Summary
Ett enkelt förfarande vibratome sektionering organ för Corti, följt av immunohistokemi och konfokalmikroskopi beskrivs. Detta förfarande möjliggör bättre bevara den fina cytoarchitecture av däggdjur organ Corti, och därmed tillåter en exakt kvantifiering av celltyper.
Abstract
Den däggdjur organ Corti är en mycket beställde cellulär mosaik av mechanosensory hår och nonsensory stödja celler
(Över 1,2). Visning av denna cellulära mosaik kräver ofta att organ Corti är cross-delad. I synnerhet kan nonsensory pelaren och Deiters "celler, vars kärnor är belägna basally med avseende på hårcellerna, inte visualiseras utan tvärsnitt av organ Corti. Dock är den känsliga cytoarchitecture av däggdjur organ Corti, inklusive den fina cytoplasmiska processer pelaren och Deiters "celler, svåra att bevara genom rutinmässig histologisk förfaranden som paraffin och Cryo-sektionering, som är kompatibla med standard immunhistokemisk färgning tekniker.
Här beskriver jag en enkel och robust som består av vibratome sektionering av snäckan, immunhistokemisk färgning av dessa vibratome avsnitt i hela berget, följt av konfokalmikroskopiska. Detta förfarande har använts i stor utsträckning för immunhistochemical analys av flera organ, inklusive musen lem knoppen, zebrafisk tarmar, lever, bukspottkörtel och hjärta (se 3-6 för utvalda exempel). Dessutom var detta förfarande framgångsrik för både imaging och quantitificaton av pelare cell nummer i mutant och kontroll organ Corti både embryon och vuxna möss 7. Denna metod är dock för närvarande inte så vanligt att undersöka däggdjur organ Corti. Potentialen för detta förfarande för att både ge ökad bevara den fina cytoarchitecture av den vuxna organ Corti och möjliggöra kvantifiering av olika celltyper beskrivs.
Protocol
1. Isolering och fixering av inre öron
- För analys av cellulära mönster i det organ i Corti, iscensatt euthanize lämpligt embryon eller vuxna.
- Dissekera ut öron kapseln, som innehåller membranös innerörat. Hos mus, kan detta lätt göras på embryon i embryonala (E) dag 14,5 och äldre, där E0.5 är den dag då en vaginal plugg upptäcktes. Dissekering av öron kapseln sker först genom halshuggning och öppning av skallen vid mittlinjen. Ta bort hjärnan för att exponera varje öra (bild 1A). Inre öron kan skalas ut intakt med tång (såsom Dumont # 5, bild. 1B). Om avbildning av organ Corti, är noggrann borttagning av alla neuronala och bindväv i samband med öron kapseln inte nödvändigt.
- Fix hela inre öron genom nedsänkning i 4% paraformaldehyd (PFA) som försiktigt gungande vid 4 ° C över natten i 1,8 ml med skruvkork NUNC Cryo-tube flaskor eller annan lämplig storlek behållare. PFA-lösning bör göras i färskt DDH 2 0, därefter förvaras vid -20 ° C tills det behövs.
- Nästa dag, tvätta ur fixativ med tre förändringar 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Vävnaden kan lagras i sterila 1X PBS i flera dagar upp till månader tills för bearbetning. För vuxna vävnad kalka i 10% EDTA (0,27 M) vid 4 ° C under 5 dagar, följt av sköljning och förvaring i 1X PBS.
2. Kapning vibratome sektioner
- Förbered 4% låg smältpunkt agaros i 1X PBS. Lägg låg smältpunkt agarosen till 1X PBS och mikrovågsugn tills agaros är i lösning. Var noga att lösningen inte bubbla över - ta ut ur mikrovågsugnen regelbundet och snurra för att blanda. Förvara lösningen i ett 55 ° C vattenbad tills den ska användas.
- Använd pincett, ta bort innerörat från 1X PBS-lösning och placera på botten av en Peel-A-Way inbäddning mögel. Pipettera bort överflödigt 1X PBS ur formen. Fyll mögel att täcka vävnaden med massor av vätska 4% låg smältpunkt agaros (Fig. 2A).
- Placera innerörat för sektionering i rätt plan. Jag har fått bra tvärsnitt av organ Corti genom att tillnärma position öron kapseln som om den hade lämnats in situ i huvudet och sektionering i tvärplan. För E14.5 embryon till vuxna, placera innerörat så att den visas i sidled, med sido halvcirkelformade kanalen synlig (Fig. 2B). Vinkla innerörat så att den linje som bildas av den bakre sidan av öron kapsel är ungefär ett 45-graders vinkel från den avsedda plan snittning (Fig. 2A, B). När öron kapseln uppfattas så att den dorsala delen av öron kapsel är i toppen, bör de basala sekelskiftet hörselsnäckan placeras i botten (pilspets, bild. 2B) och den främre halvcirkelformad kanal (ASC) bör vara på toppen (Fig. 2B).
