Summary
Limitando diluição ensaios transplante de células são usadas para determinar a freqüência de tumor de células-propagação. Este protocolo descreve um método para gerar zebrafish singeneicos que desenvolvem leucemia fluorescente marcado e detalhes de como isolar e transplante dessas células de leucemia a limitar a diluição na cavidade peritoneal de peixe-zebra adulto.
Abstract
Células auto-renovação de câncer são os tipos de células apenas dentro de um tumor que têm uma capacidade ilimitada para promover o crescimento do tumor, e são, portanto, conhecida como tumor de células-propagação, ou células de tumor inicial. Pensa-se que a segmentação dessas células auto-renovação de destruição irá bloquear a progressão do tumor e parar de recaídas, melhorando consideravelmente o prognóstico do paciente 1. A forma mais comum para determinar a freqüência de auto-renovação de células dentro de um tumor é uma limitação de diluição ensaio transplante de células, em que as células do tumor são transplantadas em animais receptores em doses crescentes, a proporção de animais que se desenvolvem tumores é utilizado o cálculo do número de auto-renovação de células da amostra de tumor original 2, 3. Idealmente, um grande número de animais seriam usados em cada experimento diluição limitante para determinar com precisão a freqüência de tumor de células-propagação. No entanto, experimentos de larga escala envolvendo ratos são caros, ea maioria dos ensaios de diluição limitar o uso de apenas 10-15 camundongos por experimento.
Zebrafish ganharam proeminência como um modelo de câncer, em grande parte devido à sua facilidade de manipulação genética e da economia em que experiências em grande escala pode ser realizada. Além disso, os tipos de câncer modelados em zebrafish foram encontrados para perto imitar o seu homólogo quatro doenças humanas. Embora seja possível transplantar células tumorais de um peixe para outro pela sub-letais de irradiação de animais destinatário, a regeneração do sistema imunológico após 21 dias muitas vezes provoca a regressão do tumor 5. A recente criação do peixe-zebra singeneicos facilitou enormemente estudos transplante tumor 6-8. Porque esses animais são geneticamente idênticas, transplantadas células tumorais enxertar robustamente em peixes destinatário e crescimento do tumor pode ser monitorado durante longos períodos de tempo. Singeneicos zebrafish são ideais para limitar os ensaios transplante de diluição em que as células tumorais não têm de se adaptar ao crescimento em um microambiente estrangeiros, o que pode subestimar a auto-renovação das células frequência 9, 10. Além disso, um transplante de células têm sido concluído com sucesso usando zebrafish singeneicos 8 e várias centenas de animais podem ser facilmente e economicamente transplantados de uma só vez, sendo que ambos servem para fornecer uma estimativa mais precisa de auto-renovação de frequência celulares.
Aqui, um método é apresentado para a criação primária, fluorescente marcado com T-cell leucemia aguda linfoblástica (T-ALL) em zebrafish singênico, e transplantar esses tumores de limitar a diluição em peixes adultos para determinar auto-renovação de frequência celulares. Enquanto a leucemia é fornecido como um exemplo, este protocolo é adequado para determinar a freqüência de tumor de células-propagação usando qualquer modelo de câncer no zebrafish.
Protocol
1. Microinjeção de DNA de embriões zebrafish
- Linearizar RAG2:: cMyc e RAG2:: GFP 11 construções de DNA através da digestão 10μg de cada plasmídeo com NotI a 37 ° C durante a noite.
- Fenol: clorofórmio e extrair precipitar os plasmídeos, e ressuspender cada um em 20μL H 2 O.
- Determinar a concentração do DNA, executando uma diluição de 1:1, 1:5 e 1:10 de cada plasmídeo digerido em um gel de agarose 1% com 20μL, 10μL e 5μL de uma escada de DNA de alta gama. Este tipo de quantificação é geralmente mais preciso do que uma leitura espectrômetro.
- Diluir o DNA para uma concentração final de 1M KCl 60ng/μL em 0,5 X TE para injeção em CG1-deformação (ou tensão singeneicos outros) utilizando embriões zebrafish 30ng/μL RAG2:: cMyc + 30ng/μL RAG2:: GFP.
