Summary
Denne artikel beskriver en
Abstract
Metastatisk udbredelse af maligne celler kræver nedbrydning af basalmembranen, binding af tumorceller til vaskulært endotel, tilbagetrækning af endotheliale vejkryds og endelig invasion og migration af tumorceller gennem endothellaget at komme ind i blodbanen som et transportmiddel til fjerne steder i værten 1-3. Når i kredsløbssygdomme, kræftceller overholde kapillærvæggene og ekstravasere til det omgivende væv til at danne metastatiske tumorer 4,5. De forskellige komponenter i tumorcelle-endotelcelle vekselvirkning kan efterlignes in vitro ved at udfordre et monolag af humane navlevene endotelceller (HUVEC) med kræftceller. Undersøgelser udført med elektron og fasekontrastmikroskopi tyder på, at in vitro-hændelsesforløbet temmelig repræsenterer in vivo metastatisk proces 6.. Her beskriver vi en elektrisk impedans baseret teknik, der overvåger og kvantificerer i real-tid invasion af endotelceller ved maligne tumorceller.
Giaever og Keese først beskrevet en teknik til at måle udsving i impedansen, når en population af celler vokser på overfladen af elektroderne 7,8. Den xCELLigence instrument, fremstillet af Roche udnytter en lignende teknik til at måle ændringer i elektrisk impedans som celler vedhæfte og spredes i en kultur fad dækket med en guld mikroelektrode array, der dækker cirka 80% af det område på bunden af en brønd. Som celler vedhæfte og spredes på elektrodeoverfladen, det fører til en stigning i elektrisk impedans 9-12. Impedansen vises som en dimensionsløs parameter betegnes celle-indekset, som er direkte proportional med det samlede areal af cellekultur godt der er dækket af celler. Derfor kan celle-indekset anvendes til at overvåge celleadhæsion, spredning, morfologi og celledensitet.
Invasionen assay beskrevet i denne artikel er baseret på ændringeri elektrisk impedans ved elektroden / celle interfase, invadere som en population af maligne celler gennem en HUVEC monolag (figur 1). Afbrydelse af endotel vejkryds, tilbagetrækning af endotelmonolaget og udskiftning af tumorceller fører til store ændringer i impedans. Disse ændringer direkte korrelerer med invasive kapacitet af tumorceller, dvs invasion af meget aggressive celler føre til store ændringer i celle impedans og vice versa. Denne teknik giver en dobbelt fordel i forhold til eksisterende metoder til måling invasion, såsom Boyden kammer og Matrigel assays: 1) den endotelcelle-tumorcelle vekselvirkning mere nøje efterligner in vivo-processen, og 2) dataene opnået i real- tid og er lettere kvantificerbar, i modsætning til end-point analyse for andre metoder.
Protocol
1.. Forberedelse
- Alle trin skal udføres under sterile forhold i en vævskultur hætte.
- Den xCELLigence station er placeret i en 37 ° C inkubator i nærvær af 5% CO2.
- Brug lav passage HUVEC celler, fortrinsvis ikke mere end passage 6.. Sørg også for, at cellerne ikke er mere end 75% sammenflydende på høsttidspunktet.
- HUVEC-celler dyrkes i EGM-2 medier rekonstitueres med EGM-2 bullet-kit (Lonza Biosciences) indeholdende vækstfaktorer, kosttilskud og 5% føtalt bovint serum.
- Alle spor af trypsin bør fjernes fra cellesuspensioner ved spinding cellerne ved 200 x g, vask en gang med PBS, og resuspendering dem angivet celledensiteter.
- Coat xCELLigence E-plade 16 med 0,1% gelatine i 1 time ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C. Vask pladen med PBS og tilsæt 100 gl rekonstitueret EGM-2 medier. Udfør en tom læsning på xCELLigence system til at måle baggrundenimpedans i fravær af celler.
2.. Generering HUVEC monolag
- Harvest en sub-sammenflydende kolbe af HUVEC celler ved trypsinisering. Resuspender celler i rekonstituerede EGM-2 medier til en endelig densitet på 2,5 x 10 5 celler / ml.
