Summary
Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.
Abstract
Das Säugetier-Corti-Organ ist ein hoch geordneter zellulären Mosaik mechanosensorischen Haar und nichtsinnlichen Stützzellen
(Besprochen in 1,2). Visualisierung von diesem zellulären Mosaik oft verlangt, dass das Corti-Organ im Querschnitt ist. Insbesondere kann die nichtsinnlichen Säule und Deiters 'Zellen, deren Kerne sind basal in Bezug auf die Haarzellen befinden, nicht sichtbar gemacht werden, ohne Querschliffe Corti-Organ. Allerdings ist die zarte Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, einschließlich der feinen zytoplasmatischen Prozesse der Säule und Deiters 'Zellen, schwer durch routinemäßige histologische Verfahren wie Paraffin und Kryo-Schnitte, die kompatibel mit Standard-immunhistochemische Färbetechniken sind zu bewahren.
Hier beschreibe ich eine einfache und robuste Verfahren, bestehend aus Vibratom Schnitte der Cochlea, immunhistochemische Färbung dieser Vibratom Abschnitte in whole mount, durch konfokale Mikroskopie verfolgt. Dieses Verfahren wurde in großem Umfang für die immunhistochemische Analyse von mehreren Organen, einschließlich der Maus Gliedmaßenknospe, Zebrafisch Darm, Leber, Bauchspeicheldrüse und Herz (siehe 3-6 für ausgewählte Beispiele) verwendet. Darüber hinaus wurde dieses Verfahren erfolgreiche sowohl für Imaging und quantitificaton der Säule Zellzahl in der Mutante und Kontrollorgane von Corti in beiden Embryonen und erwachsenen Mäusen 7. Diese Methode ist jedoch derzeit nicht weit verbreitet, um die Säugetier-Corti-Organ zu untersuchen. Das Potenzial für dieses Verfahren, um beide bieten verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der erwachsenen Corti-Organ und erlauben die Quantifizierung der verschiedenen Zelltypen beschrieben.
Protocol
1. Isolation und Fixierung der inneren Ohren
- Für die Analyse von zellulären Strukturierung im Corti-Organ, euthanize entsprechend inszeniert Embryonen oder Erwachsenen.
- Sezieren die Ohrkapsel, mit dem häutigen Innenohr. In der Maus, kann dies leicht an Embryonen in embryonale (E) Tag 14,5 und älter, in denen E0.5 der Tag, an dem ein Vaginalpfropf wurde erkannt wird getan werden. Dissektion der Ohrkapsel wird zunächst durch Enthauptung und die Öffnung des Schädels an der Mittellinie erfolgen. Entfernen Gehirn an beiden Ohren (Abb. 1A) aussetzen. Inner Ohren können geschält werden, aus intakten mit einer Pinzette (zB Dumont Nr. 5, Abb.. 1B). Wenn Imaging-Corti-Organ, ist eine sorgfältige Entfernung aller neuronalen und des Bindegewebes mit der Ohrkapsel verbunden sind, nicht erforderlich.
- Fix gesamte Innenohr durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd (PFA) unter leichtem Schütteln bei 4 ° C über Nacht in 1,8 ml mit Schraubverschluss NUNC Cryo-Röhrchen Fläschchen oder andere entsprechend großen Behälter. PFA-Lösung sollte frisch zubereitet werden in ddH 2 0, dann bei -20 ° C gelagert, bis sie benötigt.
- Am nächsten Tag auswaschen Fixativ mit drei Änderungen 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Gewebe kann in sterile 1X PBS für Tage bis Monate gelagert werden, bis zur Verarbeitung bereit. Für erwachsene Gewebe, in 10% EDTA (0,27 M) entkalken bei 4 ° C für 5 Tage, gefolgt von Spülen und Lagerung in 1X PBS gefolgt.
2. Cutting Vibratom Abschnitte
- Bereiten Sie 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in 1X PBS. Add niedrigen Schmelzpunkt Agarose 1X PBS und Mikrowelle bis Agarose wird in Lösung. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht Blase über - nehmen Sie aus der Mikrowelle in regelmäßigen Abständen und wirbeln zu mischen. Keep-Lösung in einem 55 ° C Wasserbad bis zur Verwendung.
