Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Summary

Um método simples blot slot foi desenvolvido para a quantificação da gripe hemaglutinina e neuraminidase viral utilizando anticorpos universal, direccionado para suas seqüências mais conservadas identificados através de análises de bioinformática. Esta abordagem inovadora pode fornecer uma alternativa útil para determinação quantitativa de todos os hemaglutinina e neuraminidase viral.

Abstract

Hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são duas proteínas de superfície do vírus da gripe que são conhecidos por desempenhar um papel importante no ciclo de vida viral ea indução de proteção ^1,2 respostas imunes. Como o principal alvo para anticorpos neutralizantes, HA é atualmente utilizada como marcador de potência da vacina de gripe e é medido por imunodifusão radial simples (SRID) ^3. No entanto, a dependência do SRID sobre a disponibilidade dos anti-soros correspondentes subtipo específico causa um mínimo de 2-3 meses de atraso para o lançamento de cada nova vacina. Além disso, apesar da evidência de que NA também induz imunidade protetora ^4, a quantidade de NA em vacinas contra a gripe ainda não é padronizada, devido à falta de reagentes apropriados ou método analítico ^5. Assim, simples métodos alternativos capazes de quantificar antígenos HA e NA são desejáveis ​​para a liberação rápida e melhor controle de qualidade de vacinas contra a gripe.

Regiões universalmente conservada em todas as influenza A HA disponível e seqüências de NA foram identificadas por análises de bioinformática ^6-7. Uma seqüência (designado como Uni-1) foi identificado no epítopo só universalmente conservadas de HA, o peptídeo de fusão ^6, enquanto duas seqüências conservadas foram identificados em neuraminidases, um perto do local enzimática ativa (designado como HCA-2) ea fechar outras para o N-terminal (designado como HCA-3) ^7. Peptídeos com essas seqüências de aminoácidos foram sintetizados e usados ​​para imunizar coelhos para a produção de anticorpos. O anticorpo contra o epitopo Uni-1 da HA foi capaz de se ligar a 13 subtipos de influenza A HA (H1-H13), enquanto os anticorpos contra o HCA-2 e HCA-3 regiões de NA foram capazes de se ligar todos os 9 subtipos de NA. Todos os anticorpos mostraram especificidade notável contra as seqüências virais como evidenciado pela observação de que qualquer reactividade cruzada com proteínas alantóide foi detectado. Estes anticorpos universal foram então usados ​​para desenvolver ensaios blot slot para quantificar HA e NA em influenza A vacinas sem a necessidade de anti-soros específicos ^7,8. Amostras da vacina foram aplicadas em uma membrana de PVDF usando um aparelho blot ranhura junto com padrões de referência diluído em concentrações variadas. Para a detecção de HA, amostras e padrão foram diluídos em primeiro Tris-buffered saline (TBS) contendo uréia 4M, enquanto para a medição de NA foram diluídos em TBS contendo 0,01% Zwittergent como estas condições melhoraram significativamente a sensibilidade de detecção. Após a detecção do HA e NA antígenos por immunoblotting com seus respectivos anticorpos universal, intensidades de sinal foram quantificados por densitometria. Quantidades de HA e NA nas vacinas foram calculados utilizando uma curva padrão estabelecida com a intensidade do sinal das várias concentrações de as referências utilizadas.

Dado que estes anticorpos se ligam a epítopos universal na HA ou NA, os investigadores interessados ​​podem usá-los como ferramentas de pesquisa em imunoensaios que não seja o blot slot somente.

Protocol

1. Preparação de reagentes e equipamentos

1. Antes de iniciar o procedimento blot slot, prepare 20_mls de solução de uréia 4M em Tris-buffered saline (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) para a hemaglutinina, ou HA, blot slot, ou 20_mls de 0,01% Zwittergent solução TBS para a neuraminidase, ou NA, blot slot. Enquanto uréia 4M deve ser preparado de cada vez, uma solução estoque 10% Zwittergent em dH ₂ O é estável durante pelo menos 6 meses em temperatura ambiente e pode, portanto, ser diluída para 0,01% em TBS antes de cada ensaio.
2. Prepare 2.000 ml de tampão de lavagem por adição de Tween-20 a uma solução de TBS para uma concentração final de 0,1%. Prepare 80 ml de tampão de bloqueio por dissolução leite em pó desnatado (blotting leite non-fat grau seco) para uma concentração final de 5% w / v em tampão de lavagem.
3. Ativar a membrana PVDF (pré-cortados para um tamanho 9 cm x 12) em metanol por 15 segundos, seguido por um dois minutos enxágüe em DDH ₂ O. Mergulhe a membrana em TBS até o uso. Pré-molhada 3 folhas de Bio-Dot SF filtro de papel em TBS até ser usado.

