Summary
Sınırlandırılması seyreltme hücre nakli deneyleri, tümör yayılan hücrelerinin sıklığını belirlemek için kullanılır. Bu protokol, floresan etiketli lösemi ve yetişkin zebrafish periton boşluğuna seyreltme sınırlayan bu lösemi hücreleri izole etmek ve nakli nasıl detayları gelişen singeneik Zebra balığı üretmek için bir yöntem açıklanır.
Abstract
Kendini sürekli yenileyen kanser hücrelerinin tümör büyümesini teşvik etmek için sınırsız bir yeteneğe sahip bir tümör içinde tek hücre tipleri, ve böylece yayılan tümör hücreleri veya tümör başlatan hücreleri olarak bilinir. Bu, hastanın prognozu 1 büyük ölçüde geliştirerek, bu yıkımı için kendini sürekli yenileyen hücreleri hedef tümörün ilerlemesini engellemek ve nüks durdurmak olacağı düşünülmektedir. Sıklığını belirlemek için en yaygın yolu kendi kendini yenileyen bir tümör hücreleri içinde artan dozlarda alıcı hayvanlar tümör hücreleri nakledilen bir sınırlayıcı seyreltme hücre nakli testi tümörler gelişir hayvanların oranı sayısını hesaplamak kullanılır kendi kendini yenileyen hücreler içinde orijinal tümör örneği, 2, 3 . İdeal olarak, çok sayıda hayvan doğru yayılan tümör hücreleri, sıklığını belirlemek için her sınırlayıcı seyreltme deneyde kullanılacak. Ancak, büyük ölçekli deneyler fareler içeren pahalı ve en sınırlayıcı seyreltme testleri Deneme başına sadece 10-15 fareler kullanır.
Zebra balığı, genetik manipülasyon ve büyük ölçekli deneyler yapılabilir hangi ekonomi kendi kolaylığı nedeniyle büyük bir kısmı, bir kanser model olarak önem kazanmıştır. Ayrıca, zebrafish modellenir kanser türleri kendi meslektaşı insan hastalığı 4 yakından taklit olduğu tespit edilmiştir. Alıcı hayvanların alt öldürücü ışınlama, 21 gün sonra bağışıklık sisteminin yenilenme başka bir balık tümör hücrelerinin nakli için mümkün olsa da genellikle tümör regresyonu 5 neden olur. Singeneik zebrafish son yaratılması tümör nakli çalışmaları büyük ölçüde 6-8 kolaylaştırmıştır . Bu hayvanlar sağlam alıcı balık, ve tümör büyüme içine genetik olarak aynı, nakledilen tümör hücreleri aşılamak olduğundan uzun süre üzerinden takip edilebilir. Singenik zebrafish, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı 9, 10 hafife bir yabancı mikroçevresinin büyüme, uyum sağlamak zorunda değilsiniz, bu tümör hücrelerinin seyreltme nakli deneyleri sınırlandırmak için idealdir. Ayrıca, tek hücre nakli başarıyla kendini sürekli yenileyen hücre sıklığı daha doğru bir tahmin sağlamak için hizmet, her ikisi de, kolay ve ekonomik bir kerede transplante edilebilir singeneik zebrafish 8 ve birkaç yüz hayvanlar, kullanarak tamamlanmıştır .
Burada singeneik zebrafish ilköğretim floresan etiketli T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) oluşturma ve kendini sürekli yenileyen hücre sıklığını belirlemek için bu tümörler erişkin balık seyreltme sınırlayıcı nakli için bir yöntem sunulmuştur. Lösemi bir örnek olarak verilmiştir iken, bu protokolü, zebrafish herhangi bir kanser modeli kullanılarak yayılan tümör hücreleri sıklığını belirlemek için uygundur.
Protocol
1. Zebra balığı embriyoların DNA mikroenjeksiyon
- Rag2 Linearize: cMyc ve rag2: GFP 11 DNA yapıları 37 ° C gecede Noti her plazmid 10μg sindirerek.
