Summary
この記事では説明し
Abstract
悪性細胞の転移性播種は、ホスト内遠隔部位への輸送手段として血流に入るため内皮層を介して基底膜、血管内皮への腫瘍細胞の付着、内皮接合の後退及び腫瘍細胞の浸潤および最終的にマイグレーションの分解を必要とする1-3。循環系に一度、癌細胞壁をキャピラリーおよび転移性腫瘍が4,5形成するために周囲の組織に浸出する接着する。腫瘍細胞、内皮細胞との相互作用の様々な構成要素は、癌細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を単層に挑戦することによってインビトロで複製することができる。電子と位相差顕微鏡を用いて行った研究では、イベントのin vitroでのシーケンスでかなり生体転移プロセス6 で表すことを示唆している。ここでは、リアルタイムinvasに監視し、定量化し、電気インピーダンスベースの手法を記述悪性腫瘍細胞による内皮細胞のイオンである。
イェーヴァーとキースは、最初の細胞集団、電極7,8の表面に成長したときにインピーダンスの変動を測定するための手法を説明した。ロシュ社製エクセリジェンス器具は、細胞はウェルの底部に面積の約80％を覆う金微小電極アレイで覆われた培養皿に添付して広がるように、電気インピーダンスの変化を測定するために同様の技術を利用する。細胞が付着して電極表面に広がるように、それは9-12電気インピーダンスの増加につながる。インピーダンスは、細胞によって覆われているウェル組織培養の全面積に正比例するセルインデックスと呼ばれる無次元パラメータとして表示される。したがって、セルインデックスは、細胞接着、拡散、形態および細胞密度をモニターするために使用することができる。
この資料に記載されている浸潤アッセイは、変化に基づいている電極/セル間期における電気インピーダンスで、悪性の細胞集団としてHUVEC単層（図1）を通って侵入する。腫瘍細胞による内皮接合の混乱、内皮単層および交換の引き込みは、インピーダンスの大きな変化につながる。これらの変更は、直接腫瘍細胞の浸潤能との相関、すなわち、極めて積極的な細胞による侵攻がセルインピーダンス、およびその逆の大きな変化につながる。この技術は、ボイデンチャンバーとマトリゲルアッセイなどの侵入を測定する既存の方法、上の二重の利点を提供する：1）内皮細胞、腫瘍細胞の相互作用がより密接にインビボプロセスにおいて模倣する、2）データは、リアルタイムで得られる時間および他の方法のエンドポイント解析とは対照的に、より容易に定量化である。
Protocol
1。準備
- すべてのステップは、組織培養フード内で無菌条件下で実施されるべきである。
- エクセリジェンスステーションは5％CO 2の存在下で、37℃のインキュベーター内に配置される。
- 通路6より好ましくは低継HUVEC細胞を使用してください。また、細胞は収穫時にコンフルエント75％よりも多くされていないことを確認してください。
- HUVEC細胞は、増殖因子、サプリメント、5％ウシ胎児血清を含むEGM-2弾キット（ロンザバイオサイエンス社）を用いて再構成EGM-2培地中で増殖させる。
- トリプシンのすべての痕跡を、200xgで細胞をスピンPBSで1回洗浄し、そして示された細胞密度にそれらを再懸濁することにより細胞懸濁液から除去されるべきである。
- 37℃で1時間0.1％ゼラチンでコートエクセリジェンスE-プレート16°Cまたは一晩4℃でPBSでプレートを洗浄し、100μL再構成EGM-2メディアを追加。バックグラウンドを測定するためのエクセリジェンスシステム上の空白の読みを行う細胞の非存在下でのインピーダンス。
2。 HUVEC単分子層の生成
- トリプシン処理によりHUVEC細胞のサブコンフルエントフラスコを収穫。 2.5×10 5細胞/ mlの最終濃度に再構成されたEGM-2培地で再懸濁した細胞。
- E-プレート含む100μLEGM-2メディア校正され、背景の各ウェルに、HUVEC細胞懸濁液（2.5×10 4 HUVEC細胞）の100μLを追加。
- 直ちにエクセリジェンス機器にE-プレートを取り付けます。
- 10分間隔でインピーダンス測定値を実行するためのプログラムエクセリジェンスソフトウェア。
- （図2）セルインデックスの平坦化によって証明されるように、彼らは、単層を形成するまで、内皮細胞が18〜21時間増殖させて。
3。細胞およびデータの正規化に侵入添加。
- 一度安定したHUVECの単層は、最終的な洞穴にトリプシン処理し、再懸濁により収穫腫瘍細胞を形成しています腫瘍細胞を成長させるために使用される培地中1×10 5細胞/ ml（例えば、10％FBSを含有するRPMI又はDMEM培地など）の性
- ポーズエクセリジェンスソフトウェアのインピーダンス測定値を、駅からE-プレートを取り外します。
- 吸引によりEGM-2メディアを取り出します。 1×10 4個の細胞を含む腫瘍細胞懸濁液100μLを追加します。一般的には、腫瘍細胞の比率1:2.5：内皮細胞播種は、アッセイに最適です。しかしながら、この比は、個々の細胞株に対して最適化することができる。
- インキュベーターでxCELLigenceシステム上のE-プレートを置き、10分間隔でインピーダンス測定値を継続する。
- 侵略は、腫瘍細胞の侵入によって内皮接合と浸透の引き込みによる細胞指数の低下として次の6-12時間にわたってリアルタイムで監視することができます。
- 腫瘍細胞に侵入の添加時に、結果を正規化します。エクセリジェンスソフトウェアは、任意の時点及び結果を正規化を可能にする直接ソフトウェアのウィンドウで表示することができます。
4。代表的な結果：