2. Preparação de amostras de gripe vacina e padrão de referência para HA Slot blot

Padrões de referência com a vacina contra influenza pré-determinada de conteúdo correspondente a HA as estirpes da vacina a ser testada foram obtidos a partir do Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica (CBER / FDA, EUA) ou do Instituto Nacional de Padrão Biológica e Controle (NIBSC, UK) e são usados ​​para a quantificação por HA blot slot. Os investigadores também pode preparar os seus próprios padrões de antígeno usando os procedimentos estabelecidos, conforme descrito nas referências 9 e 10.

1. Para antígenos HA referência e amostras da vacina teste: Diluir o antígeno HA estoque de referência de uréia 4M / TBS para as seguintes concentrações: 0, 0,0938, 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5, 3 e 6 HA mcg / ml. Misture bem. Então, diluir as amostras de vacinas para uso humano obtido a partir de produtores de vacinas ou feito em casa para fins de pesquisa científica da ureia 4M / TBS e misture bem. Enquanto duplicatas do antígeno de referência e amostras da vacina pode ser executado, triplicatas são os preferidos. Prepare três diluições de cada amostra (2 vezes a diferença) para permitir a concentração da amostra a cair dentro da curva padrão. Prepare 450 mL ou 650 mL de cada antígeno de referência ou de diluição da amostra de teste da vacina para executar duplicatas ou triplicatas, respectivamente. A influenza monovalente vacinas podem ser testados com este método blot slot. O conteúdo HA dos antígenos de referência foi previamente determinada usando SRID que é o teste padrão atualmente utilizado para a preparação da vacina da gripe. O conteúdo HA determinado pelo SRID foi utilizado como referência concentração de antígeno HA inicial de ações para a preparação das diluições para a curva blot ranhura padrão.

3. Preparação de amostras de gripe vacina e padrão de referência para NA Slot blot

Padrões vacina contra a gripe de referência correspondente para as estirpes da vacina a ser testada foram obtidos a partir do Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica (CBER / FDA, EUA) ou do Instituto Nacional de Padrão Biológica e Controle (NIBSC, UK) e são utilizados para a quantificação NA blot por slot. O conteúdo NA destas amostras de referência foi determinada por SDS-PAGE análise de amostras deglycosylated em conjunto com a análise de densitometria de digitalização, como descrito anteriormente ^9, com pequenas modificações ^10. Em resumo, as amostras da vacina deglycosylated referência (5 mg) foram misturadas com tampão de amostra e carregado no gel. O gel foi executado a 20 mA por aproximadamente 90 min até que o corante de rastreamento só correr para fora do gel, seguido por coloração Sypro. Densitometria quantificação de proteínas foi realizada utilizando um sistema de documentação Fluorchem gel (Alpha Innotech). A quantidade de NA foi determinada com base na relação das proteínas NA às proteínas totais, conforme determinado pelo ensaio de Lowry. Amostras de referência preparadas usando este método pode ser usado em blot slot para a quantificação do conteúdo NA em amostras de vacina dos fabricantes de vacinas.

1. Para antígenos de referência e amostras NA vacina teste: Diluir o antigénio de referência NA estoque em 0,01% Zwittergent / TBS para as seguintes concentrações: 0, 0,039, 0,078, 0,1562, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 e 10 mg NA / ml. Misture bem. Então, diluir as amostras de vacinas para uso humano obtido a partir de produtores de vacinas ou feito em casa para fins de pesquisa científica em 0,01% Zwittergent / TBS e misture bem. Enquanto duplicatas do antígeno de referência e amostras da vacina pode ser executado, triplicatas são os preferidos. Prepare três diluições de cada amostra (2 vezes a diferença) para permitir a concentração da amostra a cair dentro da curva padrão. Prepare 450 mL ou 650 mL de cada antígeno de referência ou de diluição da amostra de teste da vacina para executar duplicatas ou triplicatas, respectivamente. A influenza monovalente vacinas podem ser testados sagacidadeh este método blot slot.

