Summary
Begränsa utspädningen celltransplantation analyser används för att bestämma frekvensen av tumör-förökningsmaterial celler. Detta protokoll beskriver en metod för att generera syngena zebrafisk som utvecklar fluorescerande-märkta leukemi och detaljer hur du kan isolera och transplantera dessa leukemiceller att begränsa utspädningen i bukhålan av vuxna zebrafisk.
Abstract
Egen förnya cancerceller är den enda celltyper i en tumör som har en obegränsad förmåga att främja tumörtillväxt, och är därför känd som tumör-föröknings celler, eller tumör-inledande celler. Det är tänkt att inrikta sig på dessa själv förnya celler för destruktion blockerar tumörtillväxt och stoppa återfall, avsevärt förbättra patientens prognos 1. Det vanligaste sättet att bestämma frekvensen av själv-förnyar celler i en tumör är en begränsande utspädning celltransplantation test, där tumörceller transplanteras in i mottagaren djur vid ökande doser, andelen djur som utvecklar tumörer används för beräkning av antalet av själv-förnyar celler i den ursprungliga tumören urval 2, 3. Helst skulle ett stort antal djur skall användas i varje begränsa utspädningen experiment för att exakt fastställa frekvensen av tumör-förökningsmaterial celler. Men storskaliga försök med möss är kostsamma och mest begränsande utspädning analyser använder bara 10-15 möss per försök.
Zebrafisk ha vunnit ryktbarhet som en cancer modell, till stor del på grund av sin lätthet av genmanipulation och ekonomin genom vilka storskaliga experiment kan utföras. Dessutom har de cancertyper modelleras i zebrafisk funnit att noga härma deras motsvarighet mänskliga sjukdomar 4. Även om det är möjligt att transplantera tumörceller från en fisk till en annan genom subletala bestrålning av mottagare djur, regeneration av immunförsvaret efter 21 dagar ofta orsakar tumörregression 5. Den nyligen inrättade syngena zebrafisk har väsentligt underlättat tumör transplantation studier 6-8. Eftersom dessa djur är genetiskt identiska, transplanterade tumörceller ympas kraftigt till mottagaren fisk, och tumörtillväxt kan följas över långa tidsperioder. Syngena zebrafisk är idealiska för att begränsa utspädningen transplantation analyser i tumörceller inte behöver anpassa sig till tillväxt i en utländsk mikromiljö, vilket kan underskatta själv förnya cells frekvens 9, 10. Dessutom en cell transplantationer har genomförts framgångsrikt med syngena zebrafisk 8 och flera hundra djur kan enkelt och ekonomiskt transplanteras på en gång, som båda tjänar till att ge en mer korrekt uppskattning av själv-förnya cell frekvens.
Här är en metod presenteras för att skapa primära, fluorescerande-märkta T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) i syngena zebrafisk, och transplantera dessa tumörer till att begränsa utspädningen i vuxen fisk för att avgöra själv förnya cell frekvens. Medan leukemi tillhandahålls som ett exempel, är detta protokoll lämplig för att bestämma frekvensen av tumör-förökningsmaterial celler med hjälp av någon cancer modell i zebrafisk.
Protocol
1. DNA-mikroinjektion av zebrafisk embryon
- Linjärisera rag2:: cMyc och rag2:: GFP 11 DNA-konstruktioner genom uppslutning av 10 mikrogram i varje plasmid med Noti vid 37 ° C över natten.
- Fenol: kloroform extrakt och fällningen av plasmider, och återsuspendera vardera i 20μL H 2 O.
- Bestäm koncentrationen av DNA genom att köra en 1:1, 1:5 och 1:10 spädning av varje smälta plasmid från 1% agarosgel med 20μL, 10μL och 5μL av hög-range DNA-stege. Denna typ av kvantifiering är i allmänhet mer exakt än en absorbanserna.
- Späd DNA till en slutlig koncentration av 60ng/μL i 1M KCl 0,5 X TE för injektion i CG1-stam (eller andra syngena stam) zebrafisk embryon med hjälp av 30ng/μL rag2:: cMyc + 30ng/μL rag2:: GFP.
