Summary
Vibratome का एक सरल प्रक्रिया Corti के अंग, immunohistochemistry और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा सेक्शनिंग वर्णित है. यह प्रक्रिया Corti के स्तनधारी अंग ठीक cytoarchitecture के बेहतर संरक्षण के लिए अनुमति देता है, और फलस्वरूप सेल प्रकार की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.
Abstract
Corti के स्तनधारी अंग mechanosensory बाल और nonsensory समर्थन कोशिकाओं के एक उच्च आदेश दिया सेलुलर मोज़ेक है
(1,2 में समीक्षा) इस सेलुलर मोज़ेक के विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर की आवश्यकता है कि Corti के पार sectioned अंग है. विशेष रूप से, nonsensory स्तंभ और DEITERS कोशिकाओं, जिसका नाभिक बालों की कोशिकाओं के लिए सम्मान के साथ basally स्थित Corti के अंग पार - सेक्शनिंग के बिना कल्पना नहीं किया जा सकता है. हालांकि, Corti के स्तनधारी अंग के नाजुक cytoarchitecture, स्तंभ और DEITERS कोशिकाओं के ठीक cytoplasmic प्रक्रियाओं सहित, आयल और क्रायो सेक्शनिंग जैसे नियमित histological प्रक्रियाओं, जो मानक immunohistochemical धुंधला तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं द्वारा संरक्षित करने के लिए मुश्किल है.
यहाँ मैं एक सरल और मजबूत कोक्लीअ, पूरे माउंट में इन vibratome वर्गों के immunohistochemical धुंधला हो जाना, confocal माइक्रोस्कोपी के बाद के सेक्शनिंग vibratome से मिलकर प्रक्रिया का वर्णन. यह प्रक्रिया माउस अंग कली, zebrafish पेट, यकृत, अग्न्याशय, और दिल (3-6 देख चयनित उदाहरण के लिए) सहित कई अंगों के immunhistochemical विश्लेषण के लिए किया गया है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया . इसके अलावा, दोनों और स्तंभ दोनों भ्रूण और वयस्क चूहे 7 में उत्परिवर्ती और नियंत्रण Corti के अंगों में सेल नंबर के इमेजिंग quantitificaton के लिए इस कार्यविधि का sucessful था . इस विधि, तथापि, वर्तमान Corti के स्तनधारी अंग की जांच व्यापक रूप से इस्तेमाल नहीं किया. इस प्रक्रिया के लिए संभावित दोनों Corti के वयस्क अंग ठीक cytoarchitecture बढ़ाया संरक्षण प्रदान करने और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देते हैं वर्णित है.
Protocol
1. अलगाव और भीतरी कान के निर्धारण
- Corti के अंग में सेलुलर patterning के विश्लेषण के लिए, euthanize उचित भ्रूण या वयस्कों का मंचन किया.
- कान का कैप्सूल टुकड़े करना, झिल्लीदार भीतरी कान युक्त. माउस में, यह आसानी से भ्रूण में भ्रूण (ई) 14.5 दिन और पुराने, जो E0.5 दिन है जिस पर एक योनि प्लग का पता चला था पर किया जा सकता है. कान का कैप्सूल के विच्छेदन पहले कत्ल और midline पर खोपड़ी के उद्घाटन के द्वारा पूरा किया है. मस्तिष्क को हटाने के लिए प्रत्येक कान (छवि 1A) का पर्दाफाश. भीतरी कान बाहर खोलीदार बरकरार संदंश का उपयोग (जैसे कि # 5 Dumont, अंजीर. 1B) किया जा सकता है. यदि इमेजिंग Corti के अंग, कान का कैप्सूल के साथ जुड़े सभी neuronal और संयोजी ऊतक के सावधान हटाने के लिए आवश्यक नहीं है.
- 4% paraformaldehyde में 4 (पीएफए) विसर्जन कोमल कमाल के साथ द्वारा पूरे भीतरी कान ठीक डिग्री सेल्सियस 1.8 मिलीलीटर पेंच छाया NUNC क्रायो - ट्यूब शीशियों, या अन्य उचित आकार के कंटेनर में रात भर. 2 0 DDH में पीएफए समाधान हो ताजा किया जाना चाहिए, तब से -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब तक की जरूरत है.