4. Montagem do aparelho Microfiltração Bio-Dot SF e blotting das amostras em membrana de PVDF

1. Montar uma previamente limpas e secas Bio-Dot aparelho Microfiltração SF. Coloque a placa de apoio da junta no colector de vácuo e colocar a junta de vedação em top.Place os 3 umedecido folhas de Bio-Dot papel de filtro SF sobre a junta, seguido pela membrana PVDF pré-embebidas. Coloque o modelo de exemplo em cima da membrana e dedo-aperte os quatro parafusos usando um padrão diagonal cruzando para assegurar a aplicação uniforme da pressão na superfície da membrana.
2. Verifique se a válvula de 3 vias é definida para expor o colector de vácuo para a fonte de vácuo só antes de ligar a bomba e ligar o vácuo.
3. Ligue a bomba e se conectar ao aparelho Bio-Dot. Certifique-se que a válvula de fluxo é posicionado em um nível abaixo dos poços de amostra para a drenagem rápida e adequada das amostras nas etapas seguintes.
4. Repita o passo do parafuso de aperto usando o padrão diagonal cruzando. Apertando os parafusos, enquanto o vácuo é aplicado garante um selo mais apertado e evita a contaminação cruzada entre os poços.
5. Mudar a válvula de fluxo para expor o colector de vácuo para ar e desligar a bomba.
6. Aplicar 100 l de TBS em todos os poços usando uma pipeta multicanal para hidratar a membrana garantindo assim a ligação uniforme do antígeno. Cuidados devem ser tomados para evitar a formação de bolhas e aplicar a solução no meio do poço, o mais próximo ao fundo quanto possível, a fim de cobrir o slot uniformemente. Explodir a qualquer bolha de ar introduzido acidentalmente com uma ponta de pipeta.
7. Mudar a válvula de fluxo para expor o colector de ar e do vácuo, ligue a bomba, e gentilmente drenar o tampão dos poços, colocando um dedo sobre o porto exposto ao ar para regular a quantidade de vácuo.
8. Mudar a válvula de fluxo para expor o colector para o ar assim que o buffer de completamente drenado de todos os poços. Desligar a bomba ou desligar o vácuo.
9. Aplicar 200 mL de cada padrão ou diluição da amostra vacinal por poço. Amostras pipeta um de cada vez, no centro de cada poço, o mais próximo ao fundo quanto possível, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar. Explodir a qualquer bolha de ar introduzido acidentalmente com uma ponta de pipeta. Coloque 200 mL de tampão de diluição da amostra (uréia 4M / TBS ou 0,01% Zwittergent / TBS) em poços não utilizados para garantir a vácuo apropriada aos poços em uso.
10. Ajuste a válvula de fluxo para expor o colector de ar e do vácuo. Ligue a bomba (ou volte a ligar o vácuo) e gentilmente permitir que as amostras para drenar completamente dos poços, controlando a quantidade de vácuo com um dedo sobre o porto exposto ao ar. Remova o dedo da porta para liberar o vácuo, logo que todas as amostras têm drenado.
11. Imediatamente adicione 200 mL de TBS em cada cavidade utilizando um pipetador multicanal. Aplique um vácuo suave para drenar e lavar os poços, controlando a quantidade de vácuo com um dedo sobre o porto exposto ao ar.
12. Repita a etapa de lavagem descrito no passo 4.11. Assim que os poços foram completamente drenados, soltar os parafusos do modelo de exemplo e desligue o vácuo para evitar o ressecamento dos poços. Imediatamente proceder à remoção da membrana.
13. Colocar a membrana em tampão de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C, com balanço delicado. Use o suficiente tampão de bloqueio para cobrir completamente a membrana.

