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Neuroscience

संवर्धित सीएनएस न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान रीढ़ आकृति विज्ञान के विश्लेषण

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

कई हाल ही के अध्ययन synaptic प्रोटीन मस्तिष्क की विकृतियों के साथ जुड़े में म्यूटेशन की पहचान की है. प्राथमिक सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स वृक्ष के समान रीढ़ morphology और गतिशीलता पर इन रोग से जुड़े प्रोटीन के प्रभाव की जांच करने में महान लचीलापन प्रदान करते हैं.

Abstract

मस्तिष्क के भीतर उत्तेजक कनेक्शन के बहुमत के वृक्ष के समान spines साइटों रहे हैं, और synapses के बाद synaptic डिब्बे फार्म. इन संरचनाओं actin में धनी होते हैं और अत्यधिक गतिशील होना दिखाया गया है. शास्त्रीय Hebbian के रूप में अच्छी तरह के रूप में plasticity के neuromodulatory संकेतों के जवाब में, वृक्ष के समान spines के आकार और संख्या है, जो तंत्रिका सर्किट के शोधन और प्रसंस्करण और मस्तिष्क के भीतर सूचना के भंडारण के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है बदल सकते हैं. वृक्ष के समान spines के भीतर, प्रोटीन का एक जटिल नेटवर्क actin के वृक्ष के समान रीढ़ morphology और संख्या के नियंत्रण के लिए अनुमति cyctoskeleton के साथ कोशिकी संकेतों लिंक. Neuropathological अध्ययन दिखा दिया है कि रोग राज्यों के एक नंबर, autism स्पेक्ट्रम विकारों के लिए एक प्रकार का पागलपन से लेकर, असामान्य वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी या संख्याएँ प्रदर्शित. इसके अलावा, हाल ही में आनुवंशिक अध्ययन कई जीन है कि synaptic प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना में परिवर्तन की पहचान की है, सुझाव है कि इन प्रोटीनों न्यायपालिका रीढ़ plasticity है कि, भाग में, इन विकारों के pathophysiology आबाद करने के लिए योगदान कर सकते हैं करने के लिए अग्रणी. आदेश में वृक्ष के समान रीढ़ morphologies / संख्या को नियंत्रित करने में इन प्रोटीनों की संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए, सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स के उपयोग के कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, इस प्रणाली तय कोशिकाओं में वृक्ष के समान spines के उच्च संकल्प इमेजिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीवित कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. दूसरे, इन विट्रो प्रणाली में इस उत्परिवर्ती प्रोटीन, shRNA constructs द्वारा पछाड़ना या औषधीय उपचार की अभिव्यक्ति के द्वारा प्रोटीन समारोह के आसान हेरफेर के लिए अनुमति देता है. इन तकनीकों में शोधकर्ताओं रोग जुड़े प्रोटीन की भूमिका काटना और भविष्यवाणी करने के लिए कैसे इन प्रोटीनों की म्यूटेशनों vivo में कार्य कर सकते हैं शुरू करने के लिए अनुमति देते हैं.

Protocol

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यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी प्राथमिक सभ्य प्रणाली में वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी और आकारिकी गतिशीलता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