- Injecções devem ser realizados como demonstrado anteriormente 12, 13. Resumidamente, peixe-zebra macho e fêmea são criados em câmaras de acasalamento a noite antes da injeção. No dia da injeção, o DNA é carregado para dentro da agulha de injeção, a pressão é ajustado para que uma bolha com um diâmetro de 50 ìm é expelido (30pg de DNA), que é medido por um micrômetro palco. Então, os embriões são injetados na fase de uma célula, com o DNA injetado diretamente no celular, e não para dentro da gema. Sobrevivência dos embriões injetados CG1 e larvas é geralmente pobre, e apenas 5% dos peixes com sucesso incorporar o transgene, assim,> 600 embriões deve ser injetado para garantir que alguns peixes vão desenvolver leucemia.
- Armazenar os embriões injetados em 28,5 ° C, e remover os embriões mortos após 24 horas. Os animais são então transferidos para grandes tanques em 5 dias de vida e criado como descrito anteriormente 14.
2. Triagem para T-ALL primária em larvas do peixe
- Aproximadamente 28 dias após a injeção, anestesiar zebrafish larval adicionando 200μL de 4ng / m Tricane-S de 25 ml de água do sistema de peixe em um prato de petri.
- Examine as larvas para o desenvolvimento de fluorescência marcado T-ALL usando um microscópio de epifluorescência, com ampliação de 20x, usando um comprimento de onda de excitação e emissão 485/20 530/25 filtro para detectar GFP de fluorescência (Figura 1).
- Larvas tumor separados positiva daqueles que são negativos. Larvas negativas podem ser examinados em um ponto mais tarde, uma vez que tumores podem ter crescido maiores, para garantir que nenhum T-Todos os peixes positivos foram perdidas.
- Monitorar T-Todos os peixes positiva, pelo menos uma vez por semana usando o microscópio de epifluorescência, para acompanhar o crescimento do tumor.
3. Isolamento e purificação de fluorescência marcado com células de leucemia primária
- Quando as células GFP positivas leucemia têm ultrapassado> 50% do animal, o sacrifício dos peixes, adicionando 1 ml de 4ng/ml Tricane-S numa placa de Petri contendo 9ml de água do sistema de peixe.
- Coloque o peixe em um prato de petri contendo 1mL nova 0.9x PBS com soro bovino 5% Fetal para tamponar as células. Macerar o peixe com uma pipeta de lâmina de barbear, a mistura de dissociar aglomerados de grandes células, as células passam então por uma peneira de malha 40μm em um tubo de 50 mL. Não é necessário dissociar todos os aglomerados de tecido em células individuais.
- 500μL pipeta das células para um tubo de poliestireno 4mL. Adicionar 1μL 1mg/mL iodeto de propídio (PI), que será rótulo células mortas. Vortex, em seguida, manter as células no gelo.
- Sacrificar um tipo selvagem CG1 peixes, macerar e tensão da mesma forma como acima para coletar as células normais, que servem como um suporte para as células do tumor durante transplant.Add 4mL 5% FBS em 0.9x PBS ao tubo de 50 ml para um total volume de 5 mL.
- Contar as células normais, diluir a 3x10 5 células / mL em 5% FBS em 0.9x PBS, então 100μL/well pipeta de uma placa de 96 poços.
- Utilizando um classificador de fluorescência celular Ativado (FACS), sort GFP positivas, PI células tumorais negativa (Figura 2A, B) para a placa de 96 poços contendo células do sangue com as seguintes doses: 10 células / poço em 48 poços, 100 células / poço em 24 poços, 1.000 células / poço em 12 poços, e 10.000 células / poço em 6 poços. Além disso, 10.000 células devem ser classificados em um poço sem células sanguíneas normais, e novamente analisadas utilizando FACS para avaliar a pureza e viabilidade das células classificadas (Figura 2C).
4. Limitando o transplante de diluição em peixe-zebra adulto
- Agregar as células por centrifugação a placa de 96 poços na 2000xg por 10 minutos.
- Remover 95μL do sobrenadante e ressuspender as células do 5μL restantes.
- Segure um adulto (> 60 dias) singeneicos lado zebrafish ventral para cima, e injetar a suspensão de células para a cavidade peritoneal, utilizando um 26G / 2 "micro-seringa. Peixe-zebra não tem que ser anestesiado antes do transplante. Tipicamente, 45 peixes são transplantadas com 10 células de leucemia, 20 são transplantados com 100 células, 7 são transplantadas com 1.000 células e 5 peixes são transplantadas com 10.000 T-ALL células.
5. Análise para determinar leucemia, iniciando freqüência de células
- Aproximadamente 28 dias após o transplante, examine o peixe transplantado com um microscópio epifluoresence usando um comprimento de onda de excitação e emissão 485/20 530/25 filtro para detectar GFP fluorescência. Registrar o número de peixes positiva por número total de peixes injetados.