- Mit einer Pinzette entfernen Innenohr von 1X PBS-Lösung und die Position auf dem Boden einer Peel-A-Way Einbettform. Pipettieren entfernt überschüssiges 1X PBS aus der Form. Fill Form, um das Gewebe mit reichlich Flüssigkeit 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (Abb. 2A) zu decken.
- Position des Innenohrs zum Schneiden in die entsprechende Ebene. Ich habe gute Querschnitte des Corti-Organ durch Angleichung der Stellung der Ohrkapsel, als ob es in situ in den Kopf nach links war und Schnitte in der Transversalebene erhalten. Für E14.5 Embryonen für Erwachsene, Position des Innenohrs, so dass es seitlich, mit den seitlichen halbkreisförmigen Kanal sichtbar (Abb. 2B) angesehen. Angle das Innenohr, so dass die Linie von der hinteren Seite der Ohrkapsel gebildet ungefähr in einem 45-Grad-Winkel von der beabsichtigten Schnittebene (Abb. 2A, B). Wenn die Ohrkapsel so angesehen wird, dass die dorsale Teil der Ohrkapsel an der Spitze ist, sollte der basalen Windung der Cochlea am unteren Rand (Pfeilspitze, Abb.. 2B) befinden und die vorderen halbkreisförmigen Kanal (asc) sollte werden an der Spitze (Abb. 2B).
- Agarose wird bei RT innerhalb von 30 Minuten eingestellt. Transfer-Peel-Away Formen mit eingebetteten Gewebe bis 4 ° C bis zu seiner Sektion. Wenn Schnitte werden bis zum nächsten Tag gestellt werden, fügen 1X PBS, um die Agarose in der Form und speichern in eine Kiste mit feuchtem Küchenpapier in 1X PBS getränkt decken.
- Lösen Sie den Kunststoff-Formenbau. Mit einer Rasierklinge herausgeschnitten einer Agarose-Box mit dem Innenohr Gewebe. Achten Sie darauf, dass die Schnittfläche gerade und parallel auf der gegenüberliegenden Seite des Blocks, die die Oberfläche, auf denen die Agaroseblock geklebt unten ist werden wird. Da die Agarose nicht infiltrieren nicht das Gewebe, nicht beschneiden zu viel Agarose aus aller Gewebe, so dass das Gewebe wird gut unterstützt.
- Verwenden Sie Sekundenkleber, um den Block auf die Schnittfläche legen.
- Sektion 40 bis 100 mu m Dicke durch Vibratom. Speichern Abschnitte in einem Gewebe-Kulturschale mit 1X PBS, 0,1% TritonX-100 gefüllt. Eine repräsentative Querschnitt durch die Cochlea-Spirale ist in Abb. dargestellt. 2C.
- Verwenden einer Pinzette zu sezieren entfernt die Agarose aus dem Gewebe. Agarose wird nicht in das Gewebe eindringen, sondern nur an der äußeren Oberfläche des inneren Ohres stecken.
- Wenn gewünscht, mit Pool Agarose-free, geschnitten Gewebe einer Pipette mit einem großen Loch Öffnung übermäßige Scherung des Gewebes zu verhindern. Oder 24-Well-Kulturschale - Wenn Durchführung mehrerer Antikörper Flecken auf mehreren verschiedenen Geweben, können Abschnitte in einem 16 organisiert werden.
3. Antikörper-Färbung Vibratom Abschnitte
Fahren Sie mit dem Antikörper-Färbung. Prozess Abschnitte ganz-mount, frei schwebend in Lösung. Unten ist ein Beispiel Antikörper-Färbung Protokoll für den S100 Marker der Säule Zellen des Corti-Organ, sondern kann das Protokoll für jeden Antikörper verwendet werden. Alle Wäschen sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders vermerkt.
- In einer Multi-Well-Kulturschale, inkubieren frei schwebenden Abschnitte mit sanften Schaukeln in PBT (1X PBS, 1% Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100) für 30 Minuten.
- Pipettieren aus alten Lösung und Block frei floating Abschnitte mit sanften Schaukeln in PBT + normalem Ziegenserum (50 ul NGS / 1 ml PBT) für 30 Minuten.