転移性および非転移性細胞によるHUVEC単層浸潤の例を図3に示されている。 K7M2は、転移性骨肉腫細胞株である。これらの細胞は、この細胞系13,14の侵襲的な性質を占める細胞骨格リンカータンパク質エズリン、高レベルの発現。 HUVEC細胞はK7M2細胞でチャレンジされた場合、6時間以内に電気抵抗の低下がある。電気抵抗のこのドロップは、侵入腫瘍細胞によるHUVEC単層の侵略を表しています。 K12細胞株は、一方では、エズリンはるかに低いレベルで発現し、その結果、13 以下で転移性である。細胞が付着またはHUVEC単層（図3）を通って侵入することができないように抵抗の少ない急なドロップK12細胞結果とHUVEC単層に挑戦。
図2。 HUVEC単層の形成 。 HUVEC細胞はにアタッチし、ゼラチンコートした金電極上に広がるようにセルインデックスの推移。コンフルエントな単層の形成は、18時間後の細胞の安定化インデックスで表される。
図3。 K7M2とK12骨肉腫細胞によるHUVEC細胞の浸潤 。 CELの急激な減少L-インデックスは、高転移性K7M2細胞の導入の数時間以内に発生します。 K12細胞が、その一方で、より少ない転移であり、できるだけ効率的K7M2細胞などの内皮単層を貫通することができない。これは、HUVEC単層は、K12細胞でチャレンジされているセルインデックスで緩やかに減少によって表される。制御は、癌細胞の非存在下でHUVEC単層のインピーダンスを表す。実験はトリプリケートで実施された。
Discussion
リアルタイムHUVEC浸潤アッセイは、監視侵略のため、シンプルでありながら強力な方法である。これは、エンドポイント解析に依存する他の伝統的な技術上の重要な利点である、リアルタイムで結果を提供します。アッセイは、転移の阻害剤または刺激剤として薬物、抗体、リガンドとタンパク質をテストするために変更することができる。癌/内皮細胞のクロストークに異なる薬剤の効果を同様に評価することができる。そのような培養培地中で増殖因子及び薬物として外因剤を導入する場合、それはHUVEC単層の完全性に影響を与えないようにすることが重要である。 HUVEC単層の破壊は、細胞に侵入し、細胞指数に変化がないことを保証するの不在下で外因剤を導入することによって試験することができる。したがって、適切なコントロールは、実験デザインの一部として含まれるべきである。
彼らはconfのを形成するように別の細胞株は、異なる細胞指数曲線を実証luent単層。曲線、ならびに最大セルインデックス達成の形状は、細胞型特異的である。 HUVEC細胞は16〜18時間後に、より高いセルインデックスで別の安定化、続いて4-6時間播種後セルインデックスの平坦化特性の過渡を示す。それゆえ、細胞が腫瘍細胞の添加前に少なくとも18時間コンフルエントな単層を形成させることが重要である。
セルインデックスは、電極/セル間期におけるイオン環境に依存しているので、そのような細胞形態および細胞 - 細胞接着の品質など様々な要因が覆われたウェル底の領域に加えて、セル·インデックスに影響を及ぼす。したがって、腫瘍細胞の浸潤により発生したセルインデックスの減少は、内皮接合部およびその後の腫瘍細胞浸潤の後退を含むいくつかの要因の関数である。
リアルタイム細胞分析装置：エクセリジェンス器具は、3つの異なる構成で製造される（RTCA）SP、RTCA MPとRTCA DP。 RTCA MP楽器が同時に6 96ウェルE-プレートに保持することができ、一方RTCA SPインストゥルメントは、一96ウェルE-プレートを保持しています。これは、薬物と化合物のハイスループットスクリーニングを可能にする。この記事の実験は3つの16ウェルE-プレートを保持できるRTCA DP機器を使用して実行されます。各E-プレート保持局は、複数のユーザが同時に実験を実行することを可能にする、独立して動作することができる。 RTCA DP器具はまた、CIMプレートを使用して移行を研究するために使用することができる。これらは8umのメジアン細孔径を有するポリエチレンテレフタレート（PET）膜によって分離され、上部及び下部チャンバーの16ウェルプレートである。電子センサーは、上部チャンバの多孔質膜の下側に配置されている。下部チャンバーは、上部チャンバー内の細胞のための化学誘引物質のための貯水池として機能します。しかし、CIMプレート上HUVEC浸潤アッセイの主な利点は、前者の腫瘍細胞浸潤I内皮細胞の浸潤が腫瘍および内皮細胞間のクロストークに依存するのは、細孔サイズによって制限されない。
HUVEC浸潤アッセイはまた、応用生物物理学（トロイ、NY）製、ECIS Z機器で行うことができる。 ECIS Zインストゥルメントは、配列と電極構成の違いと、エクセリジェンス機器に同様の技術を利用しています。我々は成功した8ウェルECISアレイを用いたHUVEC浸潤アッセイを行った。それぞれ2.5×10 5〜1×10 5細胞：ウェル底面積が被めっき内皮細胞および腫瘍細胞の多くを必要とする、ECIS配列の方が大きいことに留意することが重要である。
Disclosures
この原稿のための出版費用は親切にロシュ·ダイアグノスティックスによって提供されていました。
Acknowledgments
この作業は、寛大に子供がん財団（ボルティモア、MD）、ブランドン·キャリントンリー財団（シルバースプリング、MD）、DOD（W81XWH-10-1から0137）とNIH（R01CA108641）からの資金によってサポートされていました。
私たちは、博士アントンWellsteinと彼らの経験を共有し、提示された方法を最適化するために、私たちを助けるために彼の研究室のメンバーに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
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