1. प्राथमिक cortical न्यूरॉन संस्कृतियों की तैयारी

  1. उच्च घनत्व cortical न्यूरॉन संस्कृतियों Sprague-Dawley चूहे E18 glia वातानुकूलित सीरम मुक्त 1-2 मध्यम में भ्रूण और संस्कृति से तैयार करें.
  2. ACUC प्रक्रियाओं के अनुसार गर्भवती चूहा (E18) euthanize, जल्दी गर्भाशय निकालना (में यह भ्रूण के साथ) और एक 100 मिमी बर्फ पर पेट्री डिश में जगह.
  3. खुला गर्भाशय और amniotic झिल्ली कट, गर्दन द्वारा पकड़ भ्रूण (बरकरार गर्भनाल) एक संदंश के साथ, छील खोपड़ी को आगे से पीछे से एक और संदंश का उपयोग, और से वापस सामने करने के लिए midline के साथ एक तेज टिप संदंश के साथ खुला खोपड़ी भट्ठा.
  4. और 2 मिलीग्राम + मुक्त HBSS - एक घुमावदार (एक स्कूप गति में) संदंश और एक 100 मिमी पेट्री 10 मिलीलीटर ठंडा सीए 2 युक्त पकवान में जगह + के साथ पूरे मस्तिष्क निकालें .
  5. एक संदंश, दूसरे संदंश के साथ अलग गोलार्द्धों, हिप्पोकैम्पस और striatum हटायें, अलग प्रांतस्था और ध्यान meninges से cortical ऊतक बंद छील के साथ मस्तिष्क स्टेम पकड़ो.
  6. पूल cortical ऊतकों dissected, संक्षेप कीमा और एक 15 मिलीलीटर 4 मिलीलीटर युक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरण पूर्व गर्म trypsin / EDTA (0.25% trypsin, 0.53 मिमी EDTA, SH30042.01 HyClone से HyQ trypsin); के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते ~~ 15 मिनट, एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक के साथ / trypsin EDTA जितना संभव निकालने के लिए, 1.5 मिलीलीटर neuronal मध्यम जोड़ने.
  7. पचा ऊतकों के रूप में एक 5 मिलीलीटर विंदुक (~ 10 स्ट्रोक, हवाई बुलबुले बनाने से बचने के) के साथ कोमल pipetting द्वारा यंत्रवत् अलग कर देना, 2 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें, 30 सेकंड के लिए व्यवस्थित, तो एक 15 मिलीलीटर की ट्यूब में 2 मिलीलीटर सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
  8. दोहराएँ 6 दो बार कदम (~ 15 मिनट कुल के बारे में लेना चाहिए).
  9. 200g में 2 मिनट के लिए सेल निलंबन स्पिन.
  10. निकालें सतह पर तैरनेवाला (5 मिलीलीटर विंदुक के साथ - वैक्यूम aspirate नहीं), resuspend सेल गोली 5 मिलीग्राम और 40 सुक्ष्ममापी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल झरनी के माध्यम से मध्यम फिल्टर में, नीचे के खिलाफ उंगलियों से flipping द्वारा गोली ढीला.
  11. 10 μl सेल निलंबन और 10 μl trypan नीले मिक्स, hematocytometer साथ व्यवहार्य कोशिकाओं (trypan नीले अपवर्जन) की गणना.
  12. ठेठ उपज: 5 x 10 6 कोशिकाओं / मस्तिष्क, चढ़ाना के लिए वांछित घनत्व (जैसे 6 x 10 कोशिकाओं 1.5 / एमएल) के लिए पतला .
  13. (कुल मात्रा शून्य मात्रा चढ़ाना) 18 मिमी दौर या 22x22 मिमी वर्ग coverslips युक्त, पाली-D-lysine के साथ लेपित (चढ़ाना मीडिया (stretomycin Neurobasal मीडिया 2 B27%, 0.5 मिमी glutamine और 1% पेनिसिलिन के साथ पूरक) के साथ संस्कृति प्लेटों भरें 0.2 मिलीग्राम / एमएल, सिग्मा) 0.1 एम borate बफर (3.1g / एल बोरिक एसिड, 4.8g / एल बोरेक्रस, 8.5 पीएच, फिल्टर निष्फल) में भंग, 12 अच्छी तरह से थाली = 0.8 मिलीलीटर अच्छी तरह से / के लिए कुल मात्रा.
  14. अगले चरण में उपलब्ध कराई गई घनत्व प्लेट न्यूरॉन्स, कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने के कोमल कमाल / दोहन करके.
  15. , प्लेटें 6 अच्छी तरह से (3 उच्च घनत्व 5 x 10 / अच्छी तरह = 2 857/mm) (मध्य घनत्व 1.5 x 10 5 / अच्छी तरह = 430/mm 2): 12-अच्छी तरह से (2 3.5cm अच्छी तरह /) प्लेटों के लिए (9.6cm 2 अच्छी तरह /): (9 उच्च घनत्व x 5 / अच्छी तरह = 2 624/mm 10) (4.5 मध्य घनत्व x 10 2 5 / अच्छी तरह = 312/mm).
  16. एक घंटे के चढ़ाना के बाद, ताजा मध्यम (: stretomycin Neurobasal 2 B27%, 0.5 मिमी glutamine और 1% पेनिसिलिन के साथ पूरक मीडिया) के साथ सभी मध्यम जगह. किसी भी समय पर नहीं होने कोशिकाओं शुष्क करने के लिए सावधान रहना, क्योंकि सेल मलबे को अच्छी तरह से, भंवर प्लेटें पहले मलबे को हटाने की सुविधा के बीच में व्यवस्थित करते हैं.
  17. बदलें साढ़े मध्यम उसके बाद हर हफ्ते में दो बार (एक अच्छी तरह से ~ 300-350 μl हटाने, और जोड़ने μl 400 एक अच्छी तरह से ताजा खिला मध्यम गर्म).
    वैकल्पिक: 4 DIV में 200 सुक्ष्ममापी डी, एल अमीनो - phosphonovalerate मध्यम खिला एसिड (डी, एल APV, चढ़ाई वैज्ञानिक) जोड़ने, Neurobasal 2 B27%, 0.5 मिमी glutamine और 1% पेनिसिलिन के साथ पूरक मध्यम संस्कृति में न्यूरॉन्स: stretomycin + 200 APV सुक्ष्ममापी.
  18. इन विट्रो (DIV) में 24-28 दिनों के लिए cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों के रूप में, इस समय बिंदु वृक्ष के समान spines पर आगे बढ़ें एक परिपक्व आकारिकी प्रदर्शन (यानी वे पूर्व synaptic भागीदारों के साथ कनेक्शन फार्म, और एक सिर की तरह स्पष्ट संरचना है ) और 3-4 कृन्तकों में जल्दी किशोरावस्था के अनुरूप. 18 मिमी दौर coverslips पर हो न्यूरॉन्स और tranfected किया जा सकता है है इलाज pharmacologically जा रहा है तय है, immunostained, और एक confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged और वृक्ष के समान spines के विस्तृत morphometeric विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता से पहले. कक्ष 22x22 मिमी वर्ग coverslips पर हो तो समय चूक इमेजिंग प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता वृक्ष के समान रीढ़ की गतिशीलता की जांच कर सकते हैं.

2. प्राथमिक सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स के अभिकर्मक

  1. Cortical न्यूरॉन्स 2000 Lipofectamine (Invitrogen) 5 का उपयोग प्रयोगों से पहले 2-3 दिनों ट्रांसफ़ेक्ट हैं .
  2. "ज DMEM" तैयार DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम के पीएच संतुलन करके, कोई glutamine,Invitrogen 11965-092) 10 मिमी बाँझ HEPES के साथ (4 - (2 hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic एसिड, MediaTech Cellgro 25-060-CI, 1M, पीएच 7) . 37 सी. सेंटीग्रेड तक गर्म
  3. 600/1000 (18/22x22 मिमी coverslips) μl पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) नए एंटीबायोटिक मुक्त (Neurobasal मध्यम, B27, 0.5 मिमी glutamine) मध्यम, और एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते कोशिकाओं पूरक, coverslips स्थानांतरण के साथ 5% 30 मिनट के लिए सीओ 2 .
  4. ज DMEM 50 μl, प्रत्येक coverslip के लिए डीएनए के नामित राशि (1-2 μg निर्माण पर निर्भर करता है एक या एकाधिक डीएनए plasmids, जैसे सेल आकारिकी और टैग उत्परिवर्ती प्रोटीन synaptic रूपरेखा pEGFP), जोड़ने के 5 के लिए खड़े की अनुमति मिनट.
  5. प्रत्येक coverslip के लिए, 50 μl घंटे DMEM 4 / 6 (18/22x22 मिमी coverslips) μl 2000 Lipofectamine जोड़ने, 5 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति.
  6. 1.3 और 1.4 कदम से अच्छी तरह से ट्यूबों मिश्रण, humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर, 5% सीओ 2 के साथ पूरक में कम से कम 20 मिनट के लिए रख . परिसर में 6 घंटे के लिए निर्माता के अनुसार स्थिर है.
  7. कदम dropwise 1.5 से कोशिकाओं को Lipofectamine 2000/DNA मिश्रण जोड़ें. Humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर, 5% सीओ 2, 4 घंटे के लिए के साथ पूरक कोशिकाओं को सेते हैं.
  8. कदम 1.1 (300/600 μl), पूर्व गर्म के साथ पूरक से खिला मध्यम का प्रयोग (37 डिग्री सेल्सियस) 400/800 μl ताजा खिला मध्यम (18/22x22 मिमी coverslips). बाद कदम 1.6, पुराने और नए सिरे से खिला मध्यम युक्त माध्यम में हस्तांतरण coverslips.
  9. Plasmids की अभिव्यक्ति 2-3 दिनों के लिए जारी रखने के लिए अनुमति दें.