- Injektionerna bör utföras som tidigare visats 12, 13. Kortfattat är manliga och kvinnliga zebrafisk inrättades parning kammare kvällen innan injektionen. På dagen för injektionen, är DNA laddas i injektionsnålen är trycket justeras så att en bubbla med en 50μm diameter utvisas (30pg DNA) som mäts med en objektmikrometern. Sedan är embryon injiceras i en-cells skede, med DNA som injiceras direkt in i cellen, och inte i äggula. Överlevnad av den injicerade CG1 embryon och yngel är i allmänhet dålig, och endast 5% av fisk kommer lyckas införliva transgenen, och därför bör> 600 embryon injiceras så att en del fisk kommer att utveckla leukemi.
- Förvara injicerade embryona vid 28,5 ° C, och ta bort döda embryon efter 24h. Djuren har sedan överförts till stora tankar i 5 dagar i livet och uppvuxen som tidigare beskrivits 14.
2. Screening för primär T-ALL i zebrafisk larver
- Cirka 28 dagar efter injektionen, söva larver zebrafisk genom att lägga 200μL av 4ng / m Tricane-S till 25mL av fisk systemet vatten i en petriskål.
- Undersök larver för utveckling av fluorescerande-T-ALL med hjälp av ett epifluorescensmikroskop på 20X förstoring med en 485/20 excitationsvåglängden och 530/25 utsläpp filter för att upptäcka GFP fluorescens (figur 1).
- Separat tumör positiva larver från de som är negativa. Negativa larver kan undersökas vid ett senare tidpunkt, när tumörer kan ha blivit större, att säkerställa att inga T-ALL positiva fisk missat.
- Övervaka T-ALL positiva fisk minst en gång i veckan med epifluorescensmikroskop att spåra tumörtillväxt.
3. Isolering och rening av fluorescerande-märkta primära leukemiceller
- När GFP-positiva leukemiceller har gått> 50% av djuret, offer fisken genom att lägga till 1 mL 4ng/mL Tricane-S i en petriskål med 9 ml vatten fisk-systemet.
- Placera fisken i en ny petriskål som innehåller 1 mL 0.9x PBS med 5% fetalt bovinserum att buffra cellerna. Blöta upp fisken med ett rakblad, pipettera blandningen att skilja stora cell klumpar, passera sedan cellerna genom en 40μm nät sil i ett 50mL rör. Det är inte nödvändigt att skilja alla vävnad klumpar i enstaka celler.
- Pipettera 500μL av cellerna till en 4ml polystyren rör. Lägg 1μL 1mg/ml propidiumjodid (PI), som kommer etiketten döda celler. Vortex, sedan hålla cellerna på is.
- Offra en vild typ CG1 fisk, blöta och påfrestningar på samma sätt som ovan att samla normala celler, som tjänar som bärare för tumörceller under transplant.Add 4 ml 5% FBS i 0.9x PBS till 50mL röret för en total volymen 5 ml.
- Räkna normala celler, späd till 3x10 5 celler / ml i 5% FBS i 0.9x PBS, då Pipettera 100μL/well av en 96-brunnar.
- Med hjälp av en Fluorescens Aktivt Cell Sorter (FACS), sortera GFP positiv, PI negativa tumörceller (Figur 2A, B) i 96-brunnar innehåller blodkroppar vid följande doser: 10 celler / brunn i 48 brunnar, 100 celler / brunn i 24 brunnar, 1000 celler / brunn i 12 brunnar, och 10.000 celler / brunn i 6 brunnar. Dessutom bör 10 tusen celler kan sorteras i en bra utan normala blodceller, och analyseras med FACS för att bedöma renhet och livskraft sorterade celler (figur 2C).
4. Begränsa utspädningen transplantation till vuxna zebrafisk
- Pellets cellerna genom centrifugering av 96-brunnar på 2000xg i 10 minuter.
- Ta bort 95μL av supernatanten och suspendera cellerna i de återstående 5μL.
- Håll en vuxen (> 60 dagar gammal) syngena zebrafisk ventrala sidan uppåt och injicera cellsuspension in i bukhålan med en 26G / 2 "mikro-spruta. Zebrafisk behöver inte vara bedövas innan transplantation. Normalt är 45 fiskar transplanteras med 10 leukemiceller, är 20 transplanteras med 100 celler, 7 transplanteras med 1000 celler och 5 fisk transplanteras med 10.000 T-alla celler.
5. Analys för att fastställa leukemi-initiera cell frekvens
- Cirka 28 dagar efter transplantationen, undersöka de transplanterade fisk med en epifluoresence mikroskop med hjälp av en 485/20 excitationsvåglängden och 530/25 utsläpp filter för att upptäcka GFP fluorescens. Anteckna antalet positiva fiskar per totala antalet injiceras av fisk.
