Summary
Beperkende verdunning celtransplantatie assays worden gebruikt om de frequentie van de tumor voortplantende cellen te bepalen. Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van syngene zebravis dat fluorescent-gelabeld leukemie en details over hoe te isoleren en deze leukemie cellen transplantatie op het beperken van verdunning in de buikholte van de volwassen zebravissen ontwikkelen.
Abstract
Zelfvernieuwende kankercellen zijn de enige soorten cellen in een tumor die een onbeperkte mogelijkheid om de tumorgroei te bevorderen hebben, en zijn dus bekend als tumor-cellen verspreiden, of tumor-cellen initiëren. Er wordt gedacht dat behoeve van deze zelf-vernieuwing cellen voor vernietiging zal progressie van de tumor te blokkeren en te stoppen terugval, sterk verbeteren van de patiënt een prognose. De meest voorkomende manier om de frequentie te bepalen van zelf-vernieuwing cellen in een tumor is een beperkende verdunning cel transplantatie assay, waarbij tumorcellen worden in de ontvanger dieren getransplanteerd bij hogere doseringen, het aandeel van dieren dat tumoren te ontwikkelen is de gebruikte berekenen van het aantal van zelf-vernieuwing cellen in de oorspronkelijke tumor steekproef 2, 3. Idealiter zou een groot aantal dieren worden gebruikt in elke beperkende verdunning experiment om nauwkeurig bepalen van de frequentie van de tumor voortplantende cellen. Echter, op grote schaal experimenten met muizen zijn kostbaar, en de meest beperkende verdunning assays gebruiken slechts 10-15 muizen per experiment.
Zebravis hebben opgedaan bekendheid als een kanker model, voor een groot deel te wijten aan hun gemak van genetische manipulatie en de economie door die grootschalige experimenten kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast zijn de vormen van kanker gemodelleerd in zebravis is gevonden om nauw samen te bootsen hun tegenhanger ziekte bij de mens 4. Hoewel het mogelijk is om de tumorcellen van de ene vis naar de andere transplanteren van sub-dodelijke bestraling van de ontvanger dieren, de regeneratie van het immuunsysteem na 21 dagen veroorzaakt vaak tumorregressie 5. De recente oprichting van syngene zebravis is aanzienlijk vergemakkelijkt tumor transplantatie studies 6-8. Omdat deze dieren zijn genetisch identiek, getransplanteerde tumorcellen inenten robuust in de ontvanger vis, en de groei van de tumor kan worden gevolgd gedurende een lange periode van tijd. Syngene zebravissen zijn ideaal voor het beperken van verdunning transplantatie assays in dat tumorcellen niet moeten aanpassen aan de groei in een vreemde micro-omgeving, die zichzelf vernieuwen celfrequentie 9, 10 mei onderschatten. Bovendien, een-cel transplantatie zijn met succes afgerond met behulp van zebravis syngene 8 en een paar honderd dieren kunnen gemakkelijk en economisch worden getransplanteerd in een keer, die beide dienen om een meer nauwkeurige schatting van de zelf-vernieuwing cel frequentie te geven.
Hier wordt een methode gepresenteerd voor het maken van primaire, fluorescent-gelabelde T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL) in syngene zebravis, en het transplanteren van deze tumoren op het beperken van verdunning in volwassen vissen om zichzelf te vernieuwen cel frequentie te bepalen. Terwijl de leukemie wordt geleverd als een voorbeeld, dit protocol is geschikt om de frequentie van de tumor voortplantende cellen met behulp van welke vorm van kanker model in de zebravis te bepalen.
Protocol
1. DNA micro-injectie van de zebravis embryo's
- Lineariseren rag2:: cMyc en rag2:: GFP-11 DNA-constructen door verteren 10μg van elk plasmide met Notl bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Fenol: chloroform extract en het neerslaan van de plasmiden, en resuspendeer elk in 20μL H 2 O.
