Summary
Dit artikel beschrijft een
Abstract
Metastatische verspreiding van kwaadaardige cellen vereist afbraak van basaalmembraan, hechting van tumorcellen voor vasculair endotheel, terugtrekken van endotheliale kruispunten en tenslotte invasie en migratie van tumorcellen door de endotheliale laag opgenomen in de bloedstroom als vervoermiddel naar afgelegen plaatsen in het ontvangende 1-3. Eenmaal in de bloedsomloop, kankercellen zich aan capillaire wanden en extravasatie het omringende weefsel om metastatische tumoren 4,5 vormen. De verschillende componenten van tumorcel-endotheelcel interactie in vitro worden gerepliceerd door tegen een monolaag van humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) met kankercellen. Studies uitgevoerd met elektronen en fase-contrast microscopie suggereren dat de in vitro opeenvolging van gebeurtenissen tamelijk vertegenwoordigen de in vivo metastatische proces 6. Hier beschrijven we een elektrisch-impedantie gebaseerde techniek die controleert en kwantificeert in real-time de Invasion van endotheelcellen van kwaadaardige tumorcellen.
Giaever en Keese eerst beschreven een techniek voor schommelingen in impedantie, een populatie cellen groeien op het oppervlak van de elektroden 7,8. De xCELLigence instrument, vervaardigd door Roche, maakt gebruik van een soortgelijke techniek om veranderingen in elektrische impedantie meten en cellen hechten en verspreiden in een kweekschaal bedekt met een gouden micro-elektrode array die ongeveer 80% van het gebied omvat op de bodem van een put. Als cellen hechten en verspreid over het elektrodeoppervlak, leidt tot een toename in elektrische impedantie 9-12. De impedantie wordt weergegeven als een dimensieloze parameter genaamd cel-index, die recht evenredig met de totale oppervlakte van weefsel-kweek en die onder cellen. Derhalve kan de cel-index worden gebruikt voor celadhesie, verspreiding, morfologie en celdichtheid controleren.
De invasie assay beschreven in dit artikel is gebaseerd op veranderingenin elektrische impedantie aan de elektrode / cel interfase, als een populatie van kwaadaardige cellen binnen te dringen door een monolaag HUVEC (Figuur 1). De verstoring van endotheliale kruispunten terugtrekken van endotheliale monolaag en vervanging door tumorcellen leiden tot grote veranderingen in impedantie. Deze veranderingen direct correleren met het invasieve vermogen van tumorcellen, dwz invasie door zeer agressieve cellen leiden tot grote veranderingen in cel impedantie en vice versa. Deze techniek geeft een tweevoudige voordeel boven bestaande meetmethoden invasie, zoals Boyden-kamer en Matrigel assays: 1) de endotheelcel-tumorcel interactie nauwer bootst de in vivo werkwijze, en 2) de gegevens verkregen in real- tijd en is gemakkelijker kwantificeerbaar tegenover eindpunt analyse andere wijzen.
Protocol
1. Voorbereiding
- Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een weefselkweek kap.
- De xCELLigence station is geplaatst in een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2.
- Met lage passage HUVEC cellen, bij voorkeur niet meer dan passage 6. Zorg er ook voor dat de cellen niet meer dan 75% samenvloeiing op het moment van de oogst.
- HUVEC cellen worden gekweekt in EGM-2 media gereconstitueerd met EGM-2 bullet kit (Lonza Biosciences) die groeifactoren, supplementen en 5% foetaal runderserum.
- Alle sporen van trypsine dienen van celsuspensies worden verwijderd door het draaien cellen bij 200xg, eenmaal wassen met PBS, en resuspenderen naar opgegeven celdichtheden.
- Coat xCELLigence E-plaat 16 met 0,1% gelatine gedurende 1 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. Was plaat met PBS en voeg 100 pi gereconstitueerde EGM-2-media. Voer een blanco lezing over de xCELLigence systeem om achtergrond te metenimpedantie in afwezigheid van cellen.
