Summary
Dieser Artikel beschreibt ein
Abstract
Metastatischen Verbreitung von bösartigen Zellen erfordert Abbau Basalmembran Befestigung von Tumorzellen an Gefäßendothel, Einziehen der endothelialen Kreuzungen und schließlich Invasion und Migration von Tumorzellen durch das Endothel in die Blutbahn als Transportmittel geben zu entfernten Stellen in dem Host 1-3. Einmal in das Kreislaufsystem, sich Krebszellen Wände Kapillare und extravasieren des umliegenden Gewebes zu bilden Metastasen 4,5. Die verschiedenen Komponenten der Tumorzellen Endothelzellinteraktion kann in vitro durch die Herausforderung eine Monoschicht von menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) mit Krebszellen repliziert werden. Studien mit Elektronen-und Phasenkontrast-Mikroskopie durchgeführt vermuten, dass die in vitro Ablauf getreu die in vivo Metastasierungsprozess 6. Hier beschreiben wir eine elektrische Impedanz-basierte Technik, die quantifiziert und überwacht in Echtzeit den INVASion von Endothelzellen von malignen Tumorzellen.
Giaever und Keese zuerst beschrieben eine Technik zum Messen von Schwankungen in der Impedanz, wenn eine Population von Zellen auf der Oberfläche der Elektroden 7,8 wachsen. Die xCELLigence Instrument, hergestellt von Roche, verwendet eine ähnliche Technik, um Änderungen in der elektrischen Impedanz zu messen, wie Zellen befestigen und in eine Kulturschale mit einer Gold-Mikroelektroden-Anordnung, die etwa 80% der Fläche bedeckt auf dem Boden eines Wells bedeckt verbreiten. Als Zellen anlagern und ausbreiten auf der Elektrodenoberfläche, es führt zu einer Erhöhung in der elektrischen Impedanz 9-12. Die Impedanz wird als dimensionslose Parameter bezeichnet Zell-Index, der direkt proportional zu der Gesamtfläche von Gewebekulturen, die von Zellen bedeckt ist, angezeigt. Daher kann die Zell-Index verwendet werden, um die Zelladhäsion, Streichen, Morphologie und die Zelldichte zu überwachen.
Die Invasion Assay in diesem Artikel beschriebenen Änderungen auf der Grundlagein elektrische Impedanz an der Elektrode / Zelle Zwischenphase, als eine Population von bösartigen Zellen eindringen durch eine HUVEC Monolayer (Abbildung 1). Die Störung der endothelialen Kreuzungen, Rückzug der endothelialen Monolayer und Ersatz von Tumorzellen führen zu großen Veränderungen in der Impedanz. Diese Veränderungen korrelieren direkt mit der Kapazität von invasiven Tumorzellen, dh Invasion durch hoch aggressive Zellen zu großen Veränderungen in der Zelle Impedanz und umgekehrt führen. Diese Technik bietet einen zweifachen Vorteil gegenüber bestehenden Methoden zur Messung der Invasion, wie Boyden-Kammer und Matrigel-Tests: 1) die Endothelzellen-Tumor-Zell-Wechselwirkung mehr ahmt die in vivo-Verfahren, und 2) die Daten in Echtzeit erhalten Zeit und ist leicht zu quantifizieren, um Endpunktanalyse für andere Verfahren entgegen.
Protocol
1. Vorbereitung
- Alle Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube erfolgen.
- Die xCELLigence Station in einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2 gestellt.
- Verwenden Sie einen niedrigen Durchgang HUVEC Zellen, vorzugsweise nicht mehr als Durchgang 6. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen nicht mehr als 75% konfluent zum Zeitpunkt der Ernte sind.
- HUVEC-Zellen werden in EGM-2-Medien rekonstituiert mit EGM-2 Kugel Kit (Lonza Biosciences), enthaltend Wachstumsfaktoren, Ergänzungen und 5% fötalem Rinderserum.
- Alle Spuren von Trypsin sollte aus Zellsuspensionen durch Spinnen Zellen bei 200 × g, einmaligem Waschen mit PBS und Resuspendieren sie angezeigt Zelldichten entfernt werden.
- Coat xCELLigence E-16 mit 0,1% Gelatine für 1 Stunde bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Platte mit PBS und fügen Sie 100 ul rekonstituierten EGM-2-Medien. Führen Sie eine leere Lesung zu dem xCELLigence System Hintergrund messenImpedanz in Abwesenheit von Zellen.
2. Generieren HUVEC Monolayer
- Ernte ein subkonfluenten Flasche HUVEC Zellen durch Trypsin. Die Zellen in rekonstituierten EGM-2-Medien zu einer endgültigen Dichte von 2,5 x 10 5 Zellen / ml.