3. प्राथमिक सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स के उपचार में 18 मिमी coverslips पर हो

न्यूरॉन्स 18 मिमी coverslips, पहले ट्रांसफ़ेक्ट पर हो, भी आसानी से औषधीय उपचार करने के लिए अधीन किया जा सकता है.

  1. ACSF (, NaCl: 125, KCl 2.5, 26.2 3 NaHCO, एक नाह 2 पीओ 4, 11 ग्लूकोज, 5 HEPES, 2.5 2 CaCl और 200 सुक्ष्ममापी के साथ 1.25 2 MgCl डी, एल APV मिमी में कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव) तैयार करें. 37 सी. सेंटीग्रेड तक गर्म 30-60 मिनट के लिए 900 μl गर्म ACSF में पूर्व सेते coverslips. पूर्व inhibitors के साथ इलाज इस समय के दौरान किया जा सकता है है.
  2. शेयर समाधान से एक 10X काम एकाग्रता के लिए औषधीय एजेंटों / वाहन तैयार समाधान के ACSF में dilutions प्रदर्शन. ध्यान से कोशिकाओं (μl 1000 के अंतिम मात्रा 1X एजेंट / वाहन के अंतिम एकाग्रता के लिए) एजेंट / वाहन जोड़ने के लिए, और उपचार पर वांछित 5 समय के लिए ले जाने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. के बाद उपचार (ओं), कोशिकाओं और immunocytohistochemistry के लिए प्रक्रिया तय कर लो.

4. फिक्सेशन और immunocytohistochemistry (आईसीसी)

  1. / कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए या तो 4% formaldehyde / कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% sucrose पीबीएस (800 μl) में न्यूरॉन्स फिक्स, या 4% formaldehyde में 4% sucrose (800 μl) Pbs, पीबीएस में 2X washes के द्वारा पीछा किया , 4 बजे 10 मिनट पूर्व ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल (800 μl) के साथ ठीक डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा किया मेथनॉल निर्धारण denaturing और प्रोटीन precipitating द्वारा काम करता है. इस प्रक्रिया के बाद synaptic घनत्व (PSD) में प्रोटीन का एक अनमास्किंग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिपिड युक्त क्षेत्रों में होता है.
  2. 10 मिनट प्रत्येक के लिए (800 μl) Pbs, 2x, में coverslips धो लें.
  3. Permeabilize और कोशिकाओं पीबीएस कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2% सामान्य बकरी सीरम और 0.1% Triton एक्स 100 (800 μl) को नियंत्रित करने में एक साथ ब्लॉक.
  4. पीबीएस उपयुक्त एकाग्रता में 2% सामान्य सीरम बकरी युक्त करने के लिए प्राथमिक GFP, मिलान टैग के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी (उनकी, myc, V5 उदाहरण के लिए) या अंतर्जात प्रोटीन, जोड़ें. एक 15 सेमी पकवान ले लो, यह वर्गों में विभाजित, उन्हें संख्या, और parafilm साथ कवर. कोशिकाओं नीचे का सामना करना पड़ के साथ parafilm 80 एंटीबॉडी और ब्लॉक मिश्रण के μl (प्रति वर्ग एक बूंद), और एंटीबॉडी / ब्लॉक मिश्रण करने के लिए जगह coverslip के बारे में जोड़ें. 4 oC पर रातोंरात incubated.
  5. पीबीएस में coverslips, 15 मिनट प्रत्येक के लिए 3x धो लें.
  6. पीबीएस उपयुक्त एकाग्रता में 2% सामान्य बकरी सीरम को नियंत्रित करने में Alexa संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen) पतला. 3.4 चरण में के रूप में एक ही तरीके से माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं, 1 घंटा, प्रकाश से रक्षा के लिए कमरे के तापमान पर.
  7. धो PBS में आगे 3x 15 मिनट coverslips है.
  8. मानक खुर्दबीन पर माउंट coverslips गोल्ड antifade अभिकर्मक (Invitrogen) लम्बा का उपयोग कर स्लाइड.

5. रीढ़ morphologies के मात्रात्मक विश्लेषण

हम एकल और डबल से सना हुआ (कोशिकाओं GFP और ब्याज का निर्माण या अंतर्जात प्रोटीन व्यक्त) न्यूरॉन्स एक Zeiss LSM5 पास्कल confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के confocal छवियों को प्राप्त करते हैं. के लिए सभी इमेजिंग प्रयोगों स्वस्थ पिरामिड imaged और बाद के विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा न्यूरॉन्स का चयन करें. स्वस्थ न्यूरॉन्स कोशिकाओं है कि blebbing या उपचार या निर्धारण करने के लिए कारण संकट का कोई संकेत प्रदर्शित नहीं है कि एक पूर्ण, निर्बाध वृक्ष के समान कुंज होते हैं.