- Pipettieren aus alten Lösung und fügen primärer Antikörper in PBT + NGS (1:200 Verdünnung der S100 in PBT + NGS) verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
- Pipettieren aus primärer Antikörper-Lösung. 3x, 5 min. mit PBT, dann 4X, 30 min. mit PBT.
- Block mit PBT + NGS, 30 min.
- Inkubieren mit Fluoreszenz-konjugierten sekundären Antikörper (aufgewachsen in Ziege) in PBT + NGS verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C, oder ein paar Stunden, RT, sanfte Schaukeln.
- Pipettieren aus sekundären Antikörper-Lösung. 3x, 5 min., Dann 4X, 30 min. mit PBT.
- Pipet off letzten PBT waschen und zu ersetzen mit den entsprechenden wässrigen Eindeckmedium mit einem nuklearen Gegenfärbung.
4. Montage Abschnitte über Rutschen und konfokale Mikroskopie
Um zu verhindern, Zerkleinern der dicke Abschnitte mit dem Deckglas, bei der Montage einzelner Abschnitte, muss ein Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas eingefügt werden. Unten sind zwei alternative Methoden der Montage dicken Vibratom Abschnitte:
- Ein Abstandhalter kann, indem ein Rand Vakuumfett in ein Quadrat um den Gewebeschnitt erstellt werden. So bei der Festlegung der Deckglas, werden die Kanten des Deckglases mit Vakuumfett abgedichtet werden. Drücken Sie auf die Ränder des Deckglases mit dem Daumen fest haften sie auf die Folie. Wenn das Vakuum Fett ist sauber und gleichmäßig vorhanden um alle Kanten des Deckglases, wird die Folie ausreichend für den Einsatz auf einer invertierten konfokalen Mikroskop abgedichtet werden.
- Alternativ kann ein spacer erstellt unter Verwendung von Agarose Chromatographieharz bekannter Maschenweite (wie Affi-Gel Blue Gel, Bio-Rad) werden. Pipet 1 ul Harz auf den Objektträger in jeder der vier Ecken, wo das Deckglas platziert werden soll. Pipet einem Gewebeschnitt und Montage von Medien in der Mitte der vier Punkte des Harzes. Deckglas. Bei Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop, Deckglasränder auf den Objektträger mit Nagellack.
- Erhalten optische Schnitte des gefärbten Vibratom Scheiben mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Zur Quantifizierung verschiedener Zelltypen innerhalb des Corti-Organ, erhalten eine z-Stapel mit einer definierten Schrittweite (zwischen 1,5 und 3 um). Abschnitte sollten gegengefärbt mit einem nuklearen Farbstoff (Schritt 3,8). Bilder können auf jedem Computer-Bildschirm nach konfokalen Bild Sammlung untersucht werden. Die Zellen können gezählt manuell beobachten das Auftreten und Verschwinden der Kerne, wie Bilder der Reihe nach durch die z-Stapel untersucht werden.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Vertreter der konfokalen Z-Stapel durch eine Vibratom Abschnitt für S100-Protein, das in Säule und Deiters 'Zellen und gegengefärbt mit einem nuklearen Farbstoff (Abb. 3A-F) gefärbt. Jedes Panel ist die konfokale Abbildung bei 3 um-Schritte, mit Panel A die konfokale Abbildung erhalten am nächsten an der Oberfläche des Vibratom Abschnitt und Panel-F die konfokale Abbildung meisten intern in der Vibratom Abschnitt erhalten. Die Morphologie der Corti-Organ scheint minimal gestört. Insbesondere sind die cytoplasmatische Erweiterungen der Säule Zellen nicht gebrochen. Indem man das Auftauchen und Verschwinden der Säule Zellkernen durch die z-Stapel (Abb. 3A bis 3F), können sowohl innere und äußere Säule Zellzahl gezählt (siehe Nummerierung, 3A. - F) sein. Aufgrund der geringen Anzahl von jedem Zelltyp pro konfokale Abbildung, kann dieser Ansatz verwendet, um den meisten Zelltypen innerhalb des Corti-Organ zu zählen.