- अगले दिन, 1X फॉस्फेट के तीन परिवर्तन के साथ बाहर धोने लगानेवाला खारा (पीबीएस) buffered. ऊतक महीने के लिए दिनों के लिए बाँझ 1X पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है प्रसंस्करण के लिए तैयार है जब तक. वयस्क ऊतक के लिए, 4 में 10% EDTA (0.27 एम) में decalcify ° 5 दिनों के लिए सी, rinsing और 1X पीबीएस में भंडारण के द्वारा पीछा किया.
2. Vibratome वर्गों में कटौती
- 1X पीबीएस में 4% कम गलनांक agarose तैयार करें. 1X पीबीएस और माइक्रोवेव कम पिघलने बिंदु agarose जोड़ें जब तक agarose समाधान में है. ख्याल है कि समाधान बुलबुला अधिक नहीं है ले लो - समय - समय पर माइक्रोवेव और मिश्रण ज़ुल्फ़ के बाहर ले जाना. एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में समाधान रखें जब तक का उपयोग करने के लिए तैयार है.
- संदंश का प्रयोग, 1X पीबीएस समाधान और एम्बेडिंग पील - एक मार्ग मोल्ड के तल पर स्थिति से भीतरी कान हटायें. Pipet मोल्ड से दूर किसी भी अतिरिक्त 1X पीबीएस. खूब तरल 4% कम गलनांक agarose (छवि 2A) के साथ ऊतक कवर मोल्ड भरें.
- उपयुक्त विमान में सेक्शनिंग के लिए भीतरी कान स्थिति. मैं approximating के कान का कैप्सूल की स्थिति के रूप में अगर यह सिर में बगल में छोड़ दिया गया था और अनुप्रस्थ विमान में सेक्शनिंग द्वारा Corti के अंग के अच्छे - पार वर्गों प्राप्त किया है. E14.5 वयस्कों, भीतरी कान की स्थिति इतनी है कि यह पार्श्व पार्श्व अर्द्ध परिपत्र दिखाई नहर (छवि 2B) के साथ देखा जाता है, भ्रूण के लिए. भीतरी कान इतना है कि कान का कैप्सूल के पीछे की ओर से गठित की लाइन सेक्शनिंग (छवि 2A, बी) का इरादा विमान से 45 डिग्री के कोण पर लगभग कोण. जब कान कैप्सूल तो देखा जा सकता है कि कान का कैप्सूल के पृष्ठीय भाग शीर्ष पर है, कोक्लीअ के बेसल बारी नीचे (arrowhead, चित्र 2B) पर स्थित होना चाहिए और पूर्वकाल अर्द्ध परिपत्र नहर (ए एस सी) होना चाहिए ऊपर (छवि 2B) पर हो.
- Agarose आरटी पर 30 मिनट के भीतर की स्थापना की जाएगी. स्थानांतरण पील दूर - molds के 4 से डिग्री सेल्सियस तक अनुभाग के लिए तैयार एम्बेडेड ऊतक युक्त. यदि सेक्शनिंग अगले दिन तक बंद रखा जाएगा, 1X पीबीएस और नम कागज 1X पीबीएस में भिगो तौलिये वाले बॉक्स में ढालना दुकान में agarose को कवर करने के लिए जोड़ें.
- प्लास्टिक मोल्ड दूर छील. एक धार का प्रयोग, बाहर एक agarose भीतरी कान ऊतक युक्त बॉक्स में कटौती. ध्यान रखना सुनिश्चित करें कि खंड के विमान सीधे और ब्लॉक के विपरीत पक्ष है, जो सतह पर जो agarose ब्लॉक नीचे सरेस से जोड़ा हुआ है जाएगा समानांतर है. चूंकि agarose ऊतक घुसपैठ नहीं करता है, बहुत ज्यादा agarose ऊतक के आसपास से नहीं ट्रिम करते हैं, ताकि ऊतक अच्छी तरह से समर्थित हो जाएगा.
- Superglue का उपयोग करें ब्लॉक काटने की सतह के लिए देते हैं.