2. Het genereren van HUVEC monolaag
- Oogst een sub-confluente kolf van HUVEC cellen door behandeling met trypsine. Resuspendeer cellen in gereconstitueerde EGM-2 medium tot een uiteindelijke dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen / ml.
- Aan elk putje van een achtergrond gekalibreerde E-plaat met 100 ul EGM-2 media, voeg 100 ul van de celsuspensie HUVEC (2,5 x 10 4 cellen HUVEC).
- Direct te installeren E-Plate in de xCELLigence instrument.
- Programma xCELLigence software om impedantie metingen uitvoeren met een interval van 10 minuten.
- Laat de endotheelcellen groeien 18-21 uur totdat ze een monolaag, zoals blijkt uit een afvlakking van celindex (figuur 2).
3. Toevoeging van binnendringende cellen en data normalisatie.
- Zodra een stabiele HUVEC monolaag heeft gevormd, oogst tumorcellen door behandeling met trypsine en resuspendeer tot een uiteindelijke holenheid van 1 x 10 5 cellen / ml in medium gebruikt om tumorcellen (bijvoorbeeld RPMI of DMEM medium met 10% FBS) groeien
- Pauze impedantie metingen op het xCELLigence software en verwijder E-Plate van het station.
- Verwijder de EGM-2 medium door aspiratie. Voeg 100 pl van tumorcel suspensie bevattende 1 x 10 4 cellen. Algemeen een 1:2,5 verhouding van tumorcellen: endotheelcellen gezaaid beste werkt voor de assay. Echter kan de verhouding worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen.
- Plaats de E-plaat op het xCELLigence systeem in de couveuse en blijven impedantie metingen met een interval van 10 minuten.
- Invasion kunnen worden in real-time de komende 6-12 uur als een daling celindex door het terugtrekken van endotheliale knooppunten en penetratie door binnendringende tumorcellen.
- Normaliseren resultaten na het toevoegen van de binnendringende tumorcellen. De xCELLigence software maakt normalisering tot elk tijdstip en resultatenkunnen direct bekeken worden in de software-venster.
4. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van HUVEC monolaag invasie van metastatische en niet-metastatische cellen wordt getoond in figuur 3. K7M2 is een gemetastaseerd osteosarcoom cellijn. Deze cellen brengen hoge niveaus van het cytoskelet linker eiwit Ezrin, die goed is voor de invasieve eigenschappen van deze cellijn 13,14. Wanneer HUVEC cellen uitgedaagd met K7M2 cellen, er een daling in de elektrische weerstand binnen 6 uur. Deze daling van de elektrische weerstand vertegenwoordigt de invasie van HUVEC monolaag door de binnendringende tumorcellen. De K12 cellijn, anderzijds, drukt veel lagere Ezrin en bijgevolg minder metastatische 13. Het uitdagen van de HUVEC monolaag met K12 cellen resulteert in een minder sterke daling van de weerstand als de cellen niet in staat zijn zich te houden aan of bedreigen via de HUVEC monolaag (Figuur 3).
Figuur 2. HUVEC monolaag formatie. Veranderingen in cel index HUVEC cellen hechten aan en verspreiden op gelatine-beklede gouden elektroden. De vorming van een confluente monolaag wordt vertegenwoordigd door een stabilisatie van celindex na 18 uur.
Figuur 3. Invasie van HUVEC cellen door K7M2 en K12 osteosarcoomcellen. Een sterke daling van de cell-index zich voordoet binnen een paar uur van de invoering van zeer metastatische K7M2 cellen. K12 cellen, daarentegen, zijn minder metastatische en zijn niet in de endotheliale monolaag zo efficiënt K7M2 cellen doordringen. Dit is weergegeven door een minder sterke daling celindex wanneer HUVEC monolaag cellen uitgedaagd met K12. Controle vertegenwoordigt impedantie van HUVEC monolaag in afwezigheid van kankercellen. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
Discussion
De real-time HUVEC invasie assay is een eenvoudige, maar krachtige methode voor het bewaken invasie. Het levert resultaten in real-time, hetgeen een significant voordeel boven andere traditionele technieken die afhankelijk eindpunt-analyse. De test kan worden aangepast om te testen geneesmiddelen, antilichamen, liganden eiwitten en remmers of stimulatoren van metastase. Het effect van verschillende agenten endotheliale / kankercel overspraak kan ook worden beoordeeld. Bij de introductie van exogene middelen zoals groeifactoren en drugs in het kweekmedium is het belangrijk dat zij geen invloed hebben op de integriteit van de HUVEC monolaag. Verstoring van de HUVEC monolaag kan worden getest door het introduceren exogene middel in afwezigheid van binnenvallende cellen, en zorgen ervoor dat er geen verandering in cel index. Daarom moeten passende controles te worden opgenomen als onderdeel van de experimentele opzet.
