Summary
מאמר זה מתאר
Abstract
הפצה גרורתי של תאים ממאירים דורשת פירוק של קרום במרתף, התקשרות של תאים סרטניים להאנדותל של כלי דם, נסיגה של צמתים האנדותל וסופו של דבר פלישה והגירה של תאים סרטניים באמצעות שכבת האנדותל כדי להיכנס למחזור הדם כאמצעי תחבורה לאתרים מרוחקים בשורה 1-3. פעם אחת במערכת הדם, תאים סרטניים לדבוק נימי קירות וextravasate לרקמה שמסביב כדי ליצור גידולים גרורות 4,5. הרכיבים השונים של אינטראקציה תא תא האנדותל גידול יכולים להיות משוכפלים במבחנה על ידי מאתגר monolayer של תאים אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVEC) עם תאים סרטניים. שבוצעו עם אלקטרונים ומיקרוסקופ שלב בניגוד מחקרים מראים כי ברצף של אירועי מבחנה למדי לייצג את in vivo תהליך גרורתי 6. כאן, אנו מתארים טכניקה מבוססת חשמל, המנטרת את עכבה ומכמתת בזמן אמת על invasיון של תאי האנדותל ידי תאי גידול ממאירים.
Giaever וKeese תוארו לראשונה טכניקה למדידת תנודות בעכבה כאשר אוכלוסייה של תאים גדלות על פני השטח של אלקטרודות 7,8. מכשיר xCELLigence, המיוצר על ידי חברת רוש, מנצל טכניקה דומה כדי למדוד שינויים בעכבה חשמלית כתאים לצרף ולהתפשט בצלחת התרבות מכוסות במערך microelectrode זהב המכסה כ -80% משטח בתחתית באר. ככל שתאים לצרף ולהתפשט על פני האלקטרודה, זה מוביל לעלייה בעכבה חשמלית 9-12. העכבה מוצגת כפרמטר נקרא תא מדד חסר ממדים, העומדים ביחס ישר לשטח הכולל של רקמות התרבות היטב כי הוא מכוסה על ידי תאים. לפיכך, ניתן להשתמש בתאי המדד לפקח הידבקות תא, מתפשט, מורפולוגיה וצפיפות תאים.
Assay הפלישה מתואר במאמר זה מבוסס על שינוייםבעכבה חשמלית באלקטרודה ביניים / תא, כאוכלוסייה של תאים ממאירים לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 1). שיבוש צמתים אנדותל, ההכחשה של monolayer האנדותל והחלפה על ידי תאים סרטניים יוביל לשינויים גדולים בעכבה. שינויים אלו לתאם ישירות עם הקיבולת פולשנית של תאים סרטניים, כלומר, פלישה על ידי תאים אגרסיביים מאוד להוביל לשינויים גדולים בעכבת תא ולהיפך. טכניקה זו מספקת יתרון כפול על פני שיטות קיימות של מדידת פלישה, כגון וידן הקאמרית ומבחני Matrigel: 1) האינטראקציה תא תא האנדותל גידול מחקה באופן הדוק יותר בתהליך vivo, ו2) הנתונים מתקבל בזמן אמת, זמן, והוא בקלות רבה יותר לכימות, בניגוד לניתוח נקודת סיום לשיטות אחרות.
Protocol
1. הכנה
- יש לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים במכסת מנוע בתרבית רקמה.
- תחנת xCELLigence ממוקמת 37 מעלות צלזיוס חממה בנוכחות של 5% CO 2.
- השתמש בתאי HUVEC מעבר נמוכים, רצוי לא יותר מ 6 מעבר. כמו כן, ודא כי התאים הם לא יותר מ 75% ומחוברות בזמן קציר.
- תאי HUVEC גדלים בתקשורת EGM-2 מחדש עם ערכת EGM-2 כדור (Lonza Biosciences) המכילה גורמי גדילה, תוספי מזון ו5% בסרום שור העובר.
- כל העקבות של טריפסין יש להסיר מהשעיות תא על ידי תאים מסתובבים ב200xg, שטיפת פעם עם PBS, וresuspending לצפיפות תאים מצוינים.
- xCELLigence מעיל E-צלחת 16 עם 0.1% ג'לטין במשך שעה 1 ב 37 ° C או הלילה ב 4 ° C. לשטוף צלחת עם PBS ולהוסיף EGM-2 המשוחזרת 100μL תקשורת. לבצע קריאה ריקה במערכת xCELLigence למדוד רקעעכבה בהעדר תאים.