- 40 से 100 सुक्ष्ममापी मोटाई vibratome द्वारा धारा. एक ऊतक संस्कृति 1X Pbs, 0.1% TritonX सौ से भरा पकवान में वर्गों को सहेजें. कर्णावत सर्पिल के माध्यम से एक प्रतिनिधि अनुभाग में छवि में दिखाया गया है. 2C.
- ऊतकों से दूर agarose काटना संदंश का प्रयोग करें. Agarose ऊतक घुसना नहीं, लेकिन बस भीतरी कान की बाहरी सतह के लिए अटक जाएगा.
- अगर वांछित, पूल agarose से मुक्त, sectioned ऊतक के एक बड़े छेद खोलने के साथ एक pipet का उपयोग करने के लिए ऊतक के अत्यधिक बाल काटना को रोकने. या 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान - यदि कई अलग अलग ऊतकों पर एकाधिक एंटीबॉडी दाग प्रदर्शन, अनुभागों एक 16 में आयोजित किया जा सकता है.
3. एंटीबॉडी धुंधला vibratome वर्गों
एंटीबॉडी दाग के साथ आगे बढ़ें. पूरे माउंट में प्रक्रिया वर्गों, मुक्त अस्थायी समाधान में. नीचे S100 Corti के अंग की स्तंभ कोशिकाओं के मार्कर के लिए एक उदाहरण एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल है, लेकिन प्रोटोकॉल किसी भी एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी washes के कमरे के तापमान पर आयोजित की जाती हैं जब तक अन्यथा नोट.
- बहु - अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति डिश में, पीबीटी में कोमल कमाल (1X Pbs, 1% गोजातीय सीरम albumin, 0.1% Triton एक्स 100) के साथ 30 मिनट के लिए मुक्त अस्थायी वर्गों को सेते हैं.
- पुराने समाधान और मुक्त fl ब्लॉक बंद Pipetपीबीटी + सामान्य बकरी सीरम में कोमल कमाल (50 μl NGS / 1 मिलीलीटर पीबीटी) के साथ 30 मिनट के लिए वर्गों oating.
- पुराने समाधान बंद Pipet और प्राथमिक पीबीटी + NGS (पीबीटी + NGS में S100 के 1:200 कमजोर पड़ने) में पतला एंटीबॉडी जोड़ें. 4 में रातोंरात सेते ° कोमल कमाल के साथ सी.
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बंद Pipet. 3X धो, 5 मिनट. पीबीटी के साथ, तो 4X, 30 मिनट. पीबीटी साथ.
- पीबीटी + NGS के साथ ब्लॉक, 30 मिनट.
- Fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी में उठाया) पीबीटी + NGS में पतला के साथ सेते हैं. 4 में रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस, या कुछ घंटे, आरटी, कोमल कमाल.
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान बंद Pipet. 3X धो, 5 मिनट, तो 4X, 30 मिनट. पीबीटी साथ.
- पिछले पीबीटी बंद Pipet धोने और उपयुक्त जलीय बढ़ते परमाणु counterstain युक्त मध्यम के साथ प्रतिस्थापित.
4. स्लाइड और confocal माइक्रोस्कोपी पर बढ़ते वर्गों
Coverslip के साथ मोटी वर्गों कुचल रोकने के लिए, जब अलग अलग वर्गों बढ़ते, एक स्पेसर खुर्दबीन स्लाइड और coverslip के बीच डाला जाना चाहिए. नीचे बढ़ते मोटी vibratome वर्गों के दो वैकल्पिक तरीके हैं:
- एक स्पेसर ऊतक खंड के चारों ओर एक वर्ग में वैक्यूम तेल की एक रिम रखकर बनाया जा सकता है है. इस प्रकार, जब नीचे बिछाने coverslip coverslip के किनारों वैक्यूम तेल के साथ बंद हो जाएगा. अपने अंगूठे के साथ मजबूती से यह स्लाइड पर पालन coverslip के किनारों पर नीचे प्रेस. यदि वैक्यूम तेल coverslip के सभी किनारों के आसपास बड़े करीने से और समान रूप से मौजूद है, स्लाइड एक औंधा confocal खुर्दबीन पर उपयोग के लिए पर्याप्त सील होगा.