- Bepaal de concentratie van het DNA door het uitvoeren van een 1:1, 1:5 en 1:10 verdunning van elk verteerd plasmide op een 1% agarose gel met 20μL, 10μL en 5μL van een high-range DNA ladder. Dit type van kwantificering is over het algemeen nauwkeuriger dan een meting met de spectrometer.
- Verdun het DNA tot een uiteindelijke concentratie van 60ng/μL in 1M KCl +0.5 X TE voor injectie in CG1-stam (of andere syngene-stam) zebravis embryo's met behulp van 30ng/μL rag2:: cMyc + 30ng/μL rag2:: GFP.
- Injecties moeten worden uitgevoerd zoals eerder aangetoond 12, 13. In het kort, zijn mannelijke en vrouwelijke zebravissen opgezet in paring kamers de nacht voor injectie. Op de dag van de injectie, DNA is geladen in de injectienaald, wordt de druk zo aangepast dat een luchtbel met een diameter van 50μm is verdreven (30pg DNA), die wordt gemeten door een fase micrometer. Vervolgens worden embryo geïnjecteerd in de een-cellig stadium, met het DNA rechtstreeks geïnjecteerd in de cel, en niet in de dooier. Overleving van de geïnjecteerde CG1 embryo's en larven is over het algemeen slecht is, en slechts 5% van de vis met succes zal nemen transgen, dus> 600 embryo's moet worden geïnjecteerd om ervoor te zorgen dat sommige vissen zullen leukemie te ontwikkelen.
- Bewaar de geïnjecteerde embryo's bij 28,5 ° C, en verwijder de dode embryo's na 24 uur. Dieren worden vervolgens overgebracht naar grote tanks na 5 dagen van het leven en getogen zoals eerder beschreven 14.
2. Screening voor de primaire T-ALL in de zebravis larven
- Ongeveer 28 dagen na de injectie, verdoven larvale zebravis door het toevoegen van 200μL van 4ng / m Tricane-S tot 25 ml van vis-systeem het water in een petrischaal.
- Onderzoek de larven voor de ontwikkeling van fluorescent gelabelde T-ALL met behulp van een epifluorescentiemicroscoop bij 20X vergroting, met behulp van een 485/20 excitatie golflengte en 530/25 emissie filter om GFP fluorescentie (figuur 1) te detecteren.
- Aparte tumor positief larven van die welke zijn negatief. Negatieve larven kan worden onderzocht op een later tijdstip, als tumoren kunnen zijn groter geworden, om ervoor te zorgen dat er geen T-ALL positieve vissen werden gemist.
- Monitor T-ALL positieve vis minimaal een keer per week gebruik van de epifluorescentiemicroscoop om tumorgroei te volgen.
3. Isolatie en zuivering van fluorescent gelabelde primaire leukemie cellen
- Bij het GFP-positieve leukemie cellen hebben> 50% van het dier achterhaald, offeren de vis door het toevoegen van 1 ml van 4ng/mL Tricane-S in een petrischaaltje met 9ml vis-systeem water.
- Leg de vis in een nieuwe petrischaaltje met 1 ml 0,9 x PBS met 5% foetaal runderserum naar de cellen buffer. Maceraat de vis met een scheermesje, pipet het mengsel grote cel klonten distantiëren, dan gaan de cellen door middel van een 40μm mesh zeef in een 50 ml buis. Het is niet nodig om alle weefsel klonten dissociëren in enkele cellen.
- Pipetteer 500μL van de cellen naar een 4 ml polystyreen buis. Voeg 1μL 1mg/ml propidiumjodide (PI), dat label dode cellen. Vortex, dan blijven de cellen op ijs.
- Offer een wild-type CG1 vis, maceraat en de stam op dezelfde manier als hierboven met normale cellen, die dienen als drager voor de tumor cellen te verzamelen tijdens transplant.Add 4 ml 5% FBS in 0.9x PBS om de 50 ml buis voor een totaal volume van 5 ml.
- Tel de normale cellen, verdund tot 3x10 5 cellen / ml in 5% FBS in 0.9x PBS, dan pipet 100μL/well van een 96-wells plaat.