2. יצירת HUVEC monolayer
- קציר בקבוק תת ומחוברות של תאי HUVEC ידי trypsinization. תאי Resuspend בEGM-2 מדיה המשוחזרת לצפיפות סופית של 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל.
- היטב בכל רקע מכויל דואר צלחת המכיל EGM-2 מדיה 100μL, להוסיף 100μL של ההשעיה תא HUVEC (2.5 10 4 תאי HUVEC X).
- מייד להתקין דואר פלייט במכשיר xCELLigence.
- תוכנת xCELLigence תכנית לבצע קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות.
- תן לתאי אנדותל לגדול במשך 18-21 שעות עד שהם יוצרים monolayer, כפי שמעיד על ידי השטחה של מדד תא (איור 2).
3. תוספת של פולשים לתאים ונורמליזצית נתונים.
- ברגע שmonolayer HUVEC יציב יצרה, תאים סרטניים על ידי קציר trypsinization וresuspend למאורות סופייםity של 1 x 10 5 תאים / מ"ל בתקשורת משמשת לגידול תאים סרטניים (כמו RPMI או מדיה DMEM המכיל 10% FBS)
- קריאות עכבת הפסקה על תוכנת xCELLigence ולהסיר דואר פלייט מהתחנה.
- הסר תקשורת EGM-2 על ידי שאיפה. הוסף 100μL של השעיה תא גידול המכילה 1 x 10 4 תאים. באופן כללי, יחס 1:2.5 של תאים סרטניים: בתאי אנדותל זורעים, עובד הכי טוב עבור assay. עם זאת, היחס יכול להיות מותאם לשורות תאים בודדות.
- הנח את דואר הצלחת על מערכת xCELLigence בחממה ולהמשיך קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות.
- פלישה יכולה להיות במעקב בזמן אמת על 6-12 שעות הקרובות כמו ירידה במדד תא בשל הנסיגה של הצמתים אנדותל וחדיר של פולשים לתאים סרטניים.
- לנרמל את התוצאות לזמן של תוספת של פולשים לתאים סרטניים. התוכנה מאפשרת xCELLigence נורמליזציה לכל נקודת זמן ותוצאותניתן לצפות ישירות בחלון התוכנה.
4. נציג תוצאות:
דוגמה לפלישת monolayer HUVEC ידי תאים גרורתי ולא גרורתי מוצגת באיור 3. K7M2 הוא שורת תאי אוסטאוסרקומה גרורתי. תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של חלבון ezrin מקשר cytoskeletal, המהווה את המאפיינים פולשני של קו תא זה 13,14. כאשר תאי HUVEC מאותגרים עם K7M2 תאים, יש ירידה בהתנגדות חשמלית בתוך 6 שעות. ירידה זו בהתנגדות חשמלית מייצגת את הפלישה לmonolayer HUVEC על ידי תאי הגידול הפולשים. תא אונליין K12, לעומת זאת, מבטא רמות נמוכות יותר של ezrin וכתוצאה מכך היא פחות גרורתי 13. מאתגר את monolayer HUVEC עם תוצאות K12 תאים בירידה תלולה פחות בהתנגדות כמו התאים אינם מסוגלים לדבוק או לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 3).
איור 2. היווצרות monolayer HUVEC. שינויים במדד תא כתאי HUVEC לצרף ולהתפשט על אלקטרודות זהב ג'לטין מצופות. היווצרות monolayer ומחוברת מיוצגת על ידי התייצבות במדד תא לאחר 18 שעות.
איור 3. פלישה של תאי HUVEC ידי K7M2 וK12 תאי אוסטאוסרקומה. ירידה חדה בcelL-מדד מתרחש בתוך כמה שעות של ההקדמה של K7M2 תאים גרורתי מאוד. K12 תאים, לעומת זאת, הם פחות גרורתי ולא מצליחין לחדור monolayer האנדותל בצורה יעילה ככל K7M2 תאים. זה מיוצג על ידי ירידה פחות חדה במדד תא כאשר monolayer HUVEC הוא קרא תיגר עם K12 תאים. שליטה מייצגת עכבה של monolayer HUVEC בהיעדרם של תאים סרטניים. ניסויים בוצעו בשלושה עותקים.
