Summary
Denna artikel beskriver en
Abstract
Metastatisk spridning av maligna celler kräver nedbrytningen av basalmembran, fastsättning av tumörceller till vaskulär endotel, indragning av endotelceller korsningar och slutligen invasion och migration av tumörceller genom endotelskiktet att komma in i blodomloppet som ett transportmedel till avlägsna platser i den mottagande 1-3. En gång i cirkulationssystemet, cancerceller följa kapillärväggarna och extravasera till den omgivande vävnaden för att bilda metastaser 4,5. De olika komponenterna i tumörcell-endotelcell interaktion kan replikeras in vitro genom att utmana ett monoskikt av humana navelvenendotelceller (HUVEC) med cancerceller. Studier utförda med elektron och faskontrastmikroskopi tyder på att in vitro händelseförloppet ganska representera in vivo metastaserande process 6. Här beskriver vi en elektrisk-impedans baserad teknik som övervakar och kvantifierar i realtid de invasjon av endotelceller från maligna tumörceller.
Giaever och Keese beskrivas först en teknik för att mäta variationer i impedansen när en population av celler växa på ytan av elektroderna 7,8. Den xCELLigence instrumentet tillverkas av Roche, använder en liknande teknik att mäta förändringar i elektrisk impedans som celler fästa och sprida sig i en odlingsskål täckt med ett guld mikroelektrod array som täcker cirka 80% av arean på botten av en brunn. Som celler fästa och spridas på elektrodytan, leder det till en ökning av elektrisk impedans 9-12. Impedansen visas som en dimensionslös kallas parameter cell-index, som är direkt proportionell mot den totala arealen av vävnad-kultur väl som täcks av celler. Således kan cell-index användas för att övervaka celladhesion, fördelning, morfologi och celltäthet.
Invasionen analys som beskrivs i denna artikel är baserad på förändringari elektrisk impedans vid elektroden / cell interfas, som en population av maligna celler invaderar genom en HUVEC monolager (Figur 1). Störningen av endotelceller korsningar, indragning av endotelceller cellslager och utbyte av tumörceller leda till stora förändringar i impedansen. Dessa förändringar direkt korrelerar med den invasiva kapacitet av tumörceller, dvs, invasion av mycket aggressiva celler leda till stora förändringar i cellernas impedans och vice versa. Denna teknik ger en tvåfaldig fördel jämfört med befintliga metoder för att mäta invasion, såsom Boyden-kammare och matrigel analyser: 1) endotelcell-tumörcell interaktion mer nära efterliknar in vivo processen, och 2) den data som erhålles i real- tid och är lättare att mäta, i motsats till slutpunkt analys för andra metoder.
Protocol
Ett. Framställning
- Alla steg skall utföras under sterila förhållanden i en vävnadsodling huva.
- Den xCELLigence stationen placeras i en 37 ° C inkubator i närvaro av 5% CO2.
- Använd låga celler passage HUVEC, företrädesvis inte mer än passagen 6. Se också till att cellerna inte är mer än 75% sammanflytande vid tidpunkten för skörd.
- HUVEC-celler odlas i EGM-2 media rekonstitueras med EGM-2 bullet kit (Lonza Biosciences) innehållande tillväxtfaktorer, bilagor och 5% fetalt bovint serum.
- Alla spår av trypsin bör tas bort från cellsuspensioner genom spinning celler vid 200xg, tvättning en gång med PBS och återsuspendera dem till indikerade celldensiteter.
- Coat xCELLigence E-plattan 16 med 0,1% gelatin under 1 timme vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C. Tvätta plattan med PBS och tillsätt 100 | il rekonstituerad EGM-2-media. Utför en blank behandlingen om xCELLigence systemet att mäta bakgrundenimpedans i frånvaro av celler.
2. Generera HUVEC monolager
- Skörda en subkonfluent kolv HUVEC celler genom trypsinisering. Resuspendera cellerna i rekonstituerade EGM-2 media till en slutlig densitet av 2,5 x 10 5 celler / ml.