5. Immunoblotting de antígenos HA e NA

1. Após a incubação overnight em tampão de bloqueio, lave a membrana duas vezes por 5 minutos com TBS/0.1% Tween-20 tampão de lavagem. Para todas as lavagens e incubações, garantir a membrana é completamente coberto com a solução.
2. Incubar a membrana com um anticorpo de coelho universal contra a HA (como Uni-1) ou NA (como HCA-2 ou HCA-3) diluído em 5% w / v BSA em tampão de lavagem por uma hora em temperatura ambiente, com suave balanço. Concentrações de anticorpos ideal precisa ser determinado para cada ação de anticorpos. Diluições de 1:4000 de coelho anti-soro deu ótimos resultados para os anticorpos acima mencionados.
3. Lavar a membrana três vezes, à temperatura ambiente com balanço suave durante 15 minutos cada vez, para remover os anticorpos não ligados primária.
4. Incubar a membrana com um HRP-conjugado anticorpo anti-coelho secundário. Use uma diluição de 1:50000 do Bode ImmunoPure Thermo anti-IgG de coelho, o anticorpo conjugado com peroxidase em tampão de bloqueio e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos com balanço delicado.
5. Lavar a membrana três vezes, balançando por 15 minutos cada tempo, em temperatura ambiente com tampão de lavagem para remover quaisquer anticorpos não ligados secundário.
6. Lavar a membrana com TBS por 5 minutos com balanço delicado para remover resíduos de detergente Tween-20 a partir da superfície da membrana.
7. Prepare o substrato com 3 ml de cada reagent da Dura Oeste Supersignal kit Substrato Extended Duration da Thermo Scientific e misture bem.
8. Colocar a membrana em um lenço de papel seco para remover suavemente qualquer tampão TBS excesso.
9. Transferência da membrana para um recipiente seco e adicionar o substrato para cobrir toda a membrana. Incubar 5 minutos com balanço delicado, em temperatura ambiente.
10. Remover o excesso de substrato delicadamente blotting a membrana com papel absorvente.
11. Expor a membrana a um filme de quimioluminescência. A duração da exposição terá de ser otimizado para evitar a saturação do sinal, mas normalmente varia de 10 segundos a 10 minutos.
12. Realizar análises de densitometria sobre o filme desenvolvido utilizando um aparelho de imagem gel, tais como o sistema de documentação Fluorchem gel (Alpha Innotech) seguindo as instruções do fabricante. Os valores de densidade para cada conjunto de repetições de antígenos de referência e amostras da vacina teste são, então, em média. Enquanto os padrões de antígeno e amostras da vacina pode ser executado em duplicatas, triplicatas são os preferidos. Valores de densidade de réplicas deve ser muito similar. Diferenças significativas entre repetições indicam um provável problema técnico durante o procedimento. Uma curva padrão de concentração-dependente é estabelecida plotando os valores de densidade média versus a quantidade (em ng) de HA ou antígeno NA colocar em cada slot, a partir do padrão de referência. Utilizando ajuste de curva de calibração em imunoensaios apropriados é fundamental para quantificar com precisão HA e NA. Regressão linear, obtida pela plotagem da resposta (y) versus a concentração (x) usando a porção linear da curva de resposta (y = mx + b) é o método mais simples para a quantificação dos analitos. Se uma gama mais ampla de analitos é considerado para o cálculo de concentração, a logística parâmetro quatro do modelo (4PL) para imunoensaios atualmente aceitas deve ser usado. Uma variedade de software está disponível para os investigadores interessados ​​a considerar. No caso do ensaio descrito Slot blot, convertendo os valores do eixo x para log escala permite que a curva para se ajustar um modelo de 4-PL e do uso de uma variável inclinação de regressão não-linear para calcular os montantes apagados da HA e NA em a testar amostras da vacina é, portanto, possível. Nós, portanto, rotineiramente usar este modelo para nossas análises. Como as amostras foram diluídas teste de vacina em qualquer uréia 4M / TBS ou 0,01% Zwittergent / TBS antes de serem apagados na membrana, o fator de diluição para cada amostra deve ser levado em conta para determinar a HA e NA conteúdo do teste original amostras de vacina. Sugere-se que cada amostra de teste da vacina ser executado em três diferentes diluições (2 vezes a diferença) para que um conjunto de valores de densidade a cair dentro da curva padrão. Valores de densidade mais elevada do que a faixa da curva padrão para todas as diluições das amostras testadas vacinas precisam ser mais diluída para HA ou quantificação exata NA. Se os valores de densidade estão abaixo do extremo inferior da curva, as amostras devem ser diluídas em um menor fator de diluição.