- Til hver brønd i en baggrund kalibreret e-plade indeholdende 100 pi EGM-2 medier, 100 gl HUVEC cellesuspension (2,5 x 10 4 HUVEC celler) tilsættes.
- Umiddelbart installere E-Plate i xCELLigence instrument.
- Program xCELLigence software til at udføre impedans målinger med 10 minutters mellemrum.
- Lad endotelceller vokse i 18-21 timer, indtil de danner et monolag, som det fremgår af en udfladning af celle indeks (figur 2).
3.. Tilsætning af invaderende celler og data normalisering.
- Når en stabil HUVEC monolag er dannet, høst tumorceller ved trypsinisering og resuspender til en endelig hulerity på 1 x 10 5 celler / ml i medier, der anvendes til at dyrke tumorceller (såsom RPMI eller DMEM-medium indeholdende 10% FBS)
- Pause impedans aflæsninger på xCELLigence software og fjerner E-Plate fra stationen.
- Fjern EGM-2 medier ved aspiration. Tilføj 100 ul tumorcelle suspension indeholdende 1 x 10 4 celler. Generelt en 1:2,5 forhold mellem tumorceller: endotelceller podet, fungerer bedst for assayet. Dog kan forholdet optimeres til individuelle cellelinier.
- Placer E-pladen på xCELLigence system i rugemaskinen og fortsætte impedans aflæsninger med 10 minutters mellemrum.
- Invasion kan overvåges i realtid i løbet af de næste 6-12 timer som et fald i celle indeks på grund af tilbagetrækningen af endotheliale kryds og gennemtrængning af invaderende tumorceller.
- Normalisere resultaterne til tidspunktet for tilsætning af invaderende tumorceller. Den xCELLigence software tillader normalisering til ethvert tidspunkt og resultatkan direkte ses i softwaren vinduet.
4.. Repræsentative resultater:
Et eksempel på HUVEC monolag invasion af metastatiske og ikke-metastatiske celler er vist i figur 3.. K7M2 er en metastatisk osteosarkom cellelinie. Disse celler udtrykker høje niveauer af cytoskeletal linker protein ezrin, som tegner sig for de invasive egenskaber af denne cellelinie 13,14. Når HUVEC celler udfordret med K7M2 celler, der er et fald i elektrisk modstand inden for 6 timer. Dette fald i elektrisk modstand repræsenterer invasion af HUVEC monolag af de invaderende tumorceller. K12 cellelinje, på den anden side, udtrykker meget lavere niveauer af ezrin og er derfor mindre metastatisk 13.. Udfordrende HUVEC monolaget med K12 celler resulterer i en mindre brat fald i modstand når cellerne er i stand til at klæbe til eller invadere gennem HUVEC monolaget (figur 3).
Figur 2. HUVEC monolag dannelse. Ændringer i celle indekset som HUVEC celler tillægger og spredt på gelatinecoatede guldelektroder. Dannelsen af et sammenflydende monolag er repræsenteret ved en stabilisering af celle indeks efter 18 timer.
Figur 3. Invasion af HUVEC celler ved K7M2 og K12 osteosarcomceller. En stejl nedgang i celL-indeks forekommer inden for et par timer efter indførelsen af stærkt metastatiske K7M2 celler. K12-celler, på den anden side er mindre metastatisk og er i stand til at trænge ind endotelmonolaget så effektivt som K7M2 celler. Dette er repræsenteret ved en mindre stejl nedgang i celle indeks, når HUVEC monolaget er udfordret med K12-celler. Kontrol repræsenterer impedans HUVEC monolag i fravær af kræftceller. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.