- Met behulp van een fluorescentie geactiveerde cel Sorter (FACS), sorteren GFP positieve, PI negatieve tumorcellen (figuur 2A, B) in de 96-well plaat met bloedcellen op de volgende doses: 10 cellen / putje in 48 wells, 100 cellen / putje in 24 wells, 1000 cellen / putje in 12 putten, en 10.000 cellen / putje in 6 putten. Bovendien moet 10.000 cellen worden gesorteerd in een goed zonder normale bloedcellen, en opnieuw geanalyseerd met behulp van FACS om de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen (figuur 2C) te beoordelen.
4. Beperkende verdunning transplantatie tot volwassen zebravissen
- Pellet de cellen door centrifugeren van het 96-well plaat op 2000xg gedurende 10 minuten.
- Verwijder 95μL van de bovenstaande, en resuspendeer de cellen in de resterende 5μL.
- Bezit zijn van een volwassene (> 60 dagen oud) syngene zebravis ventrale zijde omhoog, en injecteer de celsuspensie in de buikholte, met behulp van een 26G / 2 "micro-spuit. Zebravis hoeven niet verdoofd worden voor de transplantatie. Typisch, 45 vissen zijn getransplanteerd met 10 leukemiecellen, 20 zijn getransplanteerd met 100 cellen, 7 worden getransplanteerd met 1.000 cellen en 5 vissen worden getransplanteerd met 10.000 T-ALL-cellen.
5. Analyse om leukemie-initiëren cel frequentie te bepalen
- Ongeveer 28 dagen na transplantatie, onderzoekt de getransplanteerde vis met een epifluoresence microscoop met behulp van een 485/20 excitatie golflengte en 530/25 emissie filter om GFP fluorescentie op te sporen. Noteer het aantal positieve vissen per totaal aantal vissen geïnjecteerd.
- Opnieuw te onderzoeken van de vis elke 14 dagen tot 90 dagen en noteer het aantal positieve vis. Wanneer een tumor-positieve vis ten dode opgeschreven te worden, het offer van de dierlijke bijproducten Tricane-S overdosis.
- Voer de resultaten in een tabel, zoals weergegeven in figuur 3D. Het uploaden van de gegevens in de web-based ELDA (Extreme beperkte verdunning Analysis) statistische software op http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 15, die de frequentie van de tumor positieve en negatieve dieren gebruikt bij elke transplantatie dosis om de frequentie van zelf-vernieuwing leukemie cellen te bepalen binnen de primaire T-ALL.
6. Representatieve resultaten:
DNA micro-injectie in embryo's van syngene vis resulteert vaak in een lage overlevingskans van het geïnjecteerde embryo's, met <60% van de embryo's overleven voor 24 uur. Bovendien, de overleving van de geïnjecteerde syngene vis is over het algemeen slecht tijdens de larvale ontwikkeling, met vaak <20% overleven gedurende 28 dagen. Het is daarom belangrijk om een groot aantal embryo's injecteren om transgene vis die T-ALL te ontwikkelen maken.
Als voorbeeld, CG1 stam embryo's werden ingespoten met rag2:: cMyc + rag2:: GFP. De transgenen co-scheiden in de zich ontwikkelende embryo, zodat elke cel die GFP tot uitdrukking ook cMyc uit te drukken. Larven werden gescreend voor de primaire T-ALL na 28 dagen (Figuur 1). Eerder werk heeft aangetoond dat ongeveer 5% van de geïnjecteerde vissen zal hebben GFP-positieve T-cellen in hun thymus (Figuur 1), en 100% van deze vissen zal ontwikkelen leukemie als de T-cellen worden getransformeerd 11. Terwijl een klein deel van de zebravis kan een meer geavanceerde leukemie, dat is zeer gemakkelijk op te sporen op dag 28, de meeste alleen een GFP-positieve thymus (figuur 1) hebben, moeten zo larven individueel worden onderzocht onder hoge vergroting om ervoor te zorgen dat alle positieve vissen worden geselecteerd. GFP-positieve T-ALL-cellen zal> 50% van het dier tussen 45-70 dagen inhalen.
