Summary
Een eenvoudige procedure van vibratome snijden het orgaan van Corti, gevolgd door immunohistochemie en confocale microscopie is beschreven. Deze procedure zorgt voor een betere conservering van de fijne cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, en dus zorgt voor accurate kwantificering van celtypen.
Abstract
De zoogdieren orgaan van Corti is een sterk geordende cellulaire mozaïek van mechanosensorische haar en nonsensory ondersteunende cellen
(Beoordeeld in 1,2). Visualisatie van dit cellulair mozaïek vereist vaak dat het orgaan van Corti is cross-delig. In het bijzonder kan de nonsensory pijler en Deiters 'cellen, waarvan de kernen zijn basaal gelegen met betrekking tot de haarcellen, niet zichtbaar worden zonder cross-opdeling het orgaan van Corti. Echter, de delicate cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, met inbegrip van de fijne cytoplasmatische processen van de pijler en Deiters 'cellen, is moeilijk te behouden door routine histologische procedures, zoals paraffine en cryo-snijden, die compatibel zijn met standaard immunohistochemische kleuring technieken.
Hier beschrijf ik een eenvoudige en deugdelijke procedure die bestaat uit vibratome opdeling van het slakkenhuis, immunohistochemische kleuring van deze vibratome secties in hele berg, gevolgd door confocale microscopie. Deze procedure is op grote schaal gebruikt voor immunhistochemical analyse van veelvoudige organen, waaronder de muis ledematen knop, zebravis darmen, lever, pancreas en hart (zie 3-6 voor geselecteerde voorbeelden). Daarnaast is deze procedure was succesvol voor zowel beeld-als quantitificaton van de zuil aantal cellen in de mutant en controle organen van Corti in zowel embryo's en volwassen muizen 7. Deze methode is echter momenteel niet op grote schaal gebruikt om de zoogdieren orgaan van Corti te onderzoeken. Het potentieel voor deze procedure tot een betere bescherming bieden beide van de boete cytoarchitecture van de volwassen orgaan van Corti en zorgen voor kwantificering van de verschillende celtypen wordt beschreven.
Protocol
1. Isolatie en fixatie van innerlijke oren
- Voor de analyse van cellulaire patronen in het orgaan van Corti, euthanaseren juiste geënsceneerd embryo's of volwassenen.
- Ontleden de Otic capsule, met daarin de vliezige binnenoor. In de muis, kan dit eenvoudig worden gedaan op embryo's op embryonale (E) dag 14,5 en ouder, waarbij E0.5 is de dag waarop een vaginale plug werd ontdekt. Dissectie van de otic capsule voor het eerst bereikt door onthoofding en het openen van de schedel bij de middellijn. Verwijder de hersenen in elk oor (Fig. 1A) bloot te leggen. Innerlijke oren kunnen worden gedopt uit intact met pincet (zoals Dumont # 5, Fig. 1B). Als beeldvorming het orgaan van Corti, een zorgvuldige verwijdering van alle neuronale en bindweefsel worden geassocieerd met het otic capsule is niet nodig.
- Fix hele innerlijke oren door onderdompeling in 4% paraformaldehyde (PFA) met een zachte schommelen bij 4 ° C gedurende de nacht in 1,8 ml schroef-capped NUNC Cryo-buis flesjes, of een ander de juiste maat container. PFA oplossing moet worden gemaakt vers in DDH 2 0, vervolgens opgeslagen bij -20 ° C totdat het nodig is.
- De volgende dag, was het fixeermiddel met drie veranderingen van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Weefsel kan worden opgeslagen in steriele 1X PBS voor de dagen tot maanden pas klaar voor verwerking. Voor volwassen weefsel, ontkalkt in 10% EDTA (0.27 M) bij 4 ° C gedurende 5 dagen, gevolgd door spoelen en opslag in 1X PBS.