- Fenol: kloroform ekstresi ve plazmid çökelek ve 20μL H 2 O. her tekrar süspansiyon
- DNA konsantrasyonu yüksek oranda DNA merdiveni 20μL, 10μL ve 5μL% 1 agaroz jel üzerinde her sindirilir plazmid 1:1, 1:5 ve 1:10 seyreltme çalıştıran belirleyin. Nicelikleme Bu tür genelde bir spektrometre okuma daha doğru.
- DNA CG1-gerinim (ya da diğer singeneik suşu) içine enjeksiyon için 1M KCl 0,5 X TE 60ng/μL bir final konsantrasyon sulandırınız zebrafish embriyoları kullanarak 30ng/μL rag2: cMyc + 30ng/μL rag2: GFP.
- Enjeksiyonlar önceden gösterilmiştir 12, 13 olarak yapılmalıdır. Kısacası, erkek ve kadın zebrafish çiftleşme odalarında bir gece önce enjeksiyon ayarlanır. Enjeksiyon gününde, DNA enjeksiyon iğnesi yüklenir, basınç 50μm çaplı bir kabarcık bir sahne mikrometre ile ölçülür, (30pg DNA) sınırdışı şekilde ayarlanır. Daha sonra, embriyolar DNA hücre içine yumurta sarısı içine enjekte ve tek hücreli aşamada enjekte edilir. Survival enjekte CG1 embriyoları ve larvaları, genellikle kötü ve sadece% 5 balık transgen başarıyla bir araya getirecek, bu yüzden> 600 embriyolar bazı balık lösemi gelişecektir sağlamak için enjekte edilmelidir.
- 28.5 ° C'de enjekte edilen embriyolar Mağaza ve 24 saat sonra ölü embriyolar kaldırmak. Hayvanlar daha sonra 5 gün yaşam büyük tanklara aktarılır ve daha önce 14 açıklandığı gibi kaldırdı.
2. Birincil T-ALL Zebra balığı larvaları için tarama
- Enjeksiyon sonrası yaklaşık 28 gün, bir petri balık sistem su 25ml 4NG / m Tricane-S 200μL ekleyerek larva zebrafish uyutmak.
- T-ALL 485/20 bir dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresans (Şekil 1) tespit etmek için filtre kullanarak, 20X büyütme Epifloresans bir mikroskop kullanılarak floresan-etiketli larva gelişimi için inceleyin.
- Negatif olanlar ayrı tümör pozitif larvaları. Negatif larvaları daha sonraki bir zaman noktasında muayene olabilir, bir kez tümörleri herhangi bir T-ALL olumlu balık cevapsız emin olmak için, daha büyük artış var olabilir.
- Monitör T-ALL Epifloresans mikroskop kullanılarak tümör büyümesini izlemek için her hafta en az bir kez olumlu bir balık.
3. İzolasyon ve saflaştırma floresan etiketli birincil lösemi hücrelerinin
- GFP pozitif lösemi hücrelerinin>% 50 hayvanın elinden almış, 9ml balık sistemi su içeren bir petri 4ng/mL Tricane-S 1ml ekleyerek balık kurban.
- Balık hücreleri tampon% 5 fetal sığır serumu ile 1mL 0.9X PBS içeren yeni bir petri kabına yerleştirin. Bir jilet, pipetlemeyin büyük hücre kümeleri ayırmak karışımı ile balık ıslatarak yumuşatmak, sonra 50ml tüp içine 40μm mesh süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. Bu tek hücre içine bütün doku kümeleri ayırmak gerekli değildir.
- 4ml polistiren tüp hücrelerinin pipetleyin 500μL. Ölü hücreleri etiket 1μL 1mg/ml propidium iyodür (PI), ekleyin. Vortex, daha sonra buz üzerinde hücreler tutun.
- , Vahşi bir CG1 balık türü Kurban ıslatarak yumuşatmak ve toplam 50ml tüp 0.9X PBS transplant.Add 4ml% 5 FBS sırasında, tümör hücreleri için bir taşıyıcı olarak hizmet normal hücreleri toplamak için, yukarıdaki gibi aynı şekilde zorlanma 5 ml'lik bir hacim.
