Summary
Questo articolo descrive una
Abstract
Diffusione metastatica delle cellule maligne richiede degradazione della membrana basale, dell'adesione delle cellule tumorali all'endotelio vascolare, retrazione delle giunzioni endoteliali ed infine invasione e la migrazione delle cellule tumorali attraverso lo strato endoteliale per entrare nel flusso sanguigno come mezzo di trasporto in sedi lontane l'host 1-3. Una volta nel sistema circolatorio, le cellule tumorali aderiscono per capillarità pareti e stravaso al tessuto circostante per formare tumori metastatici 4,5. I vari componenti di interazione cellula-cellula endoteliale tumorale possono essere replicate in vitro sfidando un monostrato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) con cellule tumorali. Studi eseguiti con elettroni e microscopia in contrasto di fase suggeriscono che la sequenza in vitro di eventi rappresenta in maniera corretta il processo metastatico in vivo 6. Qui, descriviamo una tecnica basata elettrico-impedenza che controlla e quantifica in tempo reale le Invasione delle cellule endoteliali mediante cellule tumorali maligne.
Giaever e Keese prima descritto una tecnica per misurare fluttuazioni di impedenza quando una popolazione di cellule crescono sulla superficie degli elettrodi 7,8. Lo strumento xCELLigence, prodotto da Roche, utilizza una tecnica simile a misurare le variazioni di impedenza elettrica come cellule attaccano e dispersi in un piatto di coltura coperto con una matrice microelettrodo oro che copre circa l'80% della zona sul fondo di un pozzo. Come cellule aderiscono e diffondono sulla superficie dell'elettrodo, porta ad un aumento di impedenza elettrica 9-12. L'impedenza viene visualizzata come parametro adimensionale definito cell-index, che è direttamente proporzionale alla superficie totale del tessuto-coltura bene che è coperto da cellule. Quindi, la cellula-indice può essere utilizzato per monitorare l'adesione cellulare, diffusione, morfologia e densità cellulare.
Il saggio di invasione descritto in questo articolo si basa su cambiamentiin impedenza elettrica all'elettrodo / cellula interfase, come una popolazione di cellule maligne invadono attraverso un monostrato HUVEC (Figura 1). La distruzione delle giunzioni endoteliali, retrazione del monostrato endoteliale e la sostituzione da parte delle cellule tumorali portare a grandi cambiamenti di impedenza. Questi cambiamenti correlano direttamente con la capacità invasiva delle cellule tumorali, cioè, invasione di cellule altamente aggressivi portare a grandi cambiamenti di impedenza della cella e viceversa. Questa tecnica fornisce un duplice vantaggio rispetto ai metodi esistenti di misurazione invasione, come camera di Boyden e dosaggi Matrigel: 1) l'interazione cellula-tumorale delle cellule endoteliali imita più da vicino il processo in vivo, e 2) i dati sono ottenuti in real- tempo ed è più facilmente quantificabile, al contrario di analisi end-point per altri metodi.
Protocol
1. Preparazione
- Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura di tessuti.
- La stazione xCELLigence è posto in un incubatore 37 ° C in presenza del 5% di CO 2.
- Utilizzare cellule HUVEC passaggio basso, preferibilmente non più di passaggio 6. Inoltre, assicurarsi che le cellule non sono più del 75% confluenti al momento della raccolta.
- Cellule HUVEC sono coltivate in EGM-2 supporti ricostituita con kit di EGM-2 proiettile (Lonza Biosciences) contenente i fattori di crescita, integratori e 5% di siero fetale bovino.
- Tutte le tracce di tripsina dovrebbero essere rimossi da sospensioni cellulari da spinning cellule a 200xg, lavare una volta con PBS, e li risospensione di densità cellulari indicati.
- E-coat xCELLigence piastra 16 con 0,1% di gelatina per 1 ora a 37 ° C o per una notte a 4 ° C. Lavare la piastra con PBS e aggiungere 100 microlitri ricostituito EGM-2 media. Eseguire una lettura del bianco sul sistema xCELLigence per misurare sfondoimpedenza in assenza di cellule.