- Ompröva fisk varje 14 dagar för upp till 90 dagar och registrera antalet positiva fisk. När en tumör-positiv fisk blir döende, offra de animaliska Tricane-S överdos.
- Mata in resultatet i en tabell, som visas i figur 3D. Ladda upp data i det webbaserade Elda (Extreme begränsa Utspädning Analysis) statistisk programvara på http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 15, som använder frekvensen av tumör positiva och negativa djur vid varje transplantation dos för att bestämma frekvensen av själv-förnyar leukemiceller inom den primära T-ALL.
6. Representativa resultat:
DNA-mikroinjektion i embryon från syngena fisk resulterar ofta i en låg överlevnad av den injicerade embryon, med <60% av embryon att överleva i 24 timmar. Dessutom är överlevnaden för de injicerade syngena fisken i allmänhet dålig under larvutveckling, med ofta <20% överlevande i 28 dagar. Det är därför viktigt att injicera ett stort antal embryon för att skapa transgena fiskar som kommer att utveckla T-ALL.
Som ett exempel har CG1 stam embryon injiceras med rag2:: cMyc + rag2:: GFP. Den transgener co-segregerar hos det utvecklande embryot, så att varje cell som uttrycker GFP också kommer att uttrycka cMyc. Larver visades för primär-T-ALL efter 28 dagar (Figur 1). Tidigare arbete har visat att cirka 5% av injicerade fisk kommer att ha GFP-positiva T-celler inom sitt bräss (figur 1), och 100% av dessa fiskar kommer att utveckla leukemi som T-celler blir förvandlade 11. Medan en liten del av zebrafisk kan ha en mer avancerad leukemi som är mycket lätt att upptäcka vid dag 28 kommer de flesta bara har en GFP-positiv bräss (Figur 1) bör så larver undersökas individuellt i hög förstoring för att se till att alla positiva fisk är markerade. GFP-positiva T-Alla celler kommer att gå> 50% av djurets mellan dagar 45-70.
I den medföljande exempel var zebrafisk offrade på 65 dagar i livet, och leukemiceller var isolerade och FACS sorteras för att begränsa utspädningen transplantation. Enstaka celler som var propidiumjodid negativa och GFP-positiva (figur 2) var sorteras i ett 96-brunnar. Ny analys gjordes på 10 tusen sorterade celler för att bedöma lönsamheten (helst> 95%) och renhet (helst> 92%, Figur 2). Transplanterade T-ALLS I regel uppstår innan 28 dagar, men vissa tumörer kan ta mer än 60 dagar att utveckla. I detta exempel vid dag 28 var tidigt stadium tumörer ses som ett område av GFP-positiva celler i närheten av injektionsstället (Figur 3B), medan vissa T-ALLS var mer framåt, efter att ha utvidgats till att fylla bukhålan (figur 3C) . Data från begränsa utspädningen analyser celltransplantation från tre olika primära T-ALLS visas i Figur 3D. För dessa experiment, var över 220 djur transplanteras, som lätt kan göras genom att en person inom flera timmar. Dataanalys Elda programvara visade att i genomsnitt 1 i 135 T-Alla celler var själv förnya leukemi-förökningsmaterial celler (figur 3E).
Figur 1 Zebrafish larver injiceras i en-cells scen med trasa.::-CMyc + trasa::-EGFP visades för primär leukemi tillväxt 28 dagar efter injektion. Fisk (*) hade GFP-positiva T-celler i thymus, den här fisken kommer att utveckla T-ALL som T-cellerna förvandlas med tiden. Detta steg är mycket vanligt vid dag 28. En fisk (**) hade en avancerad T-ALL som har spridit sig i den mjuka vävnaden. De återstående två fiskar är negativa för tumörtillväxt. Bilden togs vid 16x förstoring.
Figur 2. Fluorescerande-märkta T-Alla celler sorterades från sjuka djur och används i den begränsande utspädning celltransplantation analys. Först var en grind dras att välja enstaka celler (övre vänstra panelen), är sedan propidiumjodid negativa celler valt (mitten till vänster). Slutligen var en grind dras till endast välja GFP-positiva leukemiceller för sortering (nedre vänstra panelen). Sorterade celler bör analyseras om att bedöma lönsamheten och renhet innan transplantation (höger sida).