- 96 plaka pipetlemeyin 100μL/well sonra, 0.9X PBS içinde% 5 FBS normal hücreleri, sulandırmak için 3x10 5 hücre / mL sayın.
- Aşağıdaki dozlarda kan hücreleri içeren 96 plaka bir Floresan Aktive Hücre Sıralayıcısı (FACS), tür, GFP pozitif, PI negatif tümör hücreleri (Şekil 2A, B): 10 hücre / 48 kuyu, 100 hücre / kuyu içine 24 kuyu, 1000 hücre içine / 12 kuyu, ve 10.000 hücre içine / 6 kuyu içine. Ayrıca, 10.000 hücreleri normal kan hücrelerinin olmadan bir kuyunun içine sıralanmış ve tekrar analiz sıralanmış hücreleri saflık ve canlılığını değerlendirmek için (Şekil 2C) FACS kullanarak olmalıdır.
4. Yetişkin zebrafish seyreltme nakli sınırlandırılması
- Pelet 2000xg 96-iyi bir plaka 10 dakika santrifüj edilerek hücreleri.
- Süpernatantı 95μL çıkarın ve kalan 5μL hücrelerin tekrar süspansiyon.
- Bir yetişkin (> 60 gün) singeneik zebrafish ventral tarafta tutun, ve 26g / 2 "mikro şırınga kullanarak, periton boşluğuna hücre süspansiyonu enjekte. Zebra balığı nakli öncesi anestezi olmak zorunda değilsiniz. Tipik olarak, 45 balık, 10 lösemi hücreleri ile nakledilen, 20 ile 100 hücre nakledilen, 7, 1000 hücreleri ve 5 balık ile nakledilen 10.000 T-ALL hücreleri nakledilen.
5. Lösemi başlatan hücre frekans belirlemek için analiz
- Nakli yaklaşık 28 gün sonra, bir 485/20 dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresan tespit için filtre kullanarak bir epifluoresence mikroskop ile nakledilen balık inceleyin. Enjekte edilen balıkların toplam sayısı başına olumlu bir balık numarasını kaydedin.
- Tekrar gözden geçirin 90 gün kadar her 14 günde bir balık ve pozitif balık sayısını kaydedin. Can çekişen bir tümör pozitif balık hale geldiğinde, Tricane-S aşırı doz hayvan kurban.
- Şekil 3 boyutlu olarak gösterildiği gibi bir tabloya sonuçları, Giriş. Web tabanlı ELDA (Extreme sınırlandırılması Seyreltme Analizi) istatistiksel yazılım veri yükleme http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html tümör pozitif ve negatif hayvanların frekansı kullanır 15, birincil T-ALL içinde kendini sürekli yenileyen lösemi hücrelerinin sıklığını belirlemek için her doz nakli.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Singeneik balık embriyolara DNA mikroenjeksiyon genellikle 24 saat boyunca hayatta kalan embriyoların <% 60 ile enjekte edilen embriyoların bir hayatta kalma oranı düşük sonuçları. Ayrıca, enjekte singeneik balık yaşam genellikle larva gelişimi sırasında, genellikle kötü <% 20, 28 gün boyunca hayatta. T-ALL gelişecektir transgenik balık oluşturmak için çok sayıda embriyo enjekte bu nedenle önemlidir.
Bir örnek olarak, CG1 gerginlik embriyolar rag2 enjekte edildi: cMyc + rag2: GFP. Transgenlerin GFP ifade her hücre cMyc ifade, böylece gelişmekte olan embriyonun co-ayırınız. Larva T-ALL 28 gün sonra (Şekil 1), ilköğretim için tarandı. Önceki iş enjekte balık yaklaşık% 5 (Şekil 1), timus içinde T-hücrelerinin GFP pozitif olduğunu göstermiştir ve bu balıkların% 100, T-hücrelerinin dönüştürülmüş 11 olarak lösemi gelişecektir . Zebrafish küçük bir kısmı, 28. günde tespit etmek çok kolaydır, daha gelişmiş lösemi sahip olsa da, çoğu sadece bir GFP pozitif timus (Şekil 1) sahip olacak, böylece larva tüm olumlu sağlamak için yüksek büyütme altında tek tek incelenir olmalıdır balık seçilir. GFP pozitif T-ALL hücrelerinin>% 50 hayvanın gün 45-70 arasında geçeceği tahmin ediliyor.