  1. न्यूरॉन्स की छवियों को एक एनए के साथ एक 63x उद्देश्य तेल विसर्जन (Zeiss) का उपयोग मोल (संख्या1.4 के erical) एपर्चर, 3-8 छवियों की जेड श्रृंखला के रूप में 4 बार 0.37 सुक्ष्ममापी अंतराल, अनुभाग प्रति 2.5 सेकंड स्कैन गति पर 1024x1024 पिक्सेल संकल्प के साथ, औसत. संस्कृतियों है कि सीधे तुलना में किया जा रहे हैं के लिए एक ही अधिग्रहण के मानकों के साथ imaged किया जा जरूरत है. 10-20 न्यूरॉन्स / हालत 3-5 अलग प्रयोगों, और न्यूरॉन प्रति 100 सुक्ष्ममापी के 2 dendrites से प्रत्येक का विश्लेषण किया जाना चाहिए. प्रयोगों अंधा और बहन संस्कृतियों पर किया जाना चाहिए. डिटेक्टर लाभ समायोजित और dendrite, जैसे कि रीढ़ की हड्डी में फ्लोरोसेंट संकेत और पृष्ठभूमि के बीच संक्रमण तेज है, सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति के चारों ओर एक प्रभामंडल बनाने के बिना भी dimly फ्लोरोसेंट पतली कांटा शामिल ऑफसेट. अधिग्रहण मापदंडों ही प्रयोग के भीतर सभी स्कैन के लिए एक ही रखें.
  2. GFP छवियों एक argon लेजर लाइन, 488 एनएम पर रोमांचक का उपयोग कर और 505-530 एनएम बैंड पास फिल्टर के साथ इकट्ठा हासिल किया जा सकता है. Overexpressed प्रोटीन या अंतर्जात प्रोटीन की छवियाँ एक HeNe 543 एनएम पर रोमांचक लेजर का उपयोग एक Alexa 568 माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen) एकत्र किया जा सकता है है, और 560 एनएम पर एक लंबी पास फिल्टर का उपयोग कर इकट्ठा करने के साथ immunostained. एक न्यूनतम करने के लिए लेजर शक्तियों रखें नमूनों की photobleaching से बचने.
  3. MetaMorph (आण्विक डिवाइसेज, Inc) सॉफ्टवेयर, दो आयामी पृष्ठभूमि घटाया, जेड श्रृंखला छवियों की अधिकतम प्रक्षेपण पुनर्निर्माण morphometric विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए उपयोग किया जाता है का उपयोग करना. वृक्ष के समान spines के morphologies जांच पतन छवियों Z श्रृंखला, आवश्यक दूरी जांचना, और तब सीमा के एक तरीके में सभी कांटा भी शामिल है कि सीमा कांटा की रूपरेखा (छवि 2E, एफ) के लिए बिल्कुल मेल खाती है है. माध्यमिक और तृतीयक dendrites (न्यूरॉन प्रति 100 सुक्ष्ममापी की कुल लंबाई) पर केवल कांटा परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए मापा जाना चाहिए, और क्षेत्रों की माप शाखा अंक के बीच किए जाने की जरूरत है. मैन्युअल रूप से प्रत्येक रीढ़ की रूपरेखा इतना है कि यह एक बंद परिधि (छवि 2 जी) हो जाएगा.
  4. रीढ़ की हड्डी की लंबाई, चौड़ाई रीढ़, पार के अनुभागीय क्षेत्र, और वृक्ष के समान रीढ़ घनत्व रैखिक: निम्नलिखित रीढ़ पैरामीटर स्वतः MetaMorph में उपाय. मात्रा का ठहराव के लिए Excel में निर्यात वृक्ष के समान रीढ़ morphometric मापदंडों करें. छात्र unpaired टी परीक्षण का उपयोग दो समूहों के बीच मतभेद के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए, एक तरह से एनोवा तीन या अधिक समूहों की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है, एकाधिक तुलना के लिए Tukey ख पद अस्थायी द्वारा पीछा किया. सांख्यिकीय विश्लेषण एक्सेल GraphPad, या SPSS में प्रदर्शन किया जा सकता है है. Kolmogorov - Smirnov परीक्षण (केएस परीक्षण) 2,5-6 का उपयोग कर संचयी भूखंडों विश्लेषण.

6. मात्रात्मक immunofluorescence (IF)

विशिष्ट synaptic प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence की मात्रा का ठहराव, एक Alexa 568 माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen) का उपयोग करते हुए कल्पना, क्लस्टरिंग और अंतर्जात synaptic प्रोटीन की synaptic स्थानीयकरण में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. ऊपर वर्णित के रूप में एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवियों मोल. एक argon और एक HeNE लेजर (ऊपर देखें) डबल दाग छवि न्यूरॉन्स के लिए प्रयोग करें. केवल छवि स्वस्थ पिरामिड न्यूरॉन्स कि संकट के किसी भी लक्षण प्रदर्शित नहीं करते हैं.
  2. प्रतिदीप्ति तीव्रता माप के लिए, वृक्ष के समान शाफ्ट (छवि 2I, पीले वर्ग) एक "पृष्ठभूमि घटाया" (2J छवि) छवि MetaMorph का उपयोग कर उत्पन्न करने के लिए इसी पृष्ठभूमि घटाना. समान रूप से दहलीज छवियों आसन्न dendrite (छवि 2K) के ऊपर कम से कम दो गुना तीव्रता के साथ समूहों को शामिल करने के लिए. (Dendrites न्यूरॉन प्रति 100 सुक्ष्ममापी) "perimeters" (छवि 2 डी) उपयोगिता और स्वचालित रूप से रैखिक घनत्व (number/100 सुक्ष्ममापी dendrite लंबाई) को मापने, और प्रत्येक synaptic क्लस्टर की एकीकृत तीव्रता (कुल यदि तीव्रता) का उपयोग कर MetaMorph का उपयोग कर के साथ बाह्यरेखा क्षेत्रों 7-9.
  3. एक synaptic प्रोटीन के रिश्तेदार रीढ़ सामग्री को मापने के लिए, पहले GFP छवि thresholding रीढ़ (छवि 2E, एफ) आकारिकी MetaMorph का उपयोग कर का निर्धारण प्रोटीन क्लस्टरिंग द्वारा निर्धारित है. हित के क्षेत्रों है कि केवल अन्य चैनल (छवि 2 जी, एच) में कब्जा कर लिया ब्याज की प्रोटीन की छवियों को कांटा शामिल स्थानांतरण. प्रोटीन समूहों की संख्या की गणना और कांटा अंदर immunofluorescence एकीकृत तीव्रता को मापने के लिए रीढ़ की हड्डी प्रोटीन सामग्री का आकलन.
  4. निर्यात यदि Excel में synaptic प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए पैरामीटर. छात्र unpaired टी परीक्षण का उपयोग दो समूहों के बीच मतभेद के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए, एक तरह से एनोवा तीन या अधिक समूहों की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है, एकाधिक तुलना के लिए Tukey ख पद अस्थायी द्वारा पीछा किया. सांख्यिकीय विश्लेषण एक्सेल GraphPad, या SPSS में प्रदर्शन किया जा सकता है है.

7. समय चूक इमेजिंग

रीढ़ की गतिशीलता में या व्यक्तिगत कांटा की रीढ़ आकारिकी में रोग जुड़े synaptic प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में परिवर्तन, जैसे वृक्ष के समान रीढ़ की गतिशीलता, जांच, प्राथमिक cortical 24-28 DIV के लिए 22x22 मिमी वर्ग coverslips पर सभ्य न्यूरॉन्स बढ़ने. Neurons GFP / mCherry के साथ डबल - ट्रांसफ़ेक्ट सेल आकारिकी को परिभाषित करने के लिए, और fluorescently उत्परिवर्ती synaptic प्रोटीन टैग के रूप में ऊपर वर्णित किया जा सकता है. सभी इमेजिंग प्रयोगों के लिए, स्वस्थ पिरामिड दोनों constructs व्यक्त न्यूरॉन्स का चयन, इन कोशिकाओं औषधीय उपचार के अधीन किया जा सकता है है, imaged और बाद के विश्लेषण में उपयोग किया जाता है.