- Reexaminar os peixes a cada 14 dias para até 90 dias e anote o número de peixes positivo. Quando um peixe tumor positivo se moribunda, o sacrifício do animal por Tricane-S overdose.
- De entrada os resultados em uma tabela, como mostrado na figura 3D. Carregar os dados no ELDA web-based (Análise de Diluição de extrema limitação) software estatístico a http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 15, que usa a freqüência de tumor animais positivos e negativos em cada dose de transplantes para determinar a freqüência de auto-renovação de células de leucemia dentro do principal T-ALL.
6. Resultados representativos:
Microinjeção de DNA em embriões de peixe singeneicos muitas vezes resulta em uma baixa taxa de sobrevivência dos embriões injetados, com <60% dos embriões sobrevivem por 24 horas. Além disso, a sobrevivência dos peixes injetados singeneicos é geralmente pobre durante o desenvolvimento larval, com freqüência <20% sobrevivem por 28 dias. Portanto, é importante para injetar um grande número de embriões a fim de criar peixes transgénicos que irá desenvolver-T ALL.
Como exemplo, CG1 embriões foram injetados com tensão RAG2:: cMyc + RAG2:: GFP. Os transgenes co-segregar no embrião em desenvolvimento, de modo que cada célula que expressa GFP também expressar cMyc. As larvas foram selecionados para primário T-ALL após 28 dias (Figura 1). Os trabalhos anteriores mostraram que aproximadamente 5% dos peixes injetados terá GFP-T-positivas dentro de suas células do timo (Figura 1), e 100% destes peixes irão desenvolver leucemia, as células-T se transforma 11. Enquanto uma pequena proporção de peixe-zebra pode ter uma leucemia mais avançado que é muito fácil de detectar no dia 28, a maioria terá apenas um GFP positivas timo (Figura 1), então as larvas devem ser examinados individualmente sob alta ampliação para garantir que todos positivos peixes são selecionados. GFP-T-positivo ALL células alcançarei> 50% dos animais entre os dias 45-70.
No exemplo fornecido, zebrafish foram sacrificados aos 65 dias de vida, e as células de leucemia foram isoladas e classificadas FACS para limitar transplante de diluição. Células isoladas que foram iodeto de propídio negativos e GFP-positivos (Figura 2) foram classificados em uma placa de 96 poços. Reanálise foi feita em 10.000 células ordenadas em ordem para avaliar a viabilidade (idealmente> 95%) e pureza (o ideal é> 92%, Figura 2). Transplantado T-alls geralmente surgem antes de 28 dias, mas alguns tumores podem levar mais de 60 dias para se desenvolver. Neste exemplo, no dia 28, os tumores fase inicial eram vistos como uma área de GFP células positivas perto do local da injeção (Figura 3B), enquanto alguns ONVITES T-eram mais progrediu, tendo expandido para preencher a cavidade peritoneal (Figura 3C) . Dados de ensaios de diluição limitante transplante de células a partir de três diferentes primário T-alls são mostrados na Figura 3D. Para esses experimentos, mais de 220 animais foram transplantadas, o que pode ser facilmente realizado por uma pessoa dentro de várias horas. Análise de dados usando o software ELDA mostrou que, em média, 1 em 135 T-ALL células foram auto-renovação leucemia propagação células (Figura 3E).
Figura 1 Zebrafish larvas injetadas na fase de uma célula com o pano:.:-CMyc + rag::-eGFP foram selecionados para o crescimento leucemia primária 28 dias após a injecção. Peixe (*) tinha GFP positivas as células T no timo, este peixe irá desenvolver T-ALL como as células-T se transformou ao longo do tempo. Esta fase é muito comum no dia 28. Um peixe (**) tinha um avançado T-ALL, que se espalhou para os tecidos moles. Os dois peixes restantes são negativas para o crescimento do tumor. A imagem foi obtida com ampliação de 16x.
Figura 2. Fluorescente marcado T-ALL células foram classificadas de animais doentes e utilizado no ensaio de limitar o transplante de células de diluição. Primeiro, um portão foi elaborado para selecionar células individuais (painel superior esquerdo), então as células iodeto de propídio negativos são selecionados (painel esquerdo do meio). Finalmente, um portão foi atraído para selecionar apenas GFP-positivas as células de leucemia para classificar (painel inferior à esquerda). Células devem ser novamente analisadas classificadas para avaliar a viabilidade e pureza antes do transplante (painéis à direita).