2. Snijden vibratome secties
- Bereid 4% laag smeltpunt agarose in 1X PBS. Voeg een laag smeltpunt agarose tot 1X PBS en magnetron tot de agarose is in oplossing. Zorg ervoor dat de oplossing niet bubble over - nemen uit de magnetron periodiek en swirl te mengen. Houden oplossing in een 55 ° C waterbad tot klaar voor gebruik.
- Met behulp van een tang, verwijderen binnenoor van 1X PBS-oplossing en positie op de bodem van een Peel-A-Way inbedding mal. Pipet weg overtollige 1X PBS uit de mal. Vul mal om het weefsel te bedekken met veel vloeistof 4% laag smeltpunt agarose (Fig. 2A).
- Plaats de binnenste oor voor het snijden in de juiste vliegtuig. Ik heb behaald goede dwarsdoorsneden van het orgaan van Corti door onderlinge aanpassing van de positie van de otic capsule alsof het had achtergelaten in situ in het hoofd en snijden in het transversale vlak. Voor E14.5 embryo's voor volwassenen, de positie van de binnenoor, zodat het lateraal wordt bekeken, met de laterale semi-circulaire kanaal zichtbaar (Fig. 2B). Hoek het binnenoor, zodat de lijn gevormd door de achterzijde van de otic capsule ongeveer op een hoek van 45 graden van de beoogde vlak van snijden (Fig. 2A, B). Als de Otic capsule, zodat wordt bekeken, dat het dorsale deel van de otic capsule is aan de top, moet de basale begin van het slakkenhuis bevinden zich op de bodem (pijlpunt, Fig. 2B) en de voorste halve cirkel kanaal (ASC) moet worden aan de top (Fig. 2B).
- Agarose zal bij RT binnen 30 minuten. Transfer Peel-Away-vormen met ingebed weefsel tot 4 ° C tot gebruik sectie. Als het snijden zal worden uitgesteld tot de volgende dag, voeg 1X PBS aan de agarose in de mal en op te slaan in een doos met vochtige papieren handdoeken gedrenkt in 1X PBS te dekken.
- Afpellen van de plastic mal. Met behulp van een scheermesje, uitgesneden een agarose doos met het binnenoor weefsel. Zorg ervoor te zorgen dat het vlak van sectie is recht en evenwijdig aan de andere kant van het blok, dat het oppervlak waarop de agarose blok gelijmd worden. Omdat de agarose niet infiltreren het weefsel, niet al te veel knippen agarose van over de hele weefsel, zodat het weefsel wordt goed ondersteund.
- Gebruik secondelijm om het blok hechten aan het snijvlak.
- Sectie op 40 tot 100 urn dikte van vibratome. Save secties in een tissue-cultuur schotel gevuld met 1X PBS, 0,1% TritonX-100. Een representatief deel door de cochleaire spiraal is te zien in Fig. 2C.
- Een tang om ontleden weg agarose uit het weefsel. Agarose zal niet door het weefsel, maar zal gewoon vast aan de buitenzijde van het binnenoor.
- Indien gewenst, zwembad agarose-vrij, delig weefsel met behulp van een pipet met een groot gat open te hoge afschuiving van het weefsel te voorkomen. Als het uitvoeren van meerdere antilichamen vlekken op meerdere verschillende weefsels, kunnen secties worden georganiseerd in een 16 - of 24-well weefselkweek schotel.
3. Antilichaam vlekken vibratome secties
Ga verder met antilichaam vlek. Proces secties in whole-mount, vrij zwevend in de oplossing. Hieronder is een voorbeeld antilichaam kleuringsprotocol voor de S100 marker van de pilaar cellen van het orgaan van Corti, maar het protocol kan worden gebruikt voor antilichaam. Alle wast worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.
- In een multi-well weefselkweek schotel, incubeer vrij zwevende delen met zachte wiegen in PBT (1X PBS, 1% bovine serum albumine, 0,1% Triton X-100) voor 30 minuten.
- Pipet uit oude oplossing en blok free-flzwevende delen met zachte wiegen in PBT + normale geit serum (50 ul NGS / 1 ml PBT) voor 30 minuten.