Zebrafish verilen örnekte 65 gün yaşam kurban edildi ve lösemi hücreleri izole edildi ve FACS seyreltme nakli sınırlandırmak için sıralanır. Tek hücre propidium iyodür negatif ve GFP pozitif (Şekil 2) 96-plaka halinde sıralanır. Reanalysis canlılığı (ideal% 95) ve saflık değerlendirmek için 10.000 sıralanmış hücreleri üzerinde yapıldı (ideal>% 92, Şekil 2). Nakledilen T-alls genellikle 28 gün önce ortaya çıkan, ancak bazı tümörler geliştirmek için 60 gün daha sürebilir. Bu örnekte bazı T-alls (Şekil 3C) periton boşluğu doldurmak için genişletilmiş olan, daha ilerledi iken, 28. günde, erken evre tümörler, enjeksiyon bölgesi (Şekil 3B) yakın GFP pozitif hücreler bir alan olarak görüldü . T-alls üç farklı ilköğretim seyreltme hücre nakli deneyleri sınırlayıcı elde edilen veriler Şekil 3 boyutlu olarak gösterilmiştir. Bu deneyler için, 220'den fazla hayvan, birkaç saat içinde tek bir kişi tarafından kolayca yapılabilir hangi, nakledilen. ELDA yazılımı kullanarak Veri analizi, ortalama 1 135 T-ALL hücreleri yayılan lösemi hücreleri (Şekil 3E), kendini sürekli yenileyen, o gösterdi.
Şekil 1 Zebra balığı larvaları, bez ile tek hücreli aşamada enjekte:: cMyc + bez:-eGFP birincil lösemi büyüme için tarandı 28 gün sonrası enjeksiyon . Balık (*) T-hücrelerinin timus içinde GFP pozitif vardı; T-hücrelerinin zaman içinde dönüştürülmüş olarak bu balığın T-ALL gelişecektir. Bu aşama, 28 gün çok yaygın. Bir balık (**) gelişmiş bir T-ALL yumuşak doku içine yayıldı. Kalan iki balık tümör büyüme için olumsuz. 16x büyütme görüntü alındı.
Şekil 2 floresan etiketli T-ALL hücreler hastalıklı hayvanların sıralanır ve sınırlayıcı seyreltme hücre nakli tayininde kullanıldı. Birincisi, bir kapı, tek hücreleri (sol üst panel) seçmek için çizilmiş oldu, sonra propidium iyodür negatif hücreler (orta sol panel) seçilir. Son olarak, bir kapı sadece GFP pozitif sıralama için lösemi hücrelerinin (sol alt panel) seçmek için çizilmiş oldu. Sıralama hücre nakli öncesi canlılığı ve saflık (sağ paneller) değerlendirmek için tekrar analiz edilmelidir.
Şekil 3 Zebra balığı nakli 28 gün sonra lösemi büyüme yönünden incelendi. Fish ya tümör negatiffonlanır (A), (B) enjeksiyon yerinde büyüyen küçük bir tümör, ya da ilerlemiştir lösemi (C). 7X büyütme görüntüleri alınmıştır. Her seyreltme nakledilen balık toplam sayısı başına lösemi pozitif balık toplam sayısı (D) olarak kaydedilir. Veri sayısını hesaplamak için web tabanlı ELDA programına girdi, kendini sürekli yenileyen, lösemi hücrelerinin ve alt ve üst% 95 güven aralığı (E).
Discussion
Kanser araştırma zebrafish kullanarak büyük bir gücü nispeten düşük maliyetle çok sayıda hayvan kullanılabilir olması. Bu nakledilen toplam sayısı tümörler gelişir nakledilen hayvanların oranlarda tümör başlatan hücre frekansı belirlemek için kullanılan seyreltme hücre nakli deneyleri, sınırlayıcı özellikle önemlidir. Burada sunulan yöntem, 70'in üzerinde transplant hayvanlar yayılan tümör hücre sayısının doğru bir tahmin, analiz başına kullanılır. Faydalı nakli dozlarda kullanılan hayvanların sayısı ve tümör hücreleri nakledilen dozu her ikisi de belli bir kanser model için optimize edilmiş olmalıdır, örneğin, ilk deneylerde, tümör başlatılması hücreler nadirdir gösterirseniz, 100.000, 50.000, 10.000 ve kişi başına 1.000 hücreleri olabilir nakli.