2. Generazione di HUVEC monostrato
- Raccogliere un pallone sub-confluenti di cellule HUVEC per tripsinizzazione. Risospendere le cellule in ricostituite EGM-2 supporti ad una densità finale di 2,5 x 10 5 cellule / ml.
- A ciascun pozzetto di un fondo calibrato E-piastra contenente 100 microlitri EGM-2 supporti, aggiungere 100 microlitri della sospensione di cellule HUVEC (2,5 x 10 4 cellule HUVEC).
- Installare immediatamente E-Plate nello strumento xCELLigence.
- Software xCELLigence programma per eseguire letture di impedenza ad intervalli di 10 minuti.
- Lasciare che le cellule endoteliali crescere per 18-21 ore fino a formare un monostrato, come evidenziato da un indice di appiattimento cella (Figura 2).
3. Aggiunta di invadere le cellule e la normalizzazione dei dati.
- Una volta che un monostrato HUVEC stabile è formata, raccolta cellule tumorali da parte tripsinizzazione e risospendere ad un tane finalilità di 1 x 10 5 cellule / ml in mezzi utilizzati per coltivare cellule tumorali (ad esempio RPMI o DMEM contenente il 10% supporti FBS)
- Letture di impedenza Pausa sul software xCELLigence e rimuovere E-Plate dalla stazione.
- Rimuovere EGM-2 supporti per aspirazione. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare tumorale contenente 1 x 10 4 cellule. Generalmente, un rapporto di cellule tumorali 1:2,5: cellule endoteliali inseminate, funziona meglio per il dosaggio. Tuttavia, il rapporto può essere ottimizzato per linee cellulari individuali.
- Posizionare la E-piastra sul sistema xCELLigence in incubatrice e continuare letture di impedenza ad intervalli di 10 minuti.
- Invasione può essere monitorato in tempo reale nei prossimi 6-12 ore come una goccia in indice cella a causa della retrazione delle giunzioni endoteliali e penetrazione di invadere le cellule tumorali.
- Normalizzare i risultati al momento dell'aggiunta di invadere le cellule tumorali. Il software permette la normalizzazione xCELLigence a qualsiasi punto e risultati tempopuò essere visualizzato direttamente nella finestra del software.
4. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di HUVEC monostrato invasione di cellule metastatiche e non metastatico è mostrato in Figura 3. K7M2 è una linea cellulare di osteosarcoma metastatico. Queste cellule esprimono alti livelli della proteina del citoscheletro linker ezrin, che rappresenta le proprietà invasive di questa linea cellulare 13,14. Quando le cellule HUVEC sono sfidati con K7M2 cellule, vi è un calo di resistenza elettrica entro 6 ore. Questa diminuzione della resistenza elettrica rappresenta l'invasione di monostrato HUVEC dalle cellule tumorali invasori. La cella K12-line, invece, esprime livelli molto bassi di ezrin ed è di conseguenza meno metastatica 13. Sfidando il monostrato HUVEC con K12 risultati cellule in un meno ripido calo nella resistenza come le cellule sono in grado di aderire o invadere attraverso il monostrato HUVEC (Figura 3).
Figura 2. Formazione monostrato HUVEC. Le variazioni dell'indice delle cellule come le cellule HUVEC attaccano e si diffondono su elettrodi d'oro gelatina rivestite. La formazione di un monostrato confluente è rappresentato da un indice di stabilizzazione cellule dopo 18 ore.
Figura 3. Invasione di cellule HUVEC da K7M2 e K12 cellule di osteosarcoma. Una diminuzione netta delle cell-index avviene entro poche ore dalla introduzione di K7M2 cellule altamente metastatiche. K12 celle, d'altro canto, sono meno metastatica e sono in grado di penetrare il monostrato endoteliale nel modo più efficiente K7M2 cellule. Questo è rappresentato da una meno ripida diminuzione dell'indice cella quando il monostrato HUVEC è sfidato con K12 celle. Controllo rappresenta impedenza del monostrato HUVEC in assenza di cellule tumorali. Esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.