Discussion
Realtids-HUVEC invasion analysen er en enkel, men effektiv metode til overvågning invasion. Det giver resultater i realtid, hvilket er en betydelig fordel i forhold til andre traditionelle teknikker, der er afhængige af ende-punkt analyse. Assayet kan modificeres til forsøgsmedikamenter, antistoffer, ligander og proteiner som inhibitorer eller stimulatorer af metastaser. Effekten af forskellige agenter på endotel / kræftcellen cross-talk kan vurderes som godt. Ved indførelse af exogene midler, såsom vækstfaktorer og narkotika i dyrkningsmedier, er det vigtigt at sikre, at de ikke påvirker integriteten af HUVEC monolaget. Afbrydelse af HUVEC monolaget kan testes ved at indføre det exogene middel i fravær af invaderende celler, og sikre, at der ikke er nogen ændring i celle indeks. Derfor bør passende kontroller skal indgå som en del af det eksperimentelle design.
Anden celle-linjer demonstrere forskellige celle-indeks kurver, da de udgør en confluent monolag. Formen af kurven, samt den maksimale celle-indeks opnås, er celletype-specifik. HUVEC celler viser et karakteristisk forbigående udfladning af celle indeks 4-6 timer efter podning, efterfulgt af en anden stabilisering på et højere celle indeks efter 16-18 timer. Derfor er det vigtigt at lade cellerne danner et konfluent monolag i mindst 18 timer før tilsætning af tumorceller.
Da cellen indekset er afhængig af den ioniske miljø ved elektroden / celle interfase, forskellige faktorer såsom celle-morfologi og kvaliteten af celle-celle sammenvoksninger påvirke celle-indekset, i tillæg til det dækkede område af godt bund. Derfor må nedgangen i celle-indekset, som forekommer ved tumorcelleinvasion, er en funktion af flere faktorer, som omfatter tilbagetrækning af endotheliale kryds og efterfølgende tumorcelleinvasion.
Den xCELLigence Instrumentet er fremstillet i tre forskellige konfigurationer: realtid celle analysator(RTCA) SP, RTCA MP og RTCA DP. Den RTCA SP instrument indehaver af et 96-brønds E-plade mens RTCA MP instrumentet kan rumme op til seks 96-godt E-plader samtidigt. Dette giver mulighed for high-throughput screening af stoffer og forbindelser. Eksperimenterne i denne artikel er udføres ved hjælp af RTCA DP instrument, som kan holde tre 16-brønds E-plader. Hver E-plade bedrift station kan uafhængigt drives, som tillader flere brugere at køre eksperimenter samtidigt. Den RTCA DP Instrumentet kan også anvendes til at studere migration hjælp CIM-plader. Disse er 16-brønds plader med øvre og nedre kamre adskilt af en polyethylenterephtalat (PET) membran med en gennemsnitlig porestørrelse på 8um. De elektroniske sensorer er placeret på undersiden af den porøse membran af det øvre kammer. Det nedre kammer tjener som et reservoir for kemoattraktant for celler i det øverste kammer. Men en stor fordel af HUVEC invasion assay over CIM-pladerne er, at tumorcelleinvasion i det tidligere is ikke begrænset af porestørrelsen, som endotelcelle invasion afhænger krydstale mellem tumor-og endotelceller.
HUVEC invasion assay kan også udføres på ECIS Z instrument, fremstillet af Applied Biofysik (Troy, NY). Den ECIS Z instrument anvender en teknologi svarende til xCELLigence instrument med forskelle i rækken, og elektroden konfigurationer. Vi har med succes udført HUVEC invasion assays ved hjælp af 8-brønds ECIS arrays. Det er vigtigt at bemærke, at godt bund overfladeareal er større i ECIS arrays, hvilket kræver et større antal af endothelceller og tumorceller til at være belagt: 2.5 x 10 5 og 1 x 10 5 celler hhv.
Disclosures
Publikationen omkostninger for dette manuskript er venligst leveret af Roche Applied Science.
Acknowledgments
Dette arbejde var generøst støttet af midler fra Børnecancerfonden (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) og NIH (R01CA108641).
Vi vil gerne takke Dr. Anton Wellstein og medlemmer af hans laboratorium for at dele deres erfaringer og hjælpe os med at optimere præsenterede metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