  1. पूर्व सेते 1.5 मिलीलीटर ACSF में 22x22 मिमी coverslips पर एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30-60 मिनट के लिए हो न्यूरॉन्स 5% सीओ 2 के साथ पूरक. कोशिकाओं को भी इस स्तर पर के रूप में अच्छी तरह से दवाओं के साथ कर सकते हैं पूर्व इलाज किया जा है. निम्नलिखित pre-incubation/treatment, एक संलग्न इमेजिंग मंच चैम्बर (वार्नर, आर सी 30HV) करने के लिए स्थानांतरण की कोशिकाओं. 37 के एक तापमान बनाए रखें ° एक नियंत्रक इकाई के साथ सी (वार्नर, टीसी-344B) 2,5-6,10.
  2. रीढ़ की गतिशीलता, दवा या इमेजिंग कक्ष में कोशिकाओं स्थानांतरित करने से पहले 30-60 मिनट के लिए वाहन के साथ पूर्व का इलाज कोशिकाओं की जांच करने के लिए. यह दवा / वाहन के लिए पर्याप्त समय न्यूरॉन के भीतर दूसरा दूत रास्ते आरंभ करने के लिए अनुमति देता है. 2X औसत के साथ 10 मिनट के अंतराल पर एक 63X उद्देश्य (Ziess, 1.4 एनए) के माध्यम से छवियों का मोल. समग्र पिरामिड morphologies व्यक्त GFP / mCherry है या फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के साथ स्वस्थ न्यूरॉन्स चुनें. Photodamage कम से कम करने के लिए, 0.5-1% के लिए लेजर शक्ति को कम. वाहन दवा इलाज कोशिकाओं की तुलना में इलाज की तुलना में रीढ़ की गतिशीलता में परिवर्तन का प्रदर्शन होगा. वैकल्पिक रूप से, रीढ़ की गतिशीलता से पहले और बाद में इलाज मूल्यांकन किया जा सकता है दवा / वाहन के छिड़काव (नीचे देखें) के द्वारा. प्रत्येक समय बिंदु पर Z-ढेर लीजिए.
  3. वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी में समय पर परिवर्तन, 1 घंटे के लिए छवि coverslips ट्रैक करने के लिए आकारिकी में आधारभूत परिवर्तन की स्थापना की. इस समय, इमेजिंग चेंबर में दवा / वाहन perfuse एक और घंटे के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (Gilson, Minipuls 3), और छवि न्यूरॉन का उपयोग. Confocal एक 63X तेल (Ziess, 1.4 एनए) 2X प्रत्येक 10 मिनट के औसत के साथ उद्देश्य, का उपयोग Z-ढेर मोल. 0.5-1% लेसर शक्ति को कम करने के लिए photodamage कम से कम.
  4. प्रत्येक इमेजिंग सत्र के अंत में, photodamage का पता लगाने स्तर पर पूरे न्यूरॉन के एक 20X छवि प्राप्त करते हैं. किसी भी संकट के संकेत प्रदर्शन न्यूरॉन्स मात्रा का ठहराव से लोप होना चाहिए. Z-प्रत्येक समय बिंदु के ढेर Metamorph में 2D अनुमानों में ढह जाना चाहिए. छवि गुणवत्ता और अभिकर्मक के स्तर पर निर्भर करता है, एक औसत से गुजारें फिल्टर या पृष्ठभूमि घटाव Metamorph में लागू किया जा सकता है विश्लेषण के लिए स्पष्ट छवियों का उत्पादन.
  5. Morphing रीढ़ और गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, शुरुआत, मध्य और 100 मिनट इमेजिंग सत्र के अंत में ले लिया छवियों रंग कोडित किया जाना चाहिए और MetaMorph में मढ़ा. सेल प्रति कम से कम 100 dendrite के सुक्ष्ममापी विश्लेषण करने की आवश्यकता है. कुल रीढ़ गतिशीलता गतिशीलता घटनाओं, यानी एक्सटेंशन, त्याग, morphing सिर या रीढ़ 6,11 संख्या सामान्यीकृत आगे फैलनेवाला गतिशीलता की कुल संख्या अंश के रूप में परिभाषित किया गया है. इस विधि की घटनाओं की आवृत्ति उपाय, उनके magnitudes पर विचार किए बिना, यह घटनाओं के सभी प्रकार के पूल, और समग्र गतिशीलता का एक सामान्य अनुमान है. आगे फैलनेवाला घटना एक नया, एक रीढ़ की हड्डी सिर या वृक्ष के समान शाफ्ट से क्षणिक फलाव की उपस्थिति के रूप में परिभाषित किया गया है. एक तर्क घटना के किसी मौजूदा या क्षणिक एक रीढ़ की हड्डी सिर या वृक्ष के समान शाफ्ट पर स्थित फलाव के लापता होने के रूप में परिभाषित किया गया है. फलाव और विस्तार घटनाओं का योग dendrite की मात्रा निर्धारित है कि क्षेत्र में कांटा की कुल संख्या से विभाजित कर रहे हैं.
  6. नशीली दवाओं के उपचार के जवाब में व्यक्तिगत रीढ़ morphology में परिवर्तन का आकलन करने के लिए, वृक्ष के समान spines के पार के अनुभागीय क्षेत्र, या समय बिंदु -1 (छिड़काव 1 घंटा पहले) घंटे में वृक्ष के समान रीढ़ रैखिक घनत्व को मापने के लिए, तुरंत उपचार पूर्ववर्ती और प्रत्येक समय बिंदु निम्नलिखित पर उपचार. 1 घंटा पहले करने के लिए इलाज के समय बिंदु हर बार बिंदु सामान्यकरें. यह निर्धारित करने के लिए है कि वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी या रैखिक घनत्व में परिवर्तन photodamage कारण नहीं थे, वाहन के साथ perfused न्यूरॉन्स का विश्लेषण. अर्थ में अंतर छात्र unpaired टी परीक्षण या एक नमूना टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.