Discussion
Il tempo reale saggio di invasione HUVEC è un metodo semplice, ma potente per il monitoraggio invasione. Esso fornisce risultati in tempo reale, che è un vantaggio significativo rispetto ad altre tecniche tradizionali che si basano su analisi end-point. Il dosaggio può essere modificato per testare farmaci, anticorpi, ligandi e proteine come inibitori o stimolatori di metastasi. L'effetto di agenti diversi su endoteliale / carcinoma diafonia può essere valutata come bene. Nell'introdurre agenti esogeni, quali fattori di crescita e medicinali nei terreni di coltura, è importante garantire che non influenzano l'integrità del monostrato HUVEC. Perturbazione del monostrato HUVEC può essere testato introducendo l'agente esogeno in assenza di invadere le cellule, e garantendo che non vi è alcun cambiamento di indice cella. Così, gli opportuni controlli dovrebbero essere inclusi come parte del disegno sperimentale.
Diverse linee cellulari differenti curve dimostrano cell-index quanto formano un confmonostrato luent. La forma della curva, così come il massimo cellula-index raggiunto, è tipo cellulare specifico. Cellule HUVEC mostrano una caratteristica transitoria appiattimento indice cella 4-6 ore dopo la semina, seguito da un altro stabilizzazione ad un indice cella superiore dopo 16-18 ore. Quindi, è importante permettere alle cellule formano un monostrato confluente per almeno 18 ore prima dell'aggiunta di cellule tumorali.
Poiché l'indice cella dipende l'ambiente ionico in corrispondenza dell'elettrodo / cellula interfase, vari fattori come cellula-morfologia e qualità delle adesioni cellula-cellula influenzano la cellula-index, oltre alla zona del fondo ben coperto. Così, la diminuzione dell'indice cella, che si verifica su di invasione delle cellule tumorali, è funzione di diversi fattori, che includono la retrazione delle giunzioni endoteliali e successiva invasione delle cellule tumorali.
Lo strumento xCELLigence è prodotto in tre diverse configurazioni: analizzatore cellula tempo reale(RTCA) SP, RTCA MP e RTCA DP. Lo strumento RTCA SP detiene un 96-ben E-piastra che lo strumento RTCA MP può contenere fino a sei a 96 pozzetti e-piastre contemporaneamente. Questo permette di high-throughput screening di farmaci e composti. Gli esperimenti in questo articolo sono eseguite utilizzando lo strumento RTCA DP, che può contenere tre a 16 e E-piastre. Ogni stazione di partecipazione E-piastra può essere utilizzato in modo indipendente, che consente a più utenti di eseguire esperimenti contemporaneamente. Lo strumento RTCA DP può essere utilizzato anche per studiare la migrazione utilizzando CIM-piastre. Queste sono le piastre a 16 pozzetti con camere superiori e inferiori separati da un polietilene tereftalato (PET) membrana con dimensione dei pori media di 8um. I sensori elettronici sono situati sul lato inferiore della membrana porosa della camera superiore. La camera inferiore funge da serbatoio per chemiotattico per cellule nella camera superiore. Tuttavia, uno dei principali vantaggi del saggio di invasione HUVEC negli CIM-piastre è che l'invasione delle cellule tumorali nel primo is non è limitata dalla dimensione dei pori, l'invasione delle cellule endoteliali dipende diafonia tra le cellule tumorali ed endoteliali.
Il saggio di invasione HUVEC può anche essere eseguita su strumento ECIS Z, prodotto da Applied Biophysics (Troy, NY). Lo strumento ECIS Z utilizza una tecnologia simile allo strumento xCELLigence, con differenze nelle configurazioni di array elettrodo. Abbiamo effettuato con successo i test di invasione HUVEC utilizzando gli array ECIS 8 pozzetti. È importante notare che la superficie di fondo è ben maggiore nelle matrici ECIS, che richiede un numero maggiore di cellule endoteliali e tumorali di essere placcato: 2,5 x 10 5 e 1 x 10 5 cellule rispettivamente.
Disclosures
Il costo della pubblicazione di questo manoscritto è stato gentilmente fornito da Roche Applied Science.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato generosamente sostenuto da fondi provenienti da bambini Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) e NIH (R01CA108641).
Vorremmo ringraziare il Dott. Anton Wellstein e membri del suo laboratorio per condividere la loro esperienza e ci aiuta ad ottimizzare i metodi presentati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
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