- Zu jeder Vertiefung einer kalibrierten Hintergrund E-Platte mit 100 ul EGM-2-Medien, fügen 100 ul der HUVEC Zellsuspension (2,5 x 10 4 HUVEC-Zellen).
- Installieren Sie sofort E-Platte xCELLigence Instrument.
- Programm xCELLigence Software Impedanz Messungen in 10-minütigen Abständen durchzuführen.
- Lassen Sie die Endothelzellen wachsen für 18-21 Stunden, bis sie eine Monoschicht bilden, wie durch eine Abflachung der Zelle Index (Abbildung 2) zeigt.
3. Die Zugabe von eindringenden Zellen und Daten Normalisierung.
- Sobald ein stabiler HUVEC Monolayer gebildet hat, Ernte Tumorzellen durch Trypsinisierung und resuspendieren zu einer endgültigen denskeit von 1 x 10 5 Zellen / ml in Medium verwendet werden, um Tumorzellen (zB RPMI oder DMEM-Medium, enthaltend 10% FBS) wachsen
- Pause Impedanz Lesungen auf dem xCELLigence Software und entfernen Sie E-Platte vom Bahnhof entfernt.
- Entfernen EGM-2-Medien durch Aspiration. In 100 ul von Tumor-Zell-Suspension mit 1 x 10 4 Zellen. Im Allgemeinen wird ein 1:2,5 Verhältnis von Tumorzellen: funktioniert Endothelzellen ausgesät, am besten für den Test. Jedoch kann das Verhältnis der einzelnen Zelllinien optimiert werden.
- Legen Sie die E-Platte auf dem xCELLigence System in den Inkubator und weiter Impedanz Messungen bei 10 Minuten-Takt.
- Invasion können in Echtzeit über die nächsten 6-12 Stunden werden wie ein Tropfen in Zelle Index durch das Zurückziehen des endothelial Kreuzungen und das Eindringen von eindringenden Tumorzellen überwacht.
- Normalisieren Ergebnisse der Zeitpunkt der Zugabe des eindringenden Tumorzellen. Die Software erlaubt die Normalisierung xCELLigence zu jedem Zeitpunkt und Ergebnissekönnen direkt in der Software-Fenster angezeigt werden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für HUVEC Monoschicht Invasion durch metastatischen und nicht-metastatischen Zellen ist in Fig. 3 gezeigt. K7M2 ist ein metastasierendem Osteosarkom-Zelllinie. Diese Zellen exprimieren hohe Mengen des Zytoskeletts Linkerprotein Ezrin, welche Konten für die invasive Eigenschaften dieser Zelllinie 13,14. Wenn HUVEC Zellen mit K7M2 Zellen sind herausgefordert, es ist ein Tropfen im elektrischen Widerstand innerhalb von 6 Stunden. Dieser Rückgang des elektrischen Widerstandes stellt die Invasion von HUVEC Monolayer von den eindringenden Tumorzellen. Die K12-Zelllinie, auf der anderen Seite, drückt deutlich geringeren Ezrin und ist somit weniger metastasierendem 13. Die Anfechtung der HUVEC Monolayer mit K12-Zellen führt zu einem weniger starken Rückgang der Widerstand, wenn die Zellen nicht in der Lage, um zu haften oder dringen durch die HUVEC Monolayer (Abbildung 3).
Abbildung 2. HUVEC Monolayerbildung. Veränderungen in der Zelle als Index HUVEC Zellen zu befestigen und zu verbreiten auf Gelatine-beschichteten Gold-Elektroden. Die Bildung einer konfluenten Monoschicht durch eine Stabilisierung des Zell-Index nach 18 Stunden dargestellt.
Abbildung 3. Invasion von HUVEC Zellen durch K7M2 und K12 Osteosarkomzellen. Ein steiler Rückgang in cell-index erfolgt innerhalb von ein paar Stunden von der Einführung des hoch metastatischen K7M2 Zellen. K12-Zellen, auf der anderen Seite, sind weniger metastatischen und nicht imstande sind, die endothelialen Monoschicht so effizient wie K7M2 Zellen eindringen. Dies wird durch eine weniger steile Abnahme in der Zell-Index, wenn der HUVEC Monoschicht mit K12-Zellen in Frage gestellt wird dargestellt. Steuerelement darstellt Impedanz HUVEC Monoschicht in Abwesenheit von Krebszellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
Discussion
Die Echtzeit-HUVEC Invasion Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Methode zur Überwachung Invasion. Es liefert Ergebnisse in Echtzeit, was ein wesentlicher Vorteil gegenüber anderen herkömmlichen Techniken, die auf Endpunktanalyse verlassen. Der Assay kann auf Testverbindungen, Antikörper, Liganden und Proteine als Inhibitoren oder Stimulatoren der Metastasierung modifiziert werden. Die Wirkung verschiedener Mittel auf die endotheliale / Krebszelle cross-talk kann auch beurteilt werden. Bei der Einführung von exogener Mittel, wie Wachstumsfaktoren und Medikamenten in den Kulturmedien, ist es wichtig sicherzustellen, dass sie keinen Einfluss auf die Integrität der HUVEC Monoschicht. Die Unterbrechung der HUVEC Monoschicht durch Einführen der exogene Substanz in Abwesenheit von eindringenden Zellen, und sicherzustellen, dass es keine Veränderung in der Zelle Index geprüft werden. Daher sollten geeignete Kontrollen als Teil des experimentellen Designs enthalten sein.