Figura 3. Zebrafish foram examinados para o crescimento leucemia 28 dias após o transplante. Os peixes são neg ou tumorative (A), tem um pequeno tumor em crescimento no local da injeção (B), ou ter uma leucemia progrediu (C). As imagens foram tiradas com ampliação de 7X. O número total de leucemia positivo peixe por número total de peixes transplantado, a cada diluição é gravado, como em (D). Os dados são introduzidos no programa ELDA web-based para calcular o número de auto-renovação de células de leucemia e os superiores e inferiores intervalos de 95% de confiança (E).
Discussion
A força principal de usar zebrafish na pesquisa do câncer é que um grande número de animais podem ser usados a um custo relativamente baixo. Isto é especialmente importante em limitar testes de diluição transplante de células, onde as proporções de animais transplantados que desenvolvem tumores ao número total transplantados são usados para determinar tumor de iniciação frequência celulares. No método aqui apresentado, mais de 70 animais receptores de transplante são usados por ensaio, fornecendo uma estimativa exata do tumor propagação número de células. Tanto o número de animais utilizados e as doses de células tumorais transplantadas deve ser otimizado para um modelo de câncer de dado, por exemplo, se as experiências iniciais mostram tumor de iniciação células são raras, as doses podem ser úteis transplante de 100.000, 50.000, 10.000 e 1.000 células por transplante.
Cepas singeneicos zebrafish são úteis para limitar a análise de diluição. No entanto, essas cepas ainda não são comumente usados em todos os laboratórios, e alguns modelos de zebrafish câncer só existem em peixes alogênico. Transplantes de células limitar a diluição pode ser realizado em linhagens selvagens que foram submetidos a ablação imune, embora a freqüência de auto-renovação das células pode ser calculada como 1-10 vezes maior do que se singeneicos zebrafish foram utilizadas 8. É importante notar que as doses maior de células devem ser utilizados para transplantes em não imunes combinados, os destinatários irradiados, como algumas células do tumor não sobreviverá transplante em um microambiente estrangeiros. Além disso, muitos tumores começará a regredir após 21 dias quando o sistema imunológico do animal destinatário recupera, assim que os animais devem ser avaliados para o crescimento do tumor a cada 7 dias após o transplante.
Os métodos aqui apresentados são adequados para uso com qualquer modelo de câncer de peixe-zebra, e até agora têm sido usados para determinar tumor de iniciação freqüência de células em ambas as células T leucemia linfoblástica aguda 8, e um modelo de tumor sólido, rabdomiossarcoma 16. Estes tumores foram fluorescente etiquetado por co-injeção de embriões com dois oncogene e um marcador fluorescente, porque o DNA co-segrega, qualquer célula expressando o oncogene também expressar a proteína fluorescente 17. Enquanto fluorescência é recomendado, pois facilita o rastreamento do crescimento do tumor, sem a necessidade de sacrificar o animal e fornece uma maneira simples e direta para isolar células tumorais por FACS, é possível rotular as células tumorais com anticorpos específicos para tumor fabricantes para facilitar a sua purificação , embora a coloração de anticorpos em zebrafish pode exigir de otimização.
Finalmente, uma vez que a incidência de tumor de células-propagação foi determinada para um tipo determinado tumor, é possível usar esses ensaios para identificar os mecanismos que governam a sua freqüência de células. Por exemplo, células primárias de tumor podem ser tratados com inibidores da via específica antes de limitar o transplante de diluição, ou peixe transplantado se podem ser tratados com drogas. Além disso, a genética dos tumores em si podem ser manipulados pela injeção de peixe palco de uma célula com um gene de interesse, de modo que os tumores resultantes primário sobre-expressam o gene. Nesses experimentos, qualquer efeito sobre a auto-renovação das células freqüência será observada nos ensaios de diluição limitante.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pelo NIH concede 5T32CA09216-26 (para JSB), e K01 AR055619-01A1 e 3 K01 AR055619-03S1 (para DML), bem como pelo Alex Lemonade Stand Foundation, a Harvard Stem Cell Institute ea American Cancer sociedade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Zhou, B. -B. S. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).
- Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice. Stem Cells. 15, 199-207 (1997).
- Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption. J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Taylor, A. M., Zon, L. I. Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation. Zebrafish. 6, 339-346 (2009).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).
- Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish. Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).
- Smith, A. C. H. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells. Science. 317, 337-337 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Langenau, D. M. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. , (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).
- Ignatius, M. S. In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth. , Forthcoming (2010).
- Langenau, D. M. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).