- Till varje brunn i en bakgrund kalibrerad E-platta innehållande 100 pl EGM-2 medium, tillsätt 100 ^ av HUVEC cellsuspension (2,5 x 10 4 HUVEC-celler).
- Omedelbart installera E-Plate i xCELLigence instrumentet.
- Program xCELLigence programvara för att utföra impedans avläsningar med 10 minuters intervall.
- Låt endotelcellerna växa under 18-21 timmar tills de bildar ett monoskikt, vilket framgår av en flackare cell index (figur 2).
Tre. Tillsättning av invaderande celler och uppgifter normalisering.
- När en stabil HUVEC monolager har bildats, skörd tumörceller genom trypsinisering och återsuspendera till en slutlig lyorhet av 1 x 10 5 celler / ml i medier används för att odla tumörceller (såsom RPMI eller DMEM-medium innehållande 10% FBS)
- Paus impedans avläsningar på xCELLigence programvaran och ta bort e-tavla från stationen.
- Ta EGM-2 medium genom aspiration. Lägg 100 pl tumörceller innehållande 1 x 10 4 celler. Generellt en 1:2,5 förhållandet tumörceller: fungerar sådda endotelceller, bäst för analysen. Emellertid kan förhållandet vara optimerad för enskilda cellinjer.
- Placera E-plattan på xCELLigence systemet i inkubatorn och fortsätta impedans avläsningar med 10 minuters mellanrum.
- Invasion kan övervakas i realtid under de närmaste 6-12 timmar som en droppe i cell index på grund av indragning av endotelceller korsningar och penetration av invaderande tumörceller.
- Normalisera resultaten till tiden för tillsats av invaderande tumörceller. XCELLigence programvara tillåter normalisering till någon tidpunkt och resultatdirekt kan ses i programvaran fönstret.
4. Representativa resultat:
Ett exempel på HUVEC monolager invasion av metastatiska och icke-metastatiska celler visas i Figur 3. K7M2 är en metastatisk osteosarkom cellinje. Dessa celler uttrycker höga nivåer av den cytoskelettala linker proteinet ezrin, som står för de invasiva egenskaper hos denna cellinje 13,14. När HUVEC-celler utmanas med K7M2 celler, det finns en nedgång i elektrisk resistans inom 6 timmar. Denna nedgång i elektriskt motstånd representerar invasionen av HUVEC monolager av de invaderande tumörceller. Den K12 cell-linjen, å andra sidan, uttrycker mycket lägre nivåer av ezrin och är därmed mindre metastaserande 13. Att utmana HUVEC monolagret med K12 celler resulterar i en mindre brant nedgång i motstånd när cellerna inte kan ansluta sig till eller invadera genom HUVEC monolagret (Figur 3).
Figur 2. HUVEC monolager bildas. Förändringar i cell index som HUVEC celler fäster till och sprids på gelatin-belagda guldelektroder. Bildandet av ett sammanhängande monoskikt representeras av en stabilisering av cell index efter 18 timmar.
Figur 3. Invasion av HUVEC celler genom K7M2 och K12 osteosarkomceller. En brant minskning av celL-index sker inom några timmar efter införandet av mycket metastatiska K7M2 celler. K12-celler, å andra sidan, är mindre metastaserande och är oförmögna att penetrera endothelial cellslager så effektivt som K7M2 celler. Detta representeras av en mindre brant minskning i cell index när HUVEC cellslager utmanas med K12 celler. Kontroll representerar impedans HUVEC monolager i frånvaro av cancerceller. Experiment utfördes i triplikat.
