Summary
本文介绍了一种
Abstract
转移性传播的恶性细胞需要的基底膜，附件肿瘤细胞对血管内皮细胞，内皮路口回缩终于肿瘤细胞的侵袭和迁移的降解通过内皮细胞层进入血液，作为一种交通工具，到遥远的地方在主机1-3。一旦在循环系统中，癌细胞附着毛细血管和外渗到周围的组织形成转移性肿瘤4,5。具有挑战性的单层的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与肿瘤细胞在体外用肿瘤细胞的内皮细胞间相互作用的各个组成部分可以被复制。与电子和相衬显微镜进行的研究表明，在体外的事件序列公平地代表了在体内转移过程6。这里，我们描述的电阻抗为基础的技术，监视和量化实时invas恶性肿瘤细胞的内皮细胞的离子。
杰伯和基斯首次描述了一种技术，用于测量阻抗的波动，当一群细胞生长的表面上的电极7,8。由罗氏公司生产，该的xCELLigence仪，利用类似的技术来测量电阻抗的变化，细胞附着和扩散在培养皿覆盖的金微电极阵列，覆盖约80％的面积上的井底下。当细胞附着和扩散在电极表面上，它会导致电阻抗增加9-12。的阻抗被显示为一个无量纲的参数被称为细胞指数，这是直接正比于总面积的组织培养细胞所覆盖。因此，细胞指数可用于监测细胞粘附，扩散，形态和细胞密度。
在这篇文章中所描述的入侵检测的基础上变化在上面的电极/细胞间的电阻抗，通过一个人脐静脉内皮细胞单层（图1）作为一个人口的恶性细胞侵入。内皮路口中断，导致肿瘤细胞的内皮细胞单层和更换回缩到大阻抗的变化。这些变化直接与肿瘤细胞的侵袭能力，即，高度侵袭性的细胞入侵导致电池阻抗变化较大，反之亦然。该技术提供了一种测量入侵与现有方法相比，如Boyden小室和基质胶检测两方面的优势：1）的内皮细胞，肿瘤细胞的相互作用更加紧密地模仿体内过程，和2）中得到的真实的数据时间和更容易量化的，而不是终点分析的其他方法。
Protocol
1。准备
- 应执行的所有步骤在无菌条件下，在组织培养罩。
- xCELLigence站被放置在37℃的培养箱中，在5％CO 2的存在下。
- 使用低传代人脐静脉内皮细胞，优选不超过通道6。此外，请确保这些细胞是不超过75％汇合在收获时。
- 人脐静脉内皮细胞的细胞生长在EGM-2个媒体EGM-2子弹试剂盒（龙沙Biosciences公司）在含有生长因子，营养补充剂和5％胎牛血清的重组。
- 胰蛋白酶从细胞悬浮液通过纺纱200xg细胞，用PBS洗涤一次，重悬细胞密度表示应删除所有痕迹。
- 外套xCELLigence电子板16与0.1％明胶1小时，在37°C或一夜之间在4°C。用PBS洗涤板，加重组EGM-2介质。 xCELLigence系统执行一个空白读数测量背景阻抗的情况下的细胞。
2。生成人脐静脉内皮细胞单层
- 收获了一个子汇合烧瓶中的人脐静脉内皮细胞的胰蛋白酶。在复原的EGM-2个媒体的悬浮细胞至最终密度为2.5×10 5个细胞/ ml。
- E-板的背景校准含有100μL的EGM-2个媒体的各孔中，加入100μL的脐静脉内皮细胞的细胞悬浮液（2.5×10 4个HUVEC细胞）。
- xCELLigence仪器，电子盘立即安装。
- 程序xCELLigence软件来执行阻抗读数，每隔10分钟。
- 内皮细胞生长18-21小时，直到它们形成一个单层，证明细胞指数（图2）平坦化。
3。此外侵入细胞和数据规范化。
- 一旦已形成稳定的人脐静脉内皮细胞单层，收获肿瘤细胞，胰酶消化，重悬到最终窝点性为1×10 5细胞/ ml介质中用于生长的肿瘤细胞（如RPMI或DMEM培养基含10％FBS）
- 暂停阻抗读数用xCELLigence软件和删除电子盘从站。
- 删除临时股东大会通过抽吸-2介质。含1×10 4个细胞的肿瘤细胞悬浮液中添加100μL。一般来说，1:2.5的比例对肿瘤细胞：内皮细胞接种，最好的检测。但是，该比率可以被优化为单个细胞系。
- xCELLigence系统将在E-板的孵化器，并继续阻抗读数，每隔10分钟。
- 入侵，可以在未来的6-12小时的实时监控，由于回缩内皮路口和渗透入侵的肿瘤细胞，在细胞指数下降。
- 规范化入侵肿瘤细胞的添加时的结果。 xCELLigence软件允许正常化的任何时间点和结果可以直接在软件窗口中观察。
4。代表性的成果：