Singenik zebrafish suşları seyreltme analizi sınırlamada yararlı. Ancak, bu suşların henüz yaygın olarak tüm laboratuarlarda kullanılan ve bazı zebrafish kanser modelleri sadece allojenik balık mevcut değildir. Kendini sürekli yenileyen hücre frekans singenik zebrafish 8 kullanılmış olsaydı göre 10-100 kat daha yüksek olarak hesaplanmıştır olabilir, ancak sınırlandırılması seyreltme hücre transplantasyonu, bağışıklık ablasyon geçiren vahşi-tip suşlar yapılabilir . Bazı tümör hücreleri yabancı bir mikroçevresinin nakli hayatta olmaz gibi, hücrelerin daha yüksek dozlarda non-immün eşlemeli, ışınlanmış alıcıların içine nakli için kullanılması gerektiğini not etmek önemlidir. Ayrıca, alıcı hayvanın bağışıklık sistemi kurtarır 21 gün sonra birçok tümörde gerileme başlayacak, bu yüzden hayvanların her 7 gün nakli sonrası tümör büyüme için değerlendirilmelidir.
Burada sunulan yöntemler herhangi bir zebrafish kanser modeli ile kullanım için uygundur ve şimdiye kadar belirlemek için kullanılır olmuştur tümör başlatılması T-hücreli akut lenfoblastik lösemi 8, ve solid tümör modeli, rabdomyosarkom 16 hücre frekansı . Bu tümörler floresan bir onkogen ve floresan işaretleyici hem de embriyo ko-enjeksiyon etiketli; DNA co-ayıran, onkogen ifade herhangi bir hücreyi, floresan proteini 17 ifade çünkü . Hayvan kurban etmek gerek kalmadan tümör büyümesini izleme kolaylaştırır ve FACS tümör hücreleri izole etmek için ileri düz bir yol sağlar çünkü floresan tavsiye edilir iken, kendi arıtma kolaylaştırmak için, tümör spesifik vericiler antikorlar ile tümör hücrelerinin etiket mümkün zebrafish da olsa antikor boyama optimizasyon gerekebilir.
Son olarak, bir kez, tümör yayılan hücrelerinin sıklığı belirli bir tümör türü için tespit edilmiştir, bu testlerin kendi cep frekansını yöneten mekanizmaları tanımlamak için kullanmak mümkündür. Örneğin, seyreltme nakli ya da kendilerini uyuşturucu ile dozajlanarak olabilir nakledilen balık sınırlayan önce primer tümör hücrelerinin yolağı spesifik inhibitörleri ile tedavi edilebilir. Ayrıca, tümörler kendilerini genetiği sonucunda primer tümör gen-express böylece, tek hücreli bir sahne balık ilgi bir gen enjekte ederek manipüle olabilir. Bu deneylerde, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı üzerinde herhangi bir etkisi sınırlayıcı seyreltme testleri görülecektir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Finansman NIH hibe 5T32CA09216-26 (JSB için), ve K01 AR055619-01A1 ve 3 K01 AR055619-03S1 (DML için), yanı sıra Alex'in Limonata Standı Vakfı tarafından, Harvard Kök Hücre Enstitüsü ve Amerikan Kanser tarafından sağlanan edilmiştir vardır Toplum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Zhou, B. -B. S. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).
- Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice. Stem Cells. 15, 199-207 (1997).
- Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption. J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Taylor, A. M., Zon, L. I. Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation. Zebrafish. 6, 339-346 (2009).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).
- Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish. Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).
- Smith, A. C. H. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells. Science. 317, 337-337 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Langenau, D. M. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. , (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).
- Ignatius, M. S. In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth. , Forthcoming (2010).
- Langenau, D. M. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).