Discussion
Den realtid HUVEC invasionen analysen är en enkel, men kraftfull metod för övervakning av invasion. Det ger resultat i realtid, vilket är en avsevärd fördel jämfört med andra traditionella tekniker som är beroende av slutpunkten analys. Analysen kan modifieras för att testa läkemedel, antikroppar, ligander och proteiner som hämmare eller stimulatorer av metastasering. Effekten av olika agenter på endotel / cancercell överhörning kan bedömas också. Vid införande av exogena medel, såsom tillväxtfaktorer och droger i kulturen medier, är det viktigt att se till att de inte påverkar integriteten för HUVEC monolagret. Rubbning av HUVEC monolagret kan testas genom införande av det exogena medlet i frånvaro av invaderande celler, och se till att det inte sker någon förändring i cell index. Därför bör lämpliga kontroller ingå som en del av den experimentella designen.
Olika cellinjer visar olika cell-index kurvor som de bildar en confluent monolager. Formen på kurvan, liksom den maximala cell-index nås är celltypsspecifik. HUVEC celler visar en karakteristisk övergående flackare cell index 4-6 timmar efter sådd, följt av ytterligare stabilisering på en högre cell index efter 16-18 timmar. Därför är det viktigt att låta cellerna bildar ett sammanhängande monoskikt under minst 18 timmar före tillsatsen av tumörceller.
Eftersom cellen index är beroende på den joniska miljön vid elektroden / cell interfas, olika faktorer, såsom cell-morfologi och kvalitet på cell-cell adhesioner påverka cell-index, förutom området för brunnens botten täckt. Sålunda är minskningen i cell index, som sker vid tumörcell invasion, en funktion av flera faktorer, vilka innefattar tillbakadragning av endotelceller korsningar och efterföljande tumörcell invasion.
XCELLigence Instrumentet tillverkas i tre olika utföranden: realtid cell analysator(RTCA) SP, RTCA MP och RTCA DP. Den RTCA SP Instrumentet har en 96-väl E-platta medan RTCA MP instrumentet kan hålla upp till sex 96-håls E-plattor samtidigt. Detta möjliggör för high-throughput screening av läkemedel och föreningar. Experimenten i denna artikel utförs med RTCA DP instrumentet, som rymmer tre 16-well E-plattor. Varje E-plåthållaranordningen station kan självständigt drivs, vilket gör att flera användare att köra experiment samtidigt. Den RTCA DP Instrumentet kan också användas för att studera migrering med CIM-plattor. Dessa är 16-brunnars plattor med övre och undre kammare åtskilda av ett polyetylentereftalat (PET)-membran med en median porstorlek av 8um. De elektroniska sensorerna är placerade på undersidan av det porösa membranet av den övre kammaren. Den nedre kammaren fungerar som en reservoar för chemoattractant för celler i den övre kammaren. Dock är en stor fördel med HUVEC invasionen analysen över CIM-plattor som tumörcellsinvasion i fd Is begränsas inte av porstorleken, såsom endotelceller invasion beror på överhörning mellan tumör och endotelceller.
Den HUVEC invasionsanalys kan också utföras på ECIS Z instrumentet, tillverkad av Applied Biophysics (Troy, NY). Den ECIS Z Instrumentet använder en teknik som liknar xCELLigence instrumentet, med skillnader i uppställningen och elektroden konfigurationer. Vi har framgångsrikt utfört HUVEC invasionen analyser med hjälp av 8-brunnars ECIS arrayer. Det är viktigt att notera att den väl bottenytan området är större i ECIS arrayer, vilket kräver ett större antal av endotel-och tumörceller som skall pläteras: 2,5 x 10 5 och 1 x 10 5 celler respektive.
Disclosures
Publikationen Kostnaden för detta manuskript var vänligt tillhandahålls av Roche Applied Science.
Acknowledgments
Detta arbete fick generöst stöd av medel från Barncancerfonden (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) och NIH (R01CA108641).
Vi vill tacka Dr Anton Wellstein och medlemmar av hans laboratorium för att dela sina erfarenheter och hjälpa oss att optimera metoder som presenteras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