Verschiedene Zelllinien zeigen unterschiedliche Zell-Index-Kurve, wie sie eine conf bildenluent Monoschicht. Die Form der Kurve, sowie die maximale Zell-Index erreicht ist Zelltyp-spezifisch. HUVEC-Zellen zeigen eine charakteristische transiente Abflachung der Zelle Index 4-6 Stunden nach dem Aussäen von einem anderen Stabilisierung bei einer höheren Zelle Index nach 16-18 Stunden. Daher ist es wichtig, damit die Zellen bilden eine konfluente Monoschicht für mindestens 18 Stunden vor der Zugabe von Tumorzellen.
Da die Zelle Index ist abhängig von der ionischen Umgebung an der Elektrode / Zelle Interphase Einfluss verschiedener Faktoren wie zum Beispiel Zell-Morphologie und die Qualität der Zell-Zell-Adhäsion der Zellen-Index, zusätzlich zu dem Bereich der Schachtboden bedeckt. Somit ist die Abnahme in der Zell-Index, der auf Tumorzellinvasion auftritt, eine Funktion verschiedener Faktoren, die das Zurückziehen der endothelialen Verbindungen und anschließende Tumorzellinvasion umfassen.
Das xCELLigence Instrument ist in drei verschiedenen Konfigurationen hergestellt: Echtzeit Zellanalysator(RTCA) SP, MP und RTCA RTCA DP. Die RTCA SP Instrument hält eine 96-well E-Platte, während die RTCA MP Instrument kann bis zu sechs 96-Loch-E-Platten gleichzeitig. Dies ermöglicht für das Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten und Verbindungen. Die Experimente in diesem Artikel werden unter Verwendung des RTCA DP Instrument, das drei 16-Well-Platten E-halten kann. Jede E-Platte Haltestation können unabhängig voneinander betrieben werden, was ermöglicht mehreren Benutzern die Experimente gleichzeitig laufen. Die RTCA DP Instrument kann auch verwendet werden, um die Migration mit CIM-Platten zu untersuchen. Dies sind 16-Well-Platten mit oberen und unteren Kammern durch eine Polyethylenterephthalat (PET)-Membran mit einer mittleren Porengröße von 8um getrennt. Die elektronischen Sensoren sind an der Unterseite der porösen Membran von der oberen Kammer angeordnet ist. Die untere Kammer als Reservoir für Lockstoff für Zellen in der oberen Kammer. Allerdings ist ein großer Vorteil der HUVEC Invasionsassay über die CIM-Platten, die die Tumorzelle Invasion in der ehemaligen is nicht durch die Porengröße beschränkt, wie Endothelzellen Invasion hängt von Übersprechen zwischen den Tumorzellen und Endothelzellen.
Die HUVEC Invasionsassay können auch auf ECIS Z Instrument durchgeführt werden, hergestellt von Applied Biophysik (Troy, NY). Die ECIS Z Instrument nutzt eine Technologie ähnlich dem xCELLigence Instrument, mit Unterschieden in der Array-und Elektroden-Konfigurationen. Wir haben erfolgreich HUVEC Invasionsassays mit den 8-well ECIS Arrays durchgeführt. Es ist wichtig zu beachten, dass die gut Bodenfläche größer in der ECIS Arrays, die eine größere Anzahl von Endothel und Tumorzellen erfordert plattiert werden soll: 2,5 x 10 5 und 1 x 10 5 Zellen sind.
Disclosures
Die Publikation kostet für dieses Manuskripts wurde uns freundlicherweise von Roche Applied Science zur Verfügung gestellt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Kinder-Krebs-Stiftung (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) und NIH (R01CA108641) unterstützt.
Wir möchten Dr. Anton Wellstein und Mitglieder seines Labors für den Austausch ihrer Erfahrungen und helfen uns, präsentiert Methoden optimieren danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
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