6. Resultados representativos:

Análises de bioinformática disponíveis de todas as influenza A seqüências HA confirmou o N-terminal da subunidade HA2 (o peptídeo de fusão) como a única região conservada do HA. A Figura 1 mostra a taxa de conservação para cada posição de aminoácidos da sequência consenso identificado. Duas variações foram identificadas nas posições 2 (L-> I) e 12 (G-> N) do 14 N-terminal de aminoácidos HA2, mas tais variações foram encontradas para não afetar a ligação entre os anticorpos e as variantes peptídeo ⁶ . O epítopo Uni-1 (GLFGAIAGFIEGGW) foi escolhida para desenvolver um anticorpo universal contra a HA. Este anticorpo demonstrado especificidade notável para seqüências virais e é capaz de se ligar a 13 diferentes subtipos de influenza A HA (H1-H13) (Figura 2).

Utilizando uma abordagem similar, duas seqüências universalmente conservadas foram identificados em todas as influenza A NA, um perto do local enzimaticamente ativa (HCA-2) (Figura 3A) e outra no N-terminal (HCA-3) (Figura 3B) . Peptídeos com essas seqüências de aminoácidos foram usadas como antígenos para gerar anticorpos contra NA universal. Os anticorpos contra ambos os epitopos foram capazes de se ligar a todos os nove subtipos de NA e mostrou muito pouca reactividade cruzada com proteínas alantóide ou celular, demonstrando alta especificidade para seqüências virais NA (Figura 4).

A Figura 5 mostra uma visão geral do método blot slot para a quantificação da gripe HA e NA.

Exemplos de HA e antígeno NA blot caça-níqueis são mostrados nas Figuras 6 e 7. Figura 6A e 6C mostra resultados representativos, após a detecção do antígeno HA em um padrão de referência da gripe vacina e amostras de vacina, respectivamente. Cada amostra (padrão ou vacina) foi executado em duplicado, em poços adjacentes. Duplicatas deve mostrar Similaintensidades r após a detecção. Otimização das diluições, de incubação e tempo de exposição podem ser necessários dependendo do anticorpos utilizados.

Um exemplo de uma curva padrão típica obtida após a detecção de várias concentrações de HA a partir de uma amostra padrão da vacina de referência é mostrado na Figura 6B. A concentração de antígeno HA é proporcional à intensidade de sinal após a detecção de quimioluminescência do blot slot e se encaixa no modelo de curva 4-PL montagem para esta faixa de concentração (,0938-6 HA mg / ml).

A Figura 7 mostra resultados representativos da detecção do antígeno NA em um padrão de referência da gripe da vacina e em amostras de vacina. Análise de densidade mostrou que a intensidade do sinal obtido através da detecção do antígeno NA em várias diluições de um padrão de referência vacina por blot slot é proporcional à concentração de NA (Fig. 7A). A curva padrão resultante se encaixa um modelo quatro-PL para esta faixa de concentração (0,039-10 mg NA / ml), como mostrado na Figura 7B. Figura mostra 7C um exemplo de uma análise blot slot do conteúdo NA em amostras de vacina contra a gripe. Cada amostra foi analisada em duplicata, em poços adjacentes.

Figura 1. Taxa de Conservação do epítopo Uni-1 na região peptídeo de fusão da gripe A HA.
Análises de bioinformática disponíveis de todas as influenza A seqüências HA confirmou que o peptídeo de fusão (localizado no N-terminal da subunidade HA2) é a única região universalmente conservada do HA. Note que as duas variações na posição 2 (L-> I) e 12 (G-> N) foram encontrados para não afetar a ligação do anticorpo ^6. Um anticorpo universal capaz de ligar 13 diferentes subtipos de influenza A HA (H1-H13) foi desenvolvido utilizando o Uni-1 epítopo (GLFGAIAGFIEGGW).