Figur 3. Zebrafish undersöktes för leukemi tillväxt 28 dagar efter transplantationen. Fisk är antingen tumör negtiva (A), har en liten tumör växer vid injektionsstället (B), eller har en kommit leukemi (C). Bilderna togs på 7X förstoring. Det totala antalet leukemi-positiva fisk per totala antalet fiskar transplanterade vid varje spädning registreras, som i (D). Uppgifterna matas in i webbaserade Elda program för att beräkna antalet själv förnya leukemiceller och den övre och nedre 95% konfidensintervall (E).
Discussion
En stor styrka med hjälp av zebrafisk inom cancerforskningen är att ett stort antal djur kan användas till relativt låg kostnad. Detta är särskilt viktigt för att begränsa utspädningen analyser celltransplantation, där proportionerna av transplanterade djur som utvecklar tumörer till det totala antalet transplanterade används för att bestämma tumör-initiera cellens frekvens. I den metod som presenteras här, är över 70 transplantationer mottagaren djur som används per analys, som ger en korrekt uppskattning av tumör-sprida cell nummer. Både antalet djur som används och de doser av tumör transplanterade cellerna bör optimeras för en viss cancerform modell, till exempel om inledande experiment visar tumör-inledande celler är sällsynta, kan nyttiga transplantationen doser 100.000, 50.000, 10.000 och 1000 celler per transplantation.
Syngena zebrafisk stammar är användbara för att begränsa utspädningen analys. Men dessa stammar ännu inte vanligt förekommande i alla laboratorier, och en del zebrafisk cancer modeller finns bara i allogen fisk. Begränsa utspädningen cell transplantationer kan utföras i vildtyp stammar som genomgått immun ablation, men själv förnya celler Frekvensen kan beräknas som 10 till 100 gånger högre än om syngena zebrafisk användes 8. Det är viktigt att notera att större doser av celler som ska användas för transplantation till icke-immuna matchas, bestrålade mottagare, eftersom vissa tumörceller inte kommer att överleva transplantation till en utländsk mikromiljö. Dessutom kommer många tumörer börjar på tillbakagång efter 21 dagar när mottagaren djurets immunförsvar återhämtar sig, så djur bör bedömas för tumörtillväxt var 7 dagar efter transplantationen.
Metoderna som presenteras här är anpassade för användning med någon zebrafisk cancer modell, och har hittills använts för att bestämma tumör-initiera cell frekvens i både T-cells akut lymfatisk leukemi 8, och en solid tumör modell, rabdomyosarkom 16. Dessa tumörer har fluorescerande av samtidig injektion av embryon med både en onkogen och fluorescerande markör, eftersom DNA samarbete segregerar, kommer varje cell som manifesterar den onkogen också uttrycka det fluorescerande proteinet 17. Medan fluorescens rekommenderas eftersom det underlättar spårning av tumörtillväxt utan att behöva offra djuret och ger en rättfram sätt att isolera tumörceller med FACS, är det möjligt att märka tumörceller med antikroppar mot tumör-specifika beslutsfattare för att underlätta deras rening kan även antikroppar färgning i zebrafisk kräver optimering.
Slutligen, när förekomsten av tumör-förökningsmaterial celler har fastställts för en viss tumörtyp, är det möjligt att använda dessa analyser för att identifiera de mekanismer som styr deras cell frekvens. Till exempel kan primära tumörceller behandlas med väg specifika hämmare innan begränsa utspädning transplantation eller transplanterade fisk själva kan doseras med droger. Dessutom kan genetik tumörer sig manipuleras genom att injicera en-cells stadiet fisk med en gen, så att den resulterande primära tumörer kommer att över-uttrycker genen. I dessa försök kommer någon effekt på egen förnya celler iakttas i den begränsande utspädning analyser.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansiering har tillhandahållits av NIH bidrag 5T32CA09216-26 (för JSB) och K01 AR055619-01A1 och 3 K01 AR055619-03S1 (för DML), liksom av Alex Lemonade Stand-stiftelsen, Harvard Stem Cell Institute och American Cancer Samhället.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Zhou, B. -B. S. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).
- Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice. Stem Cells. 15, 199-207 (1997).
- Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption. J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Taylor, A. M., Zon, L. I. Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation. Zebrafish. 6, 339-346 (2009).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).
- Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish. Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).
- Smith, A. C. H. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells. Science. 317, 337-337 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Langenau, D. M. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. , (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).
- Ignatius, M. S. In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth. , Forthcoming (2010).
- Langenau, D. M. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).