8. वैकल्पिक दृष्टिकोण और सफलता के लिए और चाबी

  1. हम संवर्धन cortical न्यूरॉन्स डी की उपस्थिति में वर्णित है, एल APV, एक NMDA रिसेप्टर अवरोध करनेवाला परिपक्वता तक 4 DIV (DIV24 28) से. यह नोट किया जाए कि जबकि संवर्धन डी की उपस्थिति में cortical न्यूरॉन्स, एल APV cortical neuronal दीर्घकालिक संस्कृतियों, डी की उपस्थिति के अच्छे स्वास्थ्य को बनाए रखने के लाभ है, एल APV synapse विकास को प्रभावित कर सकते हैं चाहिए. के रूप में एक ऐसी वैकल्पिक विकास, 2,5 एल - APV के अभाव में न्यूरॉन्स के लिए संस्कृति है. जब डी के अभाव में संवर्धन न्यूरॉन्स, एल APV अतिरिक्त ध्यान संस्कृतियों के समग्र स्वास्थ्य के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, के रूप में सेल अत्यधिक सीए 2 की वजह से मौत का एक बढ़ाने का मौका अधिक सक्रिय NMDA रिसेप्टर सक्रियण के माध्यम से + cytotoxicity है.
  2. neuronal इस प्रोटोकॉल में वर्णित संस्कृतियों के लिए तंत्र है कि वृक्ष के समान रीढ़ morphology और dendriti की गतिशीलता को विनियमित करने के लिए प्रासंगिक हैं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैग एक परिपक्व (यानी वे पूर्व synaptic भागीदारों के साथ कनेक्शन फार्म, और एक सिर की तरह स्पष्ट संरचना है) आकारिकी 2,4,5 प्रदर्शित कांटा है. वैकल्पिक रूप से, एक समय पहले बिंदु पर संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए, जैसे DIV11 16, अधिक वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी गठन, जल्दी विकास के दौरान या वृक्ष के समान spines के विनियमन के लिए प्रासंगिक सवाल का पता करने के लिए उपयुक्त हो सकता है.
  3. Confocal माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के लिए एक वैकल्पिक, महामारी प्रतिदीप्ति विस्तृत क्षेत्र का उपयोग करने के लिए इलाज सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स की छवियों को प्राप्त है. उपयुक्त deconvolution एल्गोरिदम के साथ संयोजन में, कांटा की विस्तृत morphometric विश्लेषण निश्चित या जीवित कोशिकाओं में बनाया जा सकता है. इसके अलावा, यह संभव है (ImageJ जैसे वैकल्पिक सॉफ्टवेयर, का उपयोग http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) या (Neuronstudio http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ) जो मुफ्त सॉफ्टवेयर वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी के विश्लेषण के लिए कर रहे हैं.
  4. जब वृक्ष के समान रीढ़ की गतिशीलता की जांच / समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर morphing, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम समय चूक के अंतराल का उपयोग, उदाहरण के लिए 5-10 मिनट, वृक्ष के समान रीढ़ turnover2, 5 की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण प्रदान कर सकता है. कम समय अंतराल भी रीढ़ की हड्डी के और अधिक तेजी से रूपों morphing है कि अब समय अंतराल का उपयोग पता नहीं होता की पहचान हो सकती है का उपयोग करें.
  5. सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स के उपयोग के नुकसान और चिंता है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए की एक संख्या है. सबसे पहले, सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स का उपयोग कर के एक चिंता का विषय है कि वहाँ परिवर्तनशीलता संस्कृतियों है कि वृक्ष के समान रीढ़ घनत्व के रूप में मानकों को प्रभावित कर सकता के बीच हो सकता है. जैसे, यह आवश्यक है कि निम्नलिखित बातों को ध्यान परिवर्तनशीलता के कम से कम राशि सुनिश्चित करने के पालन कर रहे हैं. सबसे पहले, अच्छा संवर्धन प्रथाओं के अलावा संवर्धन मापदंडों और अभिकर्मकों के रूप में संभव के रूप में लगातार रखा जाना चाहिए, यह बहुत संस्कृतियों के बीच परिवर्तनशीलता के स्तर कम हो जाएगा. दूसरे, यह आवश्यक है कि एक ही समय बिंदु पर सभी प्रयोगों प्रदर्शन हो सकता है, और बहन संस्कृतियों पर. इसके अलावा समय - बिंदु है जिस पर प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं ध्यान करने के लिए experimenter उचित सवाल पूछने के लिए अनुमति देते हैं (2 ऊपर बिंदु देखें) के लिए चुना जाना चाहिए. अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि उचित नियंत्रण सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है, ताकि इलाज की स्थिति हमेशा इन आंतरिक नियंत्रण के सापेक्ष जांच कर रहे हैं. यह संस्कृतियों के बीच परिवर्तनशीलता के किसी भी चिंता का विषय निकाल देंगे.
  6. सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स के उपयोग के शोधकर्ताओं ने गंभीर तंत्र है कि वृक्ष के समान रीढ़ morphology और गतिशीलता के नियमन के लिए आवश्यक हैं जांच करने के लिए सक्षम करने में एक शक्तिशाली उपकरण है. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि इन संस्कृतियों vivo स्थिति में नहीं पुनरावृत्ति, और cortical परत संगठन और synapse गठन पर glial कोशिकाओं, के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, के प्रभाव के रूप में घटक ऊपर वर्णित प्रणाली में संबोधित नहीं किया जा सकता है. फिर भी, एक ऐसी प्रणाली के लिए संभावित महत्वपूर्ण वृक्ष के समान रीढ़ morphology और गतिशीलता के विनियमन अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

9. प्रतिनिधि परिणाम

ऊपर वर्णित assays के लिए औषधीय उपचार और / या इन विट्रो में प्रोटीन समारोह के आनुवंशिक जोड़तोड़ के जवाब में वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी, संख्या, और गतिशीलता में परिवर्तन की जांच करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम इन तकनीकों का उपयोग किया है synaptic प्रोटीन है कि वृक्ष के समान spines में actin cytoskeleton को विनियमित की भूमिका विशेषताएँ इस प्रकार उनके 2,9 संरचना में फेरबदल. इसके अलावा, हम इस परख इस्तेमाल किया है निर्धारित करने के लिए कैसे neuromodulators जैसे neuroactive यौगिकों, वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी, संख्या, या आकार में परिवर्तन, या तो अकेले 4,6,10, या गतिविधि पर निर्भर 5 उत्तेजनाओं की उपस्थिति में ड्राइव कर सकते हैं.