- Pipet uit oude oplossing en voeg primair antilichaam verdund in PBT + NGS (1:200 verdunning van S100 in PBT + NGS). Incubeer overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen.
- Pipet uit primair antilichaam oplossing. Was 3X, 5 minuten. met PBT, dan 4X, 30 minuten. met PBT.
- Blok met PBT + NGS, 30 minuten.
- Incubeer met fluorescent-geconjugeerd secundair antilichaam (opgegroeid in geit) verdund in PBT + NGS. Incubeer overnacht bij 4 ° C, of een paar uur, RT, zacht wiegen.
- Pipet uit secundair antilichaam oplossing. Was 3X, 5 minuten., Dan 4X, 30 minuten. met PBT.
- Pipet off laatste PBT wassen en te vervangen met de juiste montage van waterig medium dat een nucleaire tegenkleuring.
4. Montage secties op dia's en confocale microscopie
Om te voorkomen dat het breken van de dikke secties met het dekglaasje, bij de montage van individuele secties, moet een spacer te worden ingevoegd tussen de microscoop glijbaan en het dekglaasje. Hieronder staan twee alternatieve methoden van montage dik vibratome secties:
- Een spacer kan worden gecreëerd door het plaatsen van een rand van vacuüm vet in een vierkant rond het weefsel sectie. Dus, bij de vaststelling van dekglaasje, zullen de randen van het dekglaasje worden afgesloten met vacuüm vet. Druk op de randen van het dekglaasje met uw duim stevig te houden op de dia. Als het vacuüm vet is netjes en uniform aanwezig rond alle randen van het dekglaasje, wordt de dia voldoende worden afgesloten voor gebruik op een omgekeerde confocale microscoop.
- Als alternatief kan een spacer worden gemaakt met behulp van agarose chromatografie hars van bekende maaswijdte (zoals Affi-Gel Blue Gel, Bio-Rad). Pipetteer een ui van hars op de microscoop dia in elk van de vier hoeken waar de dekglaasje zal worden geplaatst. Pipet een weefselsectie en montage van de media in het midden van de vier punten van hars. Dekglaasje. Bij gebruik van een omgekeerde confocale microscoop, sluit de dekglaasje op het objectglaasje met behulp van nagellak.
- Verkrijgen van optische delen van de gekleurde vibratome plakjes met behulp van confocale microscopie. Te kwantificeren verschillende soorten cellen in het orgaan van Corti, het verkrijgen van een z-stack op een bepaalde stapgrootte (tussen 1,5 en 3 micrometer). Onderdelen moeten contra-gekleurd te zijn met een nucleaire kleurstof (stap 3.8). Beelden kunnen worden bekeken op elke computer scherm na confocale beelden collectie. Cellen kunnen worden geteld handmatig worden observeren het verschijnen en verdwijnen van de kernen als beelden worden achtereenvolgens onderzocht door de z-stack.
5. Representatieve resultaten:
Een vertegenwoordiger confocale z-stack door middel van een vibratome sectie, gekleurd S100 eiwit, dat aanwezig is in pijler en Deiters 'cellen en tegengekleurd met een nucleaire kleurstof (Fig. 3A-F). Elk paneel is de confocale beelden genomen op 3 micrometer-stappen, met paneel A van de confocale beeld verkregen die het dichtst bij het oppervlak van de vibratome sectie en panel F de confocale afbeelding meest intern verkregen binnen de vibratome sectie. De morfologie van het orgaan van Corti verschijnt minimaal verstoord. In het bijzonder, zijn de cytoplasmatische uitbreidingen van de pijler cellen niet gebroken. Door op te merken het verschijnen en verdwijnen van de zuil celkernen door de z-stack (Fig. 3A tot 3F), kunnen zowel de innerlijke en uiterlijke pijler celaantal geteld worden (zie de nummering, Fig 3A -. F). Door het kleine aantal van elk celtype per confocale beeld, kan deze aanpak worden gebruikt om de meeste soorten cellen tellen in het orgaan van Corti.