In de verstrekte voorbeeld werden zebravis opgeofferd op 65 dagen van het leven, en leukemie cellen werden geïsoleerd en FACS gesorteerd voor het beperken van verdunning transplantatie. Enkele cellen die waren propidiumjodide negatieve en GFP-positieve (figuur 2) werden gesorteerd in een 96-wells plaat. Heranalyse werd gedaan op 10.000 gesorteerd cellen om de levensvatbaarheid (bij voorkeur> 95%) en zuiverheid te beoordelen (bij voorkeur> 92%, figuur 2). Getransplanteerde T-Alls over het algemeen ontstaan vóór 28 dagen, maar sommige tumoren kan meer dan 60 dagen de tijd om te ontwikkelen. In dit voorbeeld, op dag 28, werd vroeg stadium tumoren gezien als een gebied van GFP-positieve cellen in de buurt van de plaats van injectie (figuur 3B), terwijl sommige T-Alls waren gevorderd, dat uitgebreid naar de peritoneale holte (figuur 3C) te vullen . Gegevens van beperkte verdunning celtransplantatie assays uit drie verschillende primaire T-Alls zijn weergegeven in figuur 3D. Voor deze experimenten werden meer dan 220 dieren getransplanteerd, die gemakkelijk kan worden bereikt door een persoon binnen enkele uren. Data analyse met behulp van ELDA software bleek dat, gemiddeld genomen, een in 135 T-ALL-cellen werden zelfvernieuwende leukemie voortplantende cellen (figuur 3E).
Figuur 1 zebravis larven geïnjecteerd in de een-cellig stadium met RAG:.:-CMyc + vod::-eGFP werden gescreend voor de primaire leukemie groei 28 dagen na de injectie. Vis (*) had GFP-positieve T-cellen in de thymus, deze vis zich zal ontwikkelen T-ALL als de T-cellen worden getransformeerd in de tijd. Deze fase is zeer vaak op dag 28. Een vis (**) had een geavanceerde T-ALL, dat zich heeft verspreid in het zachte weefsel. De overige twee vissen zijn negatief voor de groei van tumoren. Het beeld werd genomen op een vergroting van 16x.
Figuur 2. Fluorescent-gelabelde T-ALL-cellen werden gesorteerd van zieke dieren en gebruikt in de beperkende verdunning cel transplantatie assay. Eerst een hek werd gevestigd op enkele cellen (linksboven paneel) selecteert, worden vervolgens propidiumjodide negatieve cellen geselecteerd (midden links paneel). Tot slot werd een hek gemaakt om alleen de GFP-positieve leukemie cellen voor het sorteren van (linksonder) te selecteren. Gesorteerde cellen worden opnieuw geanalyseerd om de levensvatbaarheid en zuiverheid voor transplantatie (rechts panelen) te beoordelen.
Figuur 3. Zebravis werden onderzocht op leukemie groei 28 dagen na transplantatie. Vissen zijn ofwel tumor negtieve (A), hebben een kleine tumor groeit op de injectieplaats (B), of hebben een gevorderd leukemie (C). De beelden werden genomen op 7X vergroting. Het totaal aantal leukemie-positieve vis per totaal aantal vissen getransplanteerd bij elke verdunning wordt opgenomen, als in (D). De gegevens worden ingevoerd in de web-based ELDA programma om het aantal te berekenen zelfvernieuwende leukemie cellen en de bovenste en onderste 95% betrouwbaarheidsintervallen (E).
Discussion
Een belangrijke kracht van de met behulp van zebravis in het kankeronderzoek is dat grote aantallen dieren kunnen worden gebruikt tegen relatief lage kosten. Dit is vooral belangrijk in het beperken van verdunning celtransplantatie assays, waarbij de verhoudingen van de getransplanteerde dieren dat tumoren te ontwikkelen om de getransplanteerde totale aantal worden gebruikt om de tumor-initiëren cel frequentie te bepalen. In de hier gepresenteerde methode, zijn meer dan 70 transplantatie ontvanger gebruikte dieren per test, die een nauwkeurige schatting van tumor-propageren van het aantal cellen. Zowel het aantal gebruikte dieren en de dosering van getransplanteerde tumorcellen moet worden geoptimaliseerd voor een bepaald type kanker model, bijvoorbeeld als de eerste experimenten tonen aan tumor-cellen initiëren zeldzaam zijn, kan nuttig transplantatie doses 100.000, 50.000, 10.000 en 1.000 cellen per transplantatie.