1D या 2D मापदंडों के बारे में हमारी माप की सटीकता का अनुमान करने के लिए, हम मापा diameters और ज्ञात आयामों की फ्लोरोसेंट लेटेक्स (ड्यूक वैज्ञानिक) microspheres (0.2, 0.52, 1.0 सुक्ष्ममापी) के क्षेत्रों में अध्ययन के दौरान न्यूरॉन्स के रूप में एक ही परिस्थितियों में मुहिम शुरू की. रीढ़ माप (63X NA 1.4 = उद्देश्य तेल विसर्जन, एल एस एम पास्कल 5) के लिए के रूप में एक ही इमेजिंग शर्तों का उपयोग हम microspheres imaged, और तब अपने diameters और Metamorph क्षेत्रों में, इसी तरह से हमारे रीढ़ की हड्डी माप के साथ निर्धारित. हम तो microspheres की ज्ञात आयामों के साथ वास्तविक माप की तुलना में.

1 आंकड़ा (Fig.1) में ग्राफ से पता चलता है कि हम सही microspheres की 0.52 के क्षेत्रों और 1.0 सुक्ष्ममापी उपाय कर सकता है (क्षेत्रों = 0.21 2 सुक्ष्ममापी और क्रमशः 0.78 2 सुक्ष्ममापी) (मापा मानक विचलन ~ 15%, मानक विचलन निर्धारित निर्माताओं ~ 9%). 0.2 सुक्ष्ममापी microspheres के लिए यहां तक ​​कि हमारे माप वास्तविक आयामों को काफी करीब थे (लेकिन बड़े एसडी के साथ). यह गणना पार्श्व resol के साथ संगत है हमारे confocal खुर्दबीन का उपयोग इस विशेष उद्देश्य के ution, 0.3 सुक्ष्ममापी (समीकरण का उपयोग Δxcf = (0.61/v2) / √ एनए) 12. यह काफी axial संकल्प है, जो confocal और 2-photon माइक्रोस्कोप के लिए गरीब हो जाता है की तुलना में बेहतर है. इसके अलावा, हम 200 एनएम व्यास की हरी फ्लोरोसेंट microspheres (ड्यूक वैज्ञानिक) हो ~ 0.5 सुक्ष्ममापी को मापने के द्वारा प्रयोगात्मक पार्श्व (x / y अक्ष) बात फैल समारोह (पीएसएफ) निर्धारित की. यह आकलन pinhole खुला के साथ प्रदर्शन किया गया था, और इस प्रकार यह माना जा सकता है कि जब pinhole बंद कर दिया है कि पीएसएफ वास्तव में छोटे होगा कर सकते हैं. फिर भी, यह फिर से इंगित करता है कि हम सही 0.196 2 सुक्ष्ममापी (व्यास = 0.5 सुक्ष्ममापी) की तुलना में अधिक से अधिक क्षेत्रों को मापने के लिए कर रहे हैं. वास्तविक पार्श्व पीएसएफ के एक संकेत में दिया जाता है (SVOBODA एट अल.) 13 "0.4 से बहुत कम नहीं सुक्ष्ममापी, जो 0.16 2 सुक्ष्ममापी के एक क्षेत्र में नतीजा होगा" के रूप में. ये तुलना और सैद्धांतिक विचारों से संकेत मिलता है कि हम सही कांटा करने के लिए आकार में इसी प्रकार की वस्तुओं के क्षेत्र को मापने, कर सकते हैं के बाद से कांटा हम मापा आयाम इस संकल्प सीमा (> 0.25 2 सुक्ष्ममापी) से बड़ा थे. इस तरह की स्थितियों के लिए, 13 "क्लासिक morphometric तकनीक मात्रात्मक कर रहे हैं", यह दर्शाता है कि हम मज़बूती से रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों उपाय कर सकते हैं और सही ढंग से अलग उपचार की स्थिति में रीढ़ की हड्डी morphologies की तुलना.

आदेश में सही वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी उपाय करने के लिए, हम DIV ट्रांसफ़ेक्ट 2 दिनों के लिए एक EGFP के निर्माण के साथ 23 cortical न्यूरॉन्स. अभिकर्मक, कोशिकाओं के बाद इलाज के लिए अधीन किया जा सकता है, और तय की और आईसीसी, जहां GFP संकेत dendrite (या न्यूरॉन) के पार भी वितरण के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया है के लिए कार्रवाई की. चित्रा 2 एक cortical GFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन के एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है, एक 63X उद्देश्य (1.4 एनए) (2A छवि) के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged. यह वृक्ष के समान spines (छवि 2B) की विस्तृत उच्च संकल्प छवियों के लिए अनुमति देता है. वृक्ष के समान spines के विस्तृत morphometric विश्लेषण Metamorph कार्यक्रम का उपयोग करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं. यह कार्यक्रम हमें न केवल वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी को मापने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी अंतर्जात प्रोटीन का स्थानीयकरण की जांच. कैसे हम इस विश्लेषण के प्रदर्शन के एक सिंहावलोकन चित्रा 2 (छवि 2C जी) में प्रदान की जाती है.

गतिविधि पर निर्भर उत्तेजनाओं की एक अच्छी तरह से विशेषता प्रभाव वृक्ष के समान रीढ़ 2 आकार में वृद्धि है. चित्रा 3 एक DIV 24 cortical न्यूरॉन व्यक्त EGFP के वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी, एक गतिविधि पर निर्भर उत्तेजना के पहले और बाद में 30 मिनट के लिए imaged के प्रतिनिधि इमेजिंग समय चूक से पता चलता है. यह समय चूक प्रयोग की पुष्टि की है कि गतिविधि पर निर्भर उत्तेजनाओं वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी आकार में वृद्धि (छवि 3A, बी). बेसल रीढ़ गतिशीलता की जांच करने के लिए, छवियों समय बिंदुओं पर 0, 50 और 100 मिनट हासिल किया गया है, और रीढ़ की हड्डी एक्सटेंशन, retractions, आगे फैलनेवाला गतिशीलता और सिर morphing अलग मापा गया और कुल गतिशीलता के रूप में संयुक्त. 3C - डी चित्रा पुष्टि की है कि बेसल की शर्तों के तहत भी cortical न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines गतिशीलता के कुछ स्तर प्रदर्शन.

