवश्यक रूप में ऊपर वर्णित है. हालांकि हा और एनए दोनों अनुपचारित नमूने में पाया जा सकता है है, वृद्धि की संवेदनशीलता के नमूनों का एक पूर्व उपचार के द्वारा प्राप्त किया गया था.

सादगी, तेज़ी और reproducibility के अपने फायदे के बावजूद, सार्वभौमिक एंटीबॉडी आधारित स्लॉट दाग यहाँ वर्णित विधियों कुछ सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, वे अलग हा या NA उपप्रकारों भेद नहीं और डिजाइन कर रहे हैं इस तरह के रूप में, गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया में और / या monovalent टीका तैयारी के विश्लेषण के लिए संभवतः अधिक उपयुक्त हैं. SRID परख इसलिए पसंद की विधि इन्फ्लूएंजा के तीन टीके में वायरल हा के उपप्रकार की पहचान बनी हुई है .

संक्षेप में, हा और एनए में अत्यधिक संरक्षित दृश्यों मोनो विशिष्ट एंटीबॉडी, जो इन्फ्लूएंजा वायरल हा और एनए के लगभग किसी भी उपभेदों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता उत्पन्न करने के लिए चुना गया है. जबकि हा और एनए के खिलाफ इन सार्वभौमिक एंटीबॉडी के साथ विस्तृत स्लॉट दाग प्रक्रिया यहाँ प्रस्तुत है, रुचि जांचकर्ताओं immunoassay के अन्य प्रकार में एक बुनियादी अनुसंधान उपकरण के रूप में उन्हें का उपयोग करें, दिया जा सकता है कि वे detectable पार जेट बिना allantoic साथ वायरल दृश्यों के खिलाफ उल्लेखनीय विशिष्टता का प्रदर्शन या सेलुलर प्रोटीन. नोट के अलावा है कि वायरस से संक्रमित कोशिका 12 संस्कृतियों, जो बुनियादी अनुसंधान उपकरण के रूप में इन प्रतिपिण्डों के आवेदनों की एक व्यापक रेंज पर प्रकाश डाला गया में हा खिलाफ सार्वभौमिक एंटीबॉडी देशी रचना में हा पता लगा सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि के संपादकीय समीक्षा के लिए श्रीमती मोनिका Tocchi धन्यवाद देना चाहूंगा. AMH किंग अब्दुलअ विश्वविद्यालय से एक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है, कनाडा में सऊदी अरब सांस्कृतिक ब्यूरो के माध्यम से.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus Bio-Rad 170-6542
Bio-Dot SF Filter paper Bio-Rad 162-0161
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) EMD Millipore IPFL00010
Vacuum pump EMD Millipore WP6111560
Chemiluminescence BioMax Light Film Kodak 178 8207
FluorChem Gel Documentation System Alpha Innotech 29-008-1896X
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen CBER/FDA or NIBSC
Influenza vaccine samples Commonly available in most countries
Urea Sigma-Aldrich U1250
Zwittergent 3-14 Detergent Calbiochem 693017
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk Bio-Rad 170-6404
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated Thermo Fisher Scientific, Inc. 31460
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 34075

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References

  1. Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
  3. Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
  4. Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
  5. Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
  6. Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
  7. Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
  8. Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
  9. Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
  10. Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
  11. Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
  12. Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 50 विषाणु विज्ञान इन्फ्लूएंजा hemagglutinin neuraminidase मात्रा का ठहराव सार्वभौमिक एंटीबॉडी

Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.

An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. A third affiliation was added for Anwar M. Hashem:

Microbiology Department, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University

सभी इन्फ्लुएंजा के मात्रात्मक विश्लेषण सरल स्लॉट ब्लाट Assays में एक वायरल Hemagglutinins और यूनिवर्सल एंटीबॉडी का उपयोग कर Neuraminidases प्रकार
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Gravel, C., Li, C., Wang, J.,… More

Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., He, R., Li, X. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), e2784, doi:10.3791/2784 (2011).

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