Abbildung 1. Intakt, 15-Wochen alten, eingehüllt erwachsene Innenohr in der Labyrinthkapsel. (A) Das Recht Ohrkapsel (in Klammern) eingeschlossen in den Schädel, betrachtet von einem Aussichtspunkt im Kopf, nach der Entfernung des Gehirns. Anterior ist auf der rechten Seite. (B) Intact, 15-Wochen alten Innenohr nach der Sektion aus dem Schädel. Seitliche Fläche des linken Innenohr ist sichtbar; medialen Fläche des rechten Innenohr sichtbar ist. Labels zeigen die Positionen der vorderen halbkreisförmigen Kanal (asc), Co (Cochlea) und ow (ovales Fenster).
Abbildung 2. (A) insgesamt Innenohr von einem 15-Wochen alten Erwachsenen, in Agarose in der Mitte einer Peel-Away Form eingebettet. Beabsichtigte Schnittebene angezeigt. (B) Close-up Bild von einem 15-Wochen alten, ganze Innenohr vor dem Einbetten. Ein Teil der umgebenden Knochen wurde entfernt, so dass die häutige Labyrinth eines betrachteten könnte deutlicher seziert. Die seitlichen halbkreisförmigen Kanal (LSC), anterior halbkreisförmigen Kanal (asc) und Cochlea (co) sind zurückzuführen (weiß Kurven). Die basalen Windung der Cochlea (Pfeilspitze) und bestimmt Schnittebene (gestrichelte Linie) angegeben sind. (C) Repräsentative cross-Schnitt durch die Cochlea. In einem Querschnitt durch den Ductus cochlearis, das Corti-Organ (oC) boxed ist, ist die Stria vascularis (sv) Klammern und die Reissner-Membran (Rm) angezeigt wird.
Abbildung 3. Das Corti-Organ in einem Wildtyp-Maus auf P21. (AF) Sequential konfokalen Serie, in einem 3 um Schritt-Größe, durch eine S100-Antikörper-gefärbten Corti-Organ an der Säule Zellen und Deiters visualisieren 'Zellen. Grafen von inneren und äußeren Säulen Zellen von Anfang bis zum Ende der Serie sind nummeriert. Abkürzungen: IHC (inneren Haarzelle), AIHC (benachbarten inneren Haarzellen), OHC (äußere Haarzellen), PC (Säule Zelle), DC (Deiters 'Zelle).
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Discussion
Das Verfahren der Vibratom Schnitte, durch Immunhistochemie und konfokale Bildgebung gefolgt ermöglicht die Visualisierung des Corti-Organ mit minimalen Gewebeschäden. Offensichtlich zeigen konfokale Bilder aus dem internen Regionen in der Vibratom Abschnitt entnommen ausgezeichnete Erhaltung der Zellmorphologie, die nur durch Fixierung Artefakte begrenzt ist. Konfokale Bilder der Nähe der beiden cut-Oberflächen eines Vibratom Abschnitt entnommen werden oft von den Bildern aus dem internen Regionen zu unterscheiden, obwohl gelegentliche zellulären Störungen, wie Pausen in der cytoplasmatischen Erweiterungen der Säule Zellen beobachtet (nicht dargestellt). Dieser Ansatz ist einfach, und die wichtigsten Ausrüstungsgegenstände - eine Vibratom Maschinen-und konfokalen Mikroskop - sind häufig Ausrüstungsgegenstände, die allgemein zugänglich sind, um die meisten Forscher. Darüber hinaus kann dieser Ansatz für alle Antikörper, der spezifische Färbung in der Corti-Organ Shows verwendet werden. In der Tat ist die primäre Einschränkung dieses Ansatzes die Spezifität der Antikörper und Modifikationen bis 3 dieses Protokolls Schritt kann es notwendig sein, um sicherzustellen, dass ein bestimmter Antikörper wird in spezifische Färbung ergeben. Zusammenfassend beschreibe ich ein einfaches Verfahren, die verallgemeinerbar keine Antikörper und sorgt für maximale Erhaltung und Analyse der zellulären Organisation der Corti-Organ.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Medical College of Wisconsin IACUC gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Der Autor möchte die Nutzung der Kinder-Forschungsinstitut Imaging Core für die konfokale Mikroskopie und Dr. Jian Zhang für den Vorschlag bestätigen die Abschnitte mit Agaroseperlen montieren. Diese Arbeit wurde vom NIH DC010387 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
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