Figura 2. Detecção de 13 subtipos de HA por anticorpo universal contra a HA.
Líquidos alantóide de 13 subtipos de vírus influenza A propagado em ovos embrionados foram fracionadas em SDS-PAGE, seguido pela detecção de proteínas HA usando o anticorpo universal contra o epítopo Uni-1 de HA. NP proteína foi detectada como o carregamento de controle utilizando um coelho policlonal NP-anticorpo específico. Controle negativo (-) foi líquido alantóico a partir de ovos não-infectados. Controle positivo (+) foi um padrão de referência de H1 a partir NIBSC, UK

Figura 3. Homologia de seqüência da gripe A é NA perto do local enzimaticamente ativo eo N-terminal.
Duas seqüências universalmente conservadas foram identificados em influenza A é por NA bioinformática, uma localizada perto do local enzimática ativa (HCA-2) (Painel A), outro no N-terminal (HCA-3) (Painel B). Peptídeos com esses conservada seqüências de aminoácidos foram sintetizados e utilizados para gerar anticorpos contra NA universal.

Figura 4. Detecção de nove subtipos de NA por anticorpos NA.
Líquidos alantóide de nove subtipos de NA vírus influenza A propagado em ovos embrionados foram fracionadas em SDS-PAGE, seguido pela detecção de proteínas NA usando o HCA-2 (Painel A) e HCA-3 (Painel B) anticorpos. NP proteína foi detectada como o carregamento de controle utilizando um coelho de anticorpos específicos NP-policlonal (Painel C). Controle negativo (-) foi líquido alantóico a partir de ovos não-infectados. Controle positivo (+) foi enriquecida com líquido alantóico rNA1 de A / New Caledonia/20/99 e sondou com o anti-soros correspondentes.

Figura 5. Fluxograma do procedimento blot slot para a quantificação de antígenos HA e NA em vacinas contra a gripe.
Os buffers necessários para a diluição da amostra, bem como para a lavagem e bloqueio da membrana blot caça-níqueis são preparado pela primeira vez ea membrana PVDF e papéis de filtro necessário para a montagem do aparelho microfiltração Bio-Dot SF são pré-embebido. Vacina contra a gripe e as amostras padrão de referência são diluídos na buffers ideal para HA ou detecção NA blot por slot. A Bio-Dot aparelho microfiltração SF é montado de acordo com as instruções do fabricante e as amostras são aplicadas sobre a membrana PVDF. HA e NA antígenos são detectados usando os anticorpos contra o antígeno universal. Análise de densitometria é realizada nos sinais quimiluminescência obtidos para quantificação de HA e NA nas amostras testadas.

Figura 6. Detecção do antígeno HA em amostras de vacina contra a gripe e referem-sereferência padrão.
Um painel mostra uma mancha representante obtidos após imunodetecção do antígeno HA. O antígeno de referência HA foi diluído em concentrações 0-6 mg HA / ml e as vacinas foram diluídas a uma concentração de 0,375 mg HA / ml da ureia 4M / TBS antes de ser aplicado a uma membrana de PVDF com um aparelho de microfiltração Bio-Dot SF . O antígeno HA foi detectada, em seguida, usando o anticorpo Uni-1 universal. Painel B mostra um exemplo de uma curva padrão obtida através da detecção de sinais de concentrações de HA diversos a partir de um padrão de referência vacina. A intensidade do sinal é proporcional à concentração de HA ea curva se ajusta um modelo de 4-PL.