Figuur 1. Intact, 15-weken oude, volwassen innerlijke oren ingekapseld in de otic capsule. (A) Het recht otic capsule (tussen haakjes), ingekapseld in de schedel, vanuit een gezichtspunt van in het hoofd, na verwijdering van de hersenen. Anterior is aan de rechterkant. (B) Intact, 15-week-oude binnenstad oren na dissectie van de schedel. Lateraal oppervlak van het linker binnenoor is zichtbaar, mediale oppervlak van de rechter binnen oor zichtbaar is. Labels geven aan de locaties van de voorste halve cirkel kanaal (ASC), co (cochlea), en ow (ovale venster).
Figuur 2. (A) Gehele binnenoor van een 15-week-oude volwassen, ingebed in agarose in het centrum van een Peel-Away mal. Voorgenomen vlak van sectie is aangegeven. (B) Close-up beeld van een 15-week-oud, heel binnenoor voorafgaand aan de inbedding. Een deel van het omringende bot is verwijderd ontleed, zodat de membraneuze labyrint kan een duidelijker bekeken. De laterale semi-circulaire kanaal (LSC), anterior semi-Ringvaart (ASC), en het slakkenhuis (co) worden opgespoord (wit curves). De basale begin van het slakkenhuis (pijlpunt) en de beoogde vlak van sectie (stippellijn) zijn aangegeven. (C) Representatieve cross-doorsnede door het slakkenhuis. In een dwarsdoorsnede van het cochleair kanaal, het orgaan van Corti (oC) doos is, de stria vascularis (sv) is tussen haakjes, en de Reissner het membraan (RM) is aangegeven.
Figuur 3. Het orgaan van Corti in een wild-type muis op P21. (AF) Sequentieel confocale-serie, op een 3 micrometer stap-formaat, door middel van een antilichaam-S100 gekleurde orgaan van Corti naar de pilaar cellen en Deiters visualiseren 'cellen. Tellingen van innerlijke en uiterlijke pilaar cellen van het begin tot het einde van de serie zijn genummerd. Afkortingen: IHC (binnenste haarcel), aIHC (aangrenzende binnenste haarcel), OHC (buitenste haarcel), PC (pijler cel), DC (Deiters "cel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De procedure van vibratome snijden, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming zorgt voor de visualisatie van het orgaan van Corti met minimale weefselbeschadiging. Het is duidelijk, confocale beelden genomen van de interne regio's in de vibratome hoofdstuk tonen uitstekende conservering van cellulaire morfologie, dat wordt alleen beperkt door fixatie artefacten. Confocale beelden dichtbij genomen om de twee cut-oppervlakken van een vibratome sectie zijn vaak niet te onderscheiden van afbeeldingen van interne regio's, hoewel af en toe cellulaire verstoringen, zoals onderbrekingen in de cytoplasmatische uitbreidingen van de pijler cellen waargenomen (niet getoond). Deze aanpak is eenvoudig, en de belangrijkste apparatuur items - een vibratome machine en confocale microscoop - zijn gemeenschappelijke apparatuur items die algemeen toegankelijk zijn voor de meeste onderzoekers. Daarnaast kan deze aanpak worden gebruikt voor elke antistof die specifieke kleuring in het orgaan van Corti shows. Inderdaad, de belangrijkste beperking van deze aanpak is de specificiteit van het antilichaam, en aanpassingen aan 3 van dit protocol stap kan nodig zijn om ervoor te zorgen dat een bepaald antilichaam zal resulteren in specifieke kleuring. In het kort beschrijf ik een eenvoudige procedure, die generaliseerbaar naar alle antilichaam en zorgt voor maximaal behoud en de analyse van de cellulaire organisatie van het orgaan van Corti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Medical College of Wisconsin IACUC in te stellen.
Acknowledgments
De auteur wil graag gebruik maken van de Children's Research Institute Imaging Core voor de confocale microscopie en Dr Jian Zhang voor de suggestie erkennen om delen met behulp van agarose parels monteren. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie DC010387.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