- वैकल्पिक रूप से, एक स्पेसर agarose जाना जाता जाल आकार के क्रोमैटोग्राफी राल (जैसे Affi जेल ब्लू जेल, जैव रेड के रूप में) का उपयोग कर बनाया जा सकता है. Pipet में से प्रत्येक के चार कोनों जहां coverslip रखा जाएगा में खुर्दबीन स्लाइड पर 1 राल के μl. Pipet एक ऊतक और राल के चार डॉट्स की बीच में खंड बढ़ते मीडिया. Coverslip. एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग कर अगर, खुर्दबीन स्लाइड पर coverslip मुहर nailpolish का उपयोग.
- दाग vibratome confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस की ऑप्टिकल वर्गों प्राप्त करते हैं. Corti के अंग के भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं यों, एक परिभाषित कदम आकार (1.5 और 3 सुक्ष्ममापी के बीच) एक z ढेर प्राप्त करते हैं. धारा काउंटर से सना हुआ एक परमाणु डाई (3.8 कदम) के साथ किया जाना चाहिए. छवियाँ confocal छवि संग्रह के बाद किसी भी कंप्यूटर स्क्रीन पर जांच की जा सकती है. कक्ष मैन्युअल रूप से उपस्थिति और नाभिक के लापता होने अवलोकन के रूप में चित्र sequentially Z-ढेर के माध्यम से जांच कर रहे हैं गिना जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
एक vibratome अनुभाग के माध्यम से एक प्रतिनिधि Z-ढेर confocal S100 प्रोटीन है, जो स्तंभ और DEITERS कोशिकाओं में मौजूद है, और एक परमाणु डाई (छवि 3A एफ) के साथ counterstained के लिए दाग. प्रत्येक पैनल confocal 3 सुक्ष्ममापी कदम पर लिया छवि पैनल के साथ है, एक confocal छवि प्राप्त vibratome अनुभाग और पैनल एफ confocal vibratome अनुभाग के भीतर सबसे आंतरिक प्राप्त छवि की सतह के लिए निकटतम. Corti के अंग की आकारिकी न्यूनतम बाधित प्रकट होता है. विशेष रूप में, स्तंभ कोशिकाओं के cytoplasmic एक्सटेंशन नहीं टूट रहे हैं. Z ढेर (छवि 3A 3F करने के लिए) के माध्यम से उपस्थिति और स्तंभ कोशिका नाभिक के लापता होने टिप्पण द्वारा, दोनों आंतरिक और बाहरी स्तंभ सेल नंबर गिना जा सकता है (- एफ क्रमांकन, अंजीर 3A देखें). Confocal छवि के प्रति प्रत्येक कोशिका प्रकार की छोटी संख्या के कारण, इस दृष्टिकोण Corti के अंग के भीतर सबसे सेल प्रकार की गिनती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1 बरकरार, 15 सप्ताह पुरानी है, वयस्क भीतरी कान कान कैप्सूल में encased . (ए) सही कान कैप्सूल (कोष्ठकों के भीतर) खोपड़ी में encased, सिर के अंदर की एक सुविधाजनक मोरचा से देखा मस्तिष्क को हटाने के बाद. पूर्वकाल सही करने के लिए है. (बी) बरकरार है, 15 सप्ताह पुरानी खोपड़ी से विच्छेदन के बाद भीतरी कान. बाएँ भीतरी कान के पार्श्व सतह दिख रहा है, सही भीतरी कान की औसत दर्जे सतह दिख रहा है. लेबल पूर्वकाल अर्द्ध परिपत्र (ए एस सी) नहर, सह (कोक्लीअ), और ओ (अंडाकार खिड़की) के स्थानों से संकेत मिलता है.