转移和非转移细胞的人脐静脉内皮细胞单层的入侵，例如，如图3所示。 K7M2是一个转移的骨肉瘤细胞株。这些细胞表达高水平的细胞骨架连接蛋白埃兹，占侵入该细胞系13,14。当面临的挑战与K7M2细胞HUVEC细胞，电阻下降，在6小时内。此下拉电阻代表脐静脉内皮细胞的单层侵入肿瘤细胞的侵袭。另一方面，K12细胞系，表达水平要低得多埃兹，因此转移13。挑战在一个较陡的下降阻力K12细胞HUVEC单层细胞是无法坚持通过脐静脉内皮细胞单层（图3）或入侵。
图2。脐静脉内皮细胞单层形成 。在细胞指数的变化人脐静脉内皮细胞附着和传播明胶涂层的金电极。融合单层的形成一个稳定的，在18小时后的细胞指数表示的。
图3。 K7M2和K12骨肉瘤细胞HUVEC细胞的入侵 。陡峭的下降在CELL-指数发生在几个小时内引进K7M2高转移细胞。 K12细胞，在另一方面，不转移，无法穿透内皮细胞单层的效率，因为K7M2细胞。这是代表较少HUVEC单层挑战与K12细胞时细胞指数急剧减少。控制指的脐静脉内皮细胞单层在癌细胞的情况下的阻抗。实验一式三份进行。
Discussion
实时人脐静脉内皮细胞的入侵检测，入侵监测是一个简单但功能强大的方法。实时提供结果，这是一个显着的优势超过其他传统技术，依靠终点分析。该试剂盒可以进行修改，作为转移的抑制剂或刺激剂的试验药物，抗体，配体和蛋白质。内皮细胞/肿瘤细胞串扰的影响，不同的代理商可以评估。引入外源剂，如培养基中的生长因子和药物时，它是重要的，以确保它们不会影响人脐静脉内皮细胞单层的完整性。可以通过引入外源剂在没有侵入细胞的情况下，确保没有任何改变在细胞指数测试的人脐静脉内皮细胞单层的破坏。因此，适当控制应包括实验设计的一部分。
不同的细胞系表现出不同的细胞指数曲线，他们形成了一个机密单层luent。的形状的曲线，以及最大达到细胞指数，是细胞类型特异性的。特征瞬态细胞指数不上不下4-6小时后播种，然后由另一个稳定在16-18小时后，细胞指数较高的人脐静脉内皮细胞。因此，重要的是让细胞形成肿瘤细胞融合单层至少18小时，然后加入。
由于细胞指数是依赖于在电极/细胞间的离子环境，各种因素，如细胞形态和细胞 - 细胞粘连的质量会影响细胞指数，除了井底部的区域覆盖。因此，在细胞指数下降，其中发生于肿瘤细胞的侵袭，是一个函数的几个因素，其中包括回缩内皮路口和随后的肿瘤细胞的侵袭。
xCELLigence仪器制造三种不同的配置：实时细胞分析仪（RTCA）SP，RTCA MP和RTCA DP。 RTCA SP仪器拥有一个96孔的板，而E-RTCA MP仪器最多可容纳6个96-E-板同时。这使得高通量筛选药物和化合物。在这篇文章中进行的实验使用RTCA DP仪器，可容纳3个16以及E-板。每个E-板控股站可以独立操作，它允许多个用户同时运行实验。 RTCA DP仪器也可以用于学习迁移使用CIM板。这些是由聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜分离，中位孔径为8UM与上部和下部腔室的16孔板中。的电子传感器位于上部腔室的底部的多孔膜。下部腔室作为一个库的上腔室中的细胞的趋化。然而，脐静脉内皮细胞侵袭实验在CIM板的一大优势是，前者肿瘤细胞的侵袭我不是限制孔径，作为血管内皮细胞的侵袭依赖于肿瘤细胞和内皮细胞之间的串扰。
ECIS Z乐器，也可以进行的HUVEC入侵检测，应用生物物理学（特洛伊，NY）制造。 ECIS的Z乐器xCELLigence仪器采用了类似的技术，与数组和电极配置的差异。我们已经成功地执行的HUVEC入侵检测，使用8 ECIS阵列。重要的是要注意，ECIS的阵列，这需要较大数量的内皮细胞和肿瘤细胞：2.5×10 5和1×10 5个细胞分别被镀的底面面积较大。
Disclosures
罗氏应用科学部善意所提供的这份手稿的出版成本。
Acknowledgments
慷慨支持这项工作是从儿童癌症基金会（巴尔的摩，马里兰州），布兰登李卡林顿基金会（马里兰州Silver Spring），国防部（W81XWH-10-1-0137）和美国国立卫生研究院（R01CA108641）的资金。
我们要感谢医生Anton Wellstein的成员分享他们的经验和帮助我们优化提出的方法，他的实验室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
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