Figura 7. Detecção do antígeno em amostras NA gripe vacina e padrão de referência.
Painel A e B representante mostram sinais obtidos após a detecção de NA em um padrão de referência da gripe vacina diluída para concentrações NA variando de 0 a 10 mg NA / ml em 0,01% Zwittergent / TBS ea conseqüente 4-PL curva padrão seguintes análises densitometria. Um exemplo típico de sinais quimioluminescência detectado após uma análise blot slot de antígeno em amostras NA vacina contra a gripe é mostrado no painel C. amostras da vacina Influenza foram diluídas a uma concentração de 1 mg HA / ml em 0,01% Zwittergent / TBS e foram apagados em um PVDF membrana usando um Bio-Dot aparelho microfiltração SF. Diluições do padrão correspondente da vacina de referência, com concentrações variando 0-2,5 mg NA / ml, foram incluídos na mesma blot a fim de estabelecer uma curva padrão para quantificação do antígeno NA nas amostras de vacina. O antígeno NA foi detectado com o anticorpo HCA-2 universal contra NA e análise de densitometria dos sinais obtidos foi realizada por quimioluminescência. A quantidade de NA em cada amostra da vacina pode ser calculada em relação à curva padrão de 4-PL obtidos plotando os valores de intensidade de sinal versus a concentração NA para o padrão de referência vacina.

Discussion

Determinação quantitativa da gripe viral HA e NA são fundamentais para a pesquisa e desenvolvimento de vacinas uma vez que essas duas proteínas de superfície são mais importantes componentes virais induzir respostas imunes ^6-11. Relatado anteriormente métodos imunológicos para a detecção dessas proteínas exigem anticorpos cepa específica. O método blot simples, reprodutível e rápida slot para quantificar os antígenos HA e NA aqui descritos são adequados para todas as influenza A HA viral e proteínas NA desde os anticorpos reconhecem epitopos sua única universalmente conservada ^6-8. A dificuldade única para os investigadores interessados ​​neste método pode ser que eles não têm esses anticorpos universal in-house. Contudo, a produção destes anticorpos usando peptídeos como antígenos é um procedimento de rotina. Enquanto os cientistas interessados ​​podem fazer os anticorpos se de acordo com os procedimentos descritos, porque os peptídeos variantes competir igualmente bem entre si para a ligação com o peptídeo dada em um ELISA competitivo ^6-8, eles também podem contactar os autores para o HA e NA anticorpos para ser usados ​​em suas pesquisas exploratórias.

Quanto ao blot slot é causa, é bastante simples, com especial atenção necessária em apenas algumas etapas, como descrito acima. Apesar de HA e NA poderia tanto ser detectados em amostras sem tratamento, maior sensibilidade foi conseguida por um pré-tratamento das amostras.

Apesar de suas vantagens de rapidez, simplicidade e reprodutibilidade, o anticorpo universal métodos baseados em slots blot descrito aqui tem certas limitações. Por exemplo, eles não são projetados para distinguir diferentes HA ou subtipos de NA e como tal, são possivelmente mais adequado no processo de controle de qualidade e / ou análise de preparações de vacinas monovalentes. O ensaio SRID permanece, portanto, o método de escolha para identificar os subtipos de HA viral em vacinas contra a gripe ^3.

Em suma, as seqüências altamente conservadas na HA e NA foram selecionados para gerar mono-anticorpos específicos, que podem ser utilizados para análises quantitativas de praticamente qualquer cepas de influenza viral HA e NA. Enquanto o procedimento blot detalhada slot com esses anticorpos universal contra a HA e NA é apresentado aqui, os investigadores interessados ​​podem usá-los como uma ferramenta de pesquisa básica em outros tipos de imunoensaio, uma vez que eles demonstraram especificidade notável contra seqüências virais detectáveis ​​sem reatividade cruzada com alantóide ou proteínas celulares. Também digno de nota é que os anticorpos contra a HA universal pode detectar HA na conformação nativa em culturas de células infectadas por vírus ^12, que destaca uma ampla gama de aplicações desses anticorpos como ferramentas de pesquisa básica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus	Bio-Rad	170-6542
Bio-Dot SF Filter paper	Bio-Rad	162-0161
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF)	EMD Millipore	IPFL00010
Vacuum pump	EMD Millipore	WP6111560
Chemiluminescence BioMax Light Film	Kodak	178 8207
FluorChem Gel Documentation System	Alpha Innotech	29-008-1896X
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens		Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA)	Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen	CBER/FDA or NIBSC
Influenza vaccine samples			Commonly available in most countries
Urea	Sigma-Aldrich	U1250
Zwittergent 3-14 Detergent	Calbiochem	693017
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated	Thermo Fisher Scientific, Inc.	31460
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34075