चित्रा 2 (ए) 15 सप्ताह पुराने एक वयस्क, एक मोल्ड पील दूर के केंद्र में agarose में एम्बेडेड से पूरा भीतरी कान. अनुभाग का इरादा विमान संकेत दिया है. (बी) एक 15 सप्ताह पुरानी है, पूरे भीतरी कान के क्लोज़ - अप एम्बेडिंग पहले छवि. आसपास के हड्डी के एक हिस्से को दूर dissected है तो झिल्लीदार भूलभुलैया एक और अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है. पार्श्व अर्द्ध परिपत्र (LSC) नहर, पूर्वकाल अर्द्ध परिपत्र नहर (ए एस सी), और कोक्लीअ (सह) (सफेद घटता) का पता लगाया है. कोक्लीअ (arrowhead) और खंड (डैश्ड रेखा) का इरादा विमान के बेसल बारी संकेत कर रहे हैं. (सी) प्रतिनिधि CROsकोक्लीअ के माध्यम से अनुभाग. हलकी लीक vascularis (sv), एक कर्णावत नली के माध्यम से पार अनुभाग में, Corti (oC) के अंग बॉक्सिंग है bracketed है, और रेइस्स्नेर झिल्ली (Rm) संकेत है.
चित्रा 3. P21 पर एक जंगली प्रकार माउस में Corti के अंग. (वायुसेना) एक 3 कदम आकार Corti के एक अंग S100 एंटीबॉडी से सना हुआ स्तंभ कोशिकाओं और DEITERS कल्पना के माध्यम से, सुक्ष्ममापी 'कोशिकाओं को अनुक्रमिक confocal श्रृंखला,. श्रृंखला के अंत में शुरू से ही आंतरिक और बाहरी स्तंभ कोशिकाओं की गणना गिने जा रहे हैं. लघुरूप: आईएचसी (भीतर बाल सेल), (आसन्न भीतर बाल सेल) aIHC, (बाहरी बाल सेल) OHC, पीसी (स्तंभ कोशिका), डीसी ('DEITERS सेल).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
vibratome सेक्शनिंग, immunohistochemistry और confocal इमेजिंग द्वारा बाद की प्रक्रिया कम से कम ऊतकों को नुकसान के साथ Corti के अंग के दृश्य के लिए अनुमति देता है. जाहिर है, confocal vibratome अनुभाग में आंतरिक क्षेत्रों से लिया छवियों निर्धारण कलाकृतियों के द्वारा ही सीमित है सेलुलर आकारिकी कि उत्कृष्ट संरक्षण दिखा. Confocal एक vibratome खंड के दो कटौती सतहों के लिए करीब लिया छवियों अक्सर आंतरिक क्षेत्रों से छवियों से अप्रभेद्य हैं, हालांकि स्तंभ कोशिकाओं के cytoplasmic एक्सटेंशन में टूट के रूप में कभी कभी सेलुलर अवरोधों, () नहीं दिखाया मनाया गया. यह दृष्टिकोण सरल है, और प्रमुख उपकरण आइटम - एक vibratome मशीन और confocal खुर्दबीन - आम उपकरण आइटम कि आम तौर पर कर रहे हैं सबसे जांचकर्ताओं के लिए सुलभ हैं. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण किसी भी एंटीबॉडी कि Corti के अंग में विशिष्ट धुंधला से पता चलता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, इस दृष्टिकोण का प्राथमिक सीमा एंटीबॉडी की विशिष्टता है, और इस प्रोटोकॉल के चरण 3 संशोधनों करने के लिए सुनिश्चित करें कि किसी दिए गए एंटीबॉडी विशिष्ट धुंधला में परिणाम होगा करने के लिए आवश्यक हो सकता है. सारांश में, मैं एक साधारण प्रक्रिया है, जो किसी भी एंटीबॉडी के लिए generalizable है और अधिक से अधिक और Corti के अंग के सेलुलर संगठन के संरक्षण विश्लेषण सुनिश्चित करता है का वर्णन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
जानवरों पर प्रयोग विस्कॉन्सिन IACUC के मेडिकल कॉलेज द्वारा उल्लिखित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
लेखक बच्चों अनुसंधान संस्थान इमेजिंग कोर के confocal और सुझाव के लिए माइक्रोस्कोपी डा. Jian झांग के लिए उपयोग को स्वीकार करने के लिए agarose मोती का उपयोग कर वर्गों माउंट करना चाहते हैं. यह काम DC010387 NIH अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