- Agarosen kommer in på RT inom 30 minuter. Överföring Peel-Away formar som innehåller inbäddad vävnad till 4 ° C tills den ska avsnitt. Om sektionering kommer att skjutas upp till nästa dag, lägga 1X PBS för att täcka agaros i formen och förvara i en låda med fuktigt hushållspapper indränkt i 1X PBS.
- Skala bort plasten. Använda ett rakblad, skär ut ett agarosen ruta med innerörat vävnad. Var noga med att se till att plan delen är rak och parallell med den motsatta sidan av blocket, som blir den yta på vilken agarosen blocket limmas ner. Eftersom agarosen inte infiltrera vävnaderna, inte trimma inte för mycket agarosen från hela vävnaden, så att vävnad kommer att vara väl underbyggda.
- Använd superlim för att fästa blocket till skärande ytan.
- Avsnitt på 40 till 100 ìm tjocklek genom vibratome. Spara avsnitt i en vävnad-kultur fat fyllt med 1X PBS, 0,1% TritonX-100. Ett representativt snitt genom cochlea spiralen visas i figur. 2C.
- Använd pincett för att dissekera bort agarosen från vävnaden. Agarosen kommer inte att tränga in i vävnaden, men kommer bara fastnat på utsidan av innerörat.
- Om så önskas, pool agaros-fri, sektioneras vävnad med hjälp av en pipett med en stor hål öppning för att förhindra överdriven klippning av vävnaden. Om du utför flera antikroppar fläckar på flera olika vävnader, kan sektioner arrangeras i ett 16 - eller 24-och vävnadsodling maträtt.
3. Antikropp färgning vibratome sektioner
Fortsätt med antikroppar fläcken. Process avsnitt i hel-fäste, fritt flytande i lösning. Nedan är ett exempel antikropp färgningsprotokollet för S100 markör för pelare celler i organ Corti, men protokollet kan användas för någon antikropp. Alla tvättar sker vid rumstemperatur om inget annat anges.
- I en multi-och vävnadsodling maträtt, inkubera fritt flytande sektioner med mjuk gunga i PBT (1X PBS, 1% bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100) för 30 minuter.
- Pipettera av gamla lösningen och blockera fritt floating sektioner med mjuk gunga i PBT + normal get serum (50 l NGS / 1 ml PBT) i 30 minuter.
- Pipettera av gamla lösning och tillsätt primära antikroppen späds i PBT + NGS (1:200 utspädning av S100 i PBT + NGS). Inkubera över natten vid 4 ° C med varsam gungning.
- Pipettera av primär antikropp lösning. Tvätta 3X, 5 min. med PBT, sedan 4X, 30 min. med PBT.
- Block med PBT + NGS, 30 min.
- Inkubera med fluorescerande-konjugerade sekundära antikroppar (uppvuxen i get) utspädda i PBT + NGS. Inkubera över natten vid 4 ° C, eller ett par timmar, RT, mild gunga.
- Pipettera av sekundär antikropp lösning. Tvätta 3X, 5 min., Sedan 4X, 30 min. med PBT.
- Pipettera av förra PBT tvätta och ersätta med lämpliga vattenhaltigt monteringsmedium som innehåller en nukleär motfärg.
4. Montering avsnitt om bilder och konfokalmikroskopi
För att förhindra att krossa den tjocka sektioner med täckglas, när du monterar enskilda avsnitten, måste en spacer införas mellan objektglas och täckglas. Nedan finns två alternativa metoder för montering tjocka vibratome avsnitt:
- En spacer kan skapas genom att placera en kant av vakuum fett i en fyrkant runt vävnaden avsnitt. Så när fastställer täckglas kommer kanterna på täckglas tätas med vakuum fett. Tryck ner kanterna på täckglas med tummen för att ordentligt följa den på bilden. Om vakuum fett är snyggt och enhetligt närvarande runt alla kanter täckglas kommer glida tätas tillräckligt för att användas på ett inverterat konfokalmikroskop.
- Alternativt kan en spacer skapas med agaros kromatografi harts av känd maskstorlek (såsom Affi-Gel Blå Gel, Bio-Rad). Pipettera 1 l av kåda på objektglas i de fyra hörnen där täckglas kommer att placeras. Pipettera en vävnad avsnitt och montering media i mitten av de fyra punkter av kåda. Täckglas. Om du använder en inverterad konfokalmikroskop, täta täckglas på objektglas med nagellack.