Discussion
Assay פלישת HUVEC בזמן אמת הוא שיטה פשוטה, אך רב עוצמה לניטור פלישה. הוא מספק תוצאות בזמן אמת, שהוא יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות אחרות המסתמכות על ניתוח נקודת סיום. Assay יכול להיות שונה כדי בדיקת סמים, נוגדנים, ligands וחלבונים כמעכבים או stimulators של גרורות. ההשפעה של סוכנים שונים על תא האנדותל / הסרטן צולב שיחה ניתן להעריך גם כן. כאשר מציגים את הסוכנים חיצוניים, כגון גורמי גדילה ותרופות בתקשורת ובתרבות, חשוב לוודא שהם אינם משפיעים על שלמות monolayer HUVEC. שיבוש monolayer HUVEC ניתן לבדוק על ידי החדרת סוכן אקסוגני בהיעדרו של פולשים לתאים, ולהבטיח כי לא יחולו שינוי במדד תא. לפיכך, שליטה ובקרה נאותה צריכה להיכלל כחלק מעיצוב ניסיוני.
שונה סלולריים קווים להפגין עקומות תא מדד שונות כפי שהם יוצרים confmonolayer luent. הצורה של העקומה, כמו גם את המקסימום השיג תא מדד, היא סוג תא מסוימת. תאי HUVEC להראות אופייני השטחה של מדד תא חולף 4-6 שעות לאחר זריעה, ואחרי ייצוב נוסף במדד תא גבוה יותר לאחר 16-18 שעות. לפיכך, חשוב לתת לתאים בצורה monolayer ומחוברת ללפחות 18 שעות לפני התוספת של תאים סרטניים.
מאז מדד התא תלוי בסביבה יונית בשלבי ביניים אלקטרודה / תא, גורמים שונים, כגון תאי מורפולוגיה ואיכות של הידבקויות תאי תאים להשפיע על תאי המדד, בנוסף לאזור התחתון המכוסה היטב. לכן, הירידה במדד תא, אשר מתרחשת על פלישת תאי גידול, היא פונקציה של מספר גורמים, הכוללים נסיגה של צמתים האנדותל ופלישת תא גידול שלאחר מכן.
מכשיר xCELLigence מיוצר בשלוש תצורות שונות: מנתח סלולרי בזמן אמת(RTCA) SP, RTCA MP וRTCA עקורים. מכשיר SP RTCA מחזיק אחד E-96 גם צלחת ואילו מכשיר MP RTCA יכול להכיל עד שישה 96, גם E-צלחות בו זמנית. זה מאפשר להקרנת תפוקה גבוהה של תרופות ותרכובות. את הניסויים במאמר זה מבוצעים באמצעות המכשיר העקורים RTCA, שיכול להחזיק שלוש צלחות E-16-כן. כל תחנת דואר צלחת החזקה יכולה להיות מופעלת באופן עצמאי, המאפשרת למשתמשים מרובים כדי להריץ ניסויים בו זמנית. המכשיר העקורים RTCA יכול לשמש גם כדי ללמוד הגירה באמצעות CIM צלחות. אלה הם 16 צלחות היטב עם תאים עליונים ותחתונים מופרדים בפוליאתילן terephtalate (PET) קרום עם גודל נקבובית החציוני של 8um. החיישנים האלקטרוניים הממוקמים בחלק התחתון של הקרום הנקבובי של החדר העליון. התא התחתון משמש כמאגר לchemoattractant לתאים בחדר העליון. עם זאת, יתרון גדול של assay פלישת HUVEC על CIM הצלחות הוא שפלישת תא גידול בי לשעברזה לא מוגבל על ידי הגודל הנקבובית, כמו פלישת תא אנדותל תלוי בצולבת שיחה בין התאים הסרטניים ואנדותל.
Assay פלישת HUVEC יכול גם להתבצע במכשיר Z ECIS, המיוצר על ידי אפלייד ביופיסיקה (טרוי, ניו יורק). מכשיר Z ECIS מנצל טכנולוגיה דומה למכשיר xCELLigence, עם הבדלים בתצורות המערך ואלקטרודה. יש לנו לבצע בהצלחה מבחני פלישת HUVEC באמצעות מערכי ECIS 8-כן. חשוב לציין כי שטח הפנים התחתון גם הוא גדול יותר במערכי ECIS, אשר דורש מספר גדול יותר של תאי האנדותל וגידול להיות מצופה: 2.5 x 10 5 ו 1 x 10 5 תאי בהתאמה.
Disclosures
עלות הפרסום לכתב היד הזה היה מספק בנדיבות על ידי חברת רוש מדע יישומי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בנדיבות על ידי כספים מהקרן לילדים סרטן (בולטימור, MD), ברנדון לי קרינגטון קרן (סילבר ספרינג, מרילנד), DOD (W81XWH-10-1-0137) ו-NIH (R01CA108641).
ברצוננו להודות לד"ר אנטון Wellstein וחברי המעבדה שלו לשיתוף הניסיון שלהם ועוזר לנו לייעל את השיטות שהוצגו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