Syngene zebravis stammen zijn nuttig in het beperken van verdunning analyse. Echter, deze stammen nog niet vaak gebruikt in alle laboratoria, en sommige zebravis kanker modellen bestaan alleen in allogene vissen. Beperkende verdunning cel transplantaties kunnen worden uitgevoerd in wild-type stammen die hebben ondergaan immuun ablatie, hoewel de zelfvernieuwende cel frequentie kan worden berekend als 10 tot 100 maal hoger dan wanneer syngene zebravis werden gebruikt 8. Het is belangrijk op te merken dat een grotere doses van de cellen moet worden gebruikt voor transplantaties in niet-immune afgestemd, bestraald ontvangers, zoals sommige tumorcellen wordt niet transplantatie overleven in een buitenlandse micro-omgeving. Daarnaast zullen vele tumoren beginnen te regressie na 21 dagen wanneer de ontvanger dier het immuunsysteem zich herstelt, zodat de dieren moeten worden beoordeeld voor de groei van de tumor om de 7 dagen na de transplantatie.
De methoden hier gepresenteerde zijn geschikt voor gebruik met zebravissen kanker model, en zijn tot nu toe gebruikt om te bepalen tumor-initiëren cel frequentie in zowel de T-cel acute lymfatische leukemie 8, en een solide tumor model, rhabdomyosarcoom 16. Deze tumoren werden fluorescent gelabelde door co-injectie van embryo's met zowel een oncogen en fluorescerende marker, omdat het DNA co-scheidt, elke cel de uiting van de oncogen zal ook uiten het fluorescerende eiwit 17. Terwijl de fluorescentie is aan te bevelen omdat het vergemakkelijkt het volgen van de groei van de tumor, zonder de noodzaak om het dier te offeren en biedt een straight-forward manier om de tumorcellen te isoleren door FACS, is het mogelijk om tumorcellen label met antilichamen tegen tumor-specifieke beleidsmakers om hun reiniging te vergemakkelijken , kan al antilichaam kleuring in zebravissen nodig optimalisatie.
Tot slot, wanneer de incidentie van tumor-cellen verspreiden is bepaald voor een bepaalde type tumor, is het mogelijk om deze assays gebruiken om de mechanismen die hun cel frequentie bepalen te identificeren. Bijvoorbeeld, kan de primaire tumor cellen worden behandeld met pad specifieke remmers voor beperkende verdunning transplantatie, of getransplanteerd vis zelf kunnen gedoseerd worden met drugs. Daarnaast kan de genetica van de tumoren zelf worden gemanipuleerd door het injecteren van de een-cellig stadium vis met een gen van belang, zodat de resulterende primaire tumoren zal het gen over-express. In deze experimenten, zal geen effect op zelf-vernieuwing cel frequentie worden waargenomen in de beperkende verdunning assays.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering is verstrekt door NIH subsidie 5T32CA09216-26 (voor het GCO), en de K01 AR055619-01A1 en 3 K01 AR055619-03S1 (voor DML), alsook door de Lemonade Alex Stand Foundation, het Harvard Stem Cell Institute en de American Cancer de samenleving.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Zhou, B. -B. S. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).
- Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice. Stem Cells. 15, 199-207 (1997).
- Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption. J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Taylor, A. M., Zon, L. I. Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation. Zebrafish. 6, 339-346 (2009).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).
- Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish. Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).
- Smith, A. C. H. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells. Science. 317, 337-337 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Langenau, D. M. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. , (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).
- Ignatius, M. S. In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth. , Forthcoming (2010).
- Langenau, D. M. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).