- Skaffa optiska delar av färgade vibratome skivor med hjälp av konfokalmikroskopi. För att kvantifiera olika celltyper inom organ Corti, få ett z-stack på en definierad steg storlek (mellan 1,5 och 3 mikrometer). Avsnitten bör vara kontraproduktivt färgat med en nukleär färg (steg 3,8). Bilderna kan undersökas på alla datorer skärmen efter konfokala bildsamling. Cellerna kan räknas manuellt kan observera utseendet och försvinnandet av kärnor som bilder granskas sekventiellt genom z-stack.
5. Representativa resultat:
En representant konfokala z-stacken genom en vibratome avsnitt, färgas för S100 protein, som finns i pelaren och Deiters "celler, och counterstained med en nukleär färg (Fig. 3A-F). Varje panel är konfokala bilden tas vid 3 ìm-steg, med panel A skall konfokala bilden erhållit närmast ytan av vibratome avsnitt och panel F den konfokala bilden erhållit mest internt inom vibratome avsnitt. Morfologi av organ Corti verkar minimalt störs. Framför allt är det cytoplasmiska förlängningar av pelare cellerna inte bruten. Genom att notera utseende och försvinnandet av pelare cellkärnor genom z-stack (Fig. 3a-3f), kan både inre och yttre pelare mobilnummer räknas (se numrering, Fig. 3A -. F). På grund av litet antal av varje celltyp per konfokala bild, kan denna metod användas för att räkna de flesta typer av celler i organ Corti.
Figur 1. Intakt, 15-veckor gamla, inneslutet vuxna inre öron i öron kapseln. (A) rätten öron kapsel (parentes) innesluten i skallen, sedd från en utkiksplats inne i huvudet, efter avlägsnande av hjärnan. Främre är till höger. (B) Intakt, 15-veckor gamla inre öron efter dissektion av skallen. Laterala ytan på vänster innerörat blir synlig; mediala ytan av höger inneröra är synlig. Etiketter visar placeringen av den främre halvcirkelformad kanal (ASC), CO (snäckan), och OW (ovala fönstret).
Figur 2. (A) Hela innerörat från en 15-veckors gamla vuxna, inbäddade i agaros i centrum av en Peel-Away mögel. Avsedd plan avsnitt anges. (B) Närbild bild av en 15-veckor gamla, hela innerörat innan inbäddning. En del av det omgivande benet har dissekerat borta så membranös labyrinten kan ett ses mer tydligt. Den laterala halvrunda kanal (LSC), främre halvcirkelformad kanal (ASC) och cochlea (CO) spåras (vit kurvor). Den basala tur hörselsnäckan (pilspetsen) och avsedd plan avsnitt (streckad linje) visas. (C) representant CrosS-sektionen genom snäckan. I ett tvärsnitt genom cochlea kanalen, är det organ i Corti (oC) boxed är stria vascularis (sv) inom parentes, och Reissner membran (Rm) är indicerat.
Figur 3. Orgeln i Corti i en vildtyp mus vid P21. (AF) Sekventiell konfokala serien, på en 3 ìm steg-storlek, genom en S100 antikropp-färgade organ Corti att visualisera pelaren celler och Deiters "celler. Räknar av inre och yttre pelare celler från början till slutet av serien är numrerade. Förkortningar: IHC (inre hårceller), aIHC (intilliggande inre hårceller), OHC (yttre hårceller), PC (pelare cell), DC (Deiters "cell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förfarandet för vibratome snittning, följt av immunohistokemi och konfokala bildhantering möjliggör visualisering av organ Corti med minimal vävnadsskada. Klart, konfokal bilder tagna från interna regioner i vibratome avsnitt visar utmärkt bevarandet av cellulära morfologi som begränsas endast av fixering artefakter. Konfokala bilder som tas nära två cut-ytor av en vibratome avsnitt är ofta omöjlig att skilja från bilder från interna regioner, även om enstaka cellulära störningar, exempelvis avbrott i cytoplasmiska förlängningar av pelare celler observerades (visas inte). Denna metod är enkel, och de stora utrustningar - en vibratome maskin och konfokalmikroskop - är gemensam utrustning poster som är allmänt tillgängliga för de flesta utredare. Dessutom kan denna metod användas för alla antikropp som visar specifik färgning i det organ i Corti. Det är den främsta begränsningen av denna strategi specificitet antikroppar, och ändringar till steg 3 i detta protokoll kan vara nödvändiga för att säkerställa att en viss antikropp kommer att resultera i specifik färgning. Sammanfattningsvis beskriver jag en enkel procedur, som är generaliserbara till en antikropp och säkerställer maximal bevarande och analys av cellulära organisation av organ Corti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Medical College of Wisconsin IACUC.
Acknowledgments
Författaren vill tacka för användning av Barnens Forskningsinstitut Imaging Core för konfokalmikroskopi och Dr Jian Zhang för förslaget att montera delar med agaros pärlor. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag DC010387.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