Verschillende cellijnen tonen verschillende cel-index bochten als ze vormen een confluent monolaag. De vorm van de curve, en het maximum cel-index bereikt is celtypespecifieke. HUVEC cellen een kenmerk voorbijgaande vlakkere celindex 4-6 uur na het uitzaaien, gevolgd door een stabilisatie bij een hogere celindex na 16-18 uur. Daarom is het belangrijk te laten de cellen vormen een confluente monolaag ten minste 18 uur vóór de toevoeging van tumorcellen.
Aangezien de cel index is afhankelijk van de ionische omgeving aan de elektrode / cel interfase verschillende factoren zoals cel-morfologie en de kwaliteit van cel-cel adhesie beïnvloeden cel-index, in aanvulling op het gebied van de goed gevulde bodem. Dus de afname celindex, hetgeen gebeurt bij tumorcel invasie, is een functie van verscheidene factoren, die het terugtrekken van endotheliale kruispunten en daaropvolgende tumorcelinvasie omvatten.
De xCELLigence instrument wordt vervaardigd in drie verschillende configuraties: realtime cell analyzer(RTCA) SP, RTCA MP en RTCA DP. Het RTCA SP instrument houdt een 96-well E-plaat terwijl het RTCA MP instrument kan maximaal zes 96-well E-platen tegelijk. Dit maakt high-throughput screening van geneesmiddelen en verbindingen. De experimenten die in dit artikel worden uitgevoerd met behulp van de RTCA DP-instrument, dat drie 16-well E-platen kan houden. Elke E-plaat voorhanden station kunnen onafhankelijk van elkaar worden bediend, die het mogelijk maakt meerdere gebruikers experimenten tegelijk draaien. De RTCA DP instrument kan ook worden gebruikt om migratie met CIM-plaat onderzoeken. Dit zijn 16-well platen met bovenste en onderste kamers gescheiden door een polyethyleentereftalaat (PET) membraan met een gemiddelde poriegrootte van 8um. De elektronische sensoren bevinden zich aan de onderkant van het poreuze membraan van de bovenste kamer. De onderste kamer dient als een reservoir voor de chemoattractant voor cellen in de bovenste kamer. Echter, een groot voordeel van de HUVEC invasieanalyse via CIM-platen die de tumorcel invasie in de voormalige iis niet beperkt door de poriegrootte, zoals endotheelcellen invasie afhankelijk overspraak tussen de tumor en endotheelcellen.
De HUVEC invasie assay kan ook worden uitgevoerd op ECIS Z instrument, vervaardigd door Applied Biophysics (Troy, NY). De ECIS Z instrument maakt gebruik van een technologie vergelijkbaar met de xCELLigence instrument, met verschillen in de array en elektrode configuraties. We hebben met succes uitgevoerd HUVEC invasie assays met de 8-well ECIS arrays. Het is belangrijk op te merken dat de goed onderste oppervlak is groter in het ECIS arrays, die een groter aantal endotheliale cellen en tumorcellen vereist geplateerd: 2,5 x 10 5 en 1 x 10 5 cellen respectievelijk.
Disclosures
De publicatie kosten voor dit manuscript werd vriendelijk verschaft door Roche Applied Science.
Acknowledgments
Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door fondsen van Children's Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) en NIH (R01CA108641).
Wij danken dr. Anton Wellstein en leden van zijn laboratorium voor het delen van hun ervaring en ons te helpen om gepresenteerde methoden te optimaliseren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