चित्रा 1
चित्र 1. फ्लोरोसेंट microspheres त्रुटि. सलाखों के मापा और वास्तविक क्षेत्रों की तुलना में मापा क्षेत्रों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. 0.2 सुक्ष्ममापी की microspheres की छवियाँ 0.52 सुक्ष्ममापी और एक सुक्ष्ममापी. स्केल बार = 5 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 2
चित्र 2. रीढ़ आकारिकी और यदि मात्रा का ठहराव. DIV EGFP 25-व्यक्त सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन बी हाई magnifications ठेठ वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी cortical न्यूरॉन्स पर पाया. सी. EGFP और अंतर्जात (GluR1) प्रोटीन उपरिशायी. डी. संक्षिप्त एक EGFP ट्रांसफ़ेक्ट पिरामिड Z श्रृंखला के छवि सेल dendrite, शाफ्ट और कांटा के बीच विभाजन मैन्युअल रूप से पता लगाया है ई. भिन्न, पता लगाया एफ - हाथ superthreshold क्षेत्रों तो Metamorph द्वारा रेखांकित कर रहे हैं और मात्रा निर्धारित करने के लिए रीढ़ की हड्डी की लंबाई, चौड़ाई और पार के अनुभागीय क्षेत्र का निर्धारण किया जाता न्यूरॉन्स जी क्षेत्र निर्धारित किया. Metamorph द्वारा कांटा करने के लिए अनुरूप एच. रीढ़ रूपरेखा लाल चैनल (अंतर्जात प्रोटीन) छवि के लिए रीढ़ की हड्डी विशिष्ट संकेत यों को हस्तांतरित किया जाएगा. इंद्रकुमार रिसेप्टर या synaptic प्रोटीन क्लस्टर यों अगर, जेड श्रृंखला के प्रक्षेपण छवियों का उपयोग किया जाता है. मैं वृक्ष के समान शाफ्ट पृष्ठभूमि IF (पीले वर्ग) के लिए एक "पृष्ठभूमि घटाया" छवि उत्पन्न करने के लिए subtracted है जे इस छवि को तो thresholded है और प्रोग्राम स्वचालित रूप से क्लस्टर क्षेत्र, रैखिक घनत्व, और कुल ग्रे मूल्य (यदि तीव्रता) लालकृष्ण उपाय एच. स्केल सलाखों, A = 15 सुक्ष्ममापी से Thresholded छवि, बी = 1 सुक्ष्ममापी.

"Alt =" 3 / चित्रा "> जी
चित्र 3. गतिविधि पर निर्भर रीढ़ morphology में परिवर्तन, और वृक्ष के समान spines के बेसल गतिशीलता. ए के पहले और बाद में एक गतिविधि पर निर्भर उत्तेजना के अलावा समय चूक एक प्रतिनिधि वृक्ष के समान रीढ़ की इमेजिंग . गतिविधि पर निर्भर उत्तेजनाओं ACSF ASCF से प्रयोगात्मक मीडिया Mg2 + APV और युक्त Mg2 + APV और बिना, स्विचन लेकिन 10 सुक्ष्ममापी ग्लाइसिन वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी क्षेत्र के बी मात्रा (आकार), -30 मिनट का समय बिंदु (30 करने के लिए सामान्यीकृत युक्त द्वारा प्रेरित किया गया छिड़काव के लिए पहले मिनट) सी. वृक्ष के समान रीढ़ गतिशीलता के 0, 50 और 100 मिनट समय अंक के प्रतिनिधि छवियाँ. शीर्ष छवियों 0 (लाल) के उपरिशायी, 50 (हरा) और 100 (नीला) मिनट समय अंक से पता चलता है जबकि इस चित्र के नीचे हर बार बिंदु अलग कर रहे हैं. Asterisk अर्थ रीढ़ विस्तार, सफेद तीर रीढ़ त्याग का अर्थ, हरी तीर सिर आगे फैलनेवाला गतिशीलता अर्थ, खुले पीले तीर सिर रीढ़ सिर morphing अर्थ डी. वृक्ष के समान रीढ़ गतिशीलता मापदंडों की मात्रा और कुल गतिशीलता ई. cortical न्यूरॉन्स की 20X छवि EGFP निम्नलिखित इमेजिंग व्यक्त . सेल के स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए सत्र.

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Discussion

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तकनीक वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी, रैखिक और या तो निश्चित या जीने प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स में घनत्व गतिशीलता की विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित बाद synaptic तंत्र है कि neuropathologies करने के लिए योगदान कर सकते हैं के प्रभाव को समझने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. एक समान दृष्टिकोण रीढ़ आकारिकी या किसी भी काँटेदार न्यूरॉन में गतिशीलता hippocampal पिरामिड, Purkinje, या मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स सहित, यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल synaptic प्रोटीन और / या वृक्ष के समान spines पर औषधीय उपचार के प्रभाव के मौलिक गुणों को देखो अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, यह अंतर्जात synaptic पाड़ प्रोटीन से लेकर रिसेप्टर्स ग्लूटामेट प्रोटीन के स्थानीयकरण में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह न केवल तय कांटा के विस्तृत morphometric विश्लेषण की अनुमति देता है, लेकिन यह भी synaptic प्रोटीन या वृक्ष के समान रीढ़ की गतिशीलता पर औषधीय उपचार के प्रभाव की माप. ये समय चूक इमेजिंग तकनीक भी प्रोटीन की तस्करी की जांच करने के लिए संशोधित कर सकते हैं, के साथ या बिना एक साथ वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी की जांच हो.

वृक्ष के समान रीढ़ morphology और गतिशीलता का विस्तृत विश्लेषण उत्परिवर्ती synaptic प्रोटीन की संभावित प्रभाव की जांच के लिए एक अनिवार्य उपकरण है, और इन रोग जुड़े synaptic प्रोटीन में म्यूटेशनों synapse संरचना और समारोह को कैसे प्रभावित कर सकता है, इस तरह के विकारों की एक संख्या के pathophysiology के लिए योगदान मस्तिष्क.

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Disclosures

इस काम का उत्पादन MetaMorph (आण्विक डिवाइसेज, Inc) द्वारा समर्थित किया गया था.

Acknowledgments

हम सावधान संपादन के लिए केली जोन्स धन्यवाद. अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन Postdoctoral फैलोशिप (डीपीएस); यह काम NIH अनुदान R01MH 071316, अल्जाइमर एसोसिएशन, एक प्रकार का पागलपन और अवसाद (NARSAD) पर अनुसंधान के लिए नेशनल एलायंस, और Autism अनुसंधान के लिए नेशनल एलायंस (NAAR) (पीपी) द्वारा समर्थित किया गया अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन predoctoral फैलोशिप (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

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References

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संवर्धित सीएनएस न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान रीढ़ आकृति विज्ञान के विश्लेषण
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Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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