Summary
많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.
Abstract
돌기 쪽이은 뇌 내에서 흥분성의 연결의 대부분의 사이트이며, 시냅스의 포스트 시냅스 칸막이를 형성하고 있습니다. 이러한 구조는 굴지 풍부하고 매우 동적으로 표시되었습니다. 고전 헵의 소성뿐만 아니라 neuromodulatory 신호에 대응하여, 돌기 쪽이은 모양과 신경 회로의 상세 및 뇌 내의 정보의 처리 및 저장을위한 중요한 것으로 생각됩니다 번호를 변경할 수 있습니다. 돌기 쪽이 내에서 단백질의 복잡한 네트워크 돌기 척추의 형태 및 숫자의 제어를위한 허용 굴지의 cyctoskeleton와 세포외 신호를 연결합니다. Neuropathological 연구는 정신 분열증 자폐증 스펙트럼 장애에 이르기까지 질병 상태의 숫자가, 비정상적인 척추 돌기 형태 또는 숫자를 표시 증명하고있다. 또한, 최근 유전자 연구는 이러한 단백질이 부분이 장애의 pathophysiology을 기초 탈선 척추 소성에 기여할 수있는 제안을 선도, 시냅스 단백질을 인코딩 다수의 유전자에 돌연변이가 확인되었습니다. 돌기 척추 morphologies / 번호를 제어에서이 단백질의 잠재적인 역할을 연구하기 위해, 교양 대뇌 피질의 뉴런의 사용은 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째,이 시스템은 고정된 세포의 돌기 쪽이의 고해상도 영상뿐만 아니라 라이브 세포의 시간 경과 이미징을 허용합니다. 둘째, 체외 시스템에서이 돌연변이 단백질, shRNA 구성 요소로 분해, 또는 약리 치료의 표현에 의해 단백질 기능의 쉬운 조작을 허용합니다. 이러한 기법은 연구자들이 질병 관련 단백질의 역할을 해부하다하고이 단백질의 변이가 생체내에서 작동할 수 방법을 예측하기 시작 수 있습니다.
Protocol
여기에서 설명한 프로토콜은 어떠한 기본 교양 시스템에 돌기 척추 형태와 역학을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
1. 기본 피질 신경 세포 배양의 준비
- glia - 시설 혈청이없는 배지 1-2에 스프 라그 - 돌리 랫 E18 배아과 문화의 고밀도 대뇌 피질의 신경 세포의 문화를 준비합니다.
- ACUC 절차에 따라 한 임신 쥐 (E18)를 안락사, 신속하게 자궁을 제거 (거기에 fetuses)와 얼음에 100mm 페트리 접시에 놓습니다.
- 한 포셉와 (과 탯줄 그대로) 목을하여 태아를 개최 뒤에서 앞으로 필 두피 다른 집게를 사용하여 뒤에서 앞에 정중선을 따라 끝 날카로운 집게로 열린 두개골을 슬릿을 열고 자궁 및 amniotic 막 컷.
- 그리고 MG 2 + 무료 HBSS - 곡선 포셉 (특종 모션) 및 장소 10 ML 얼음처럼 차가운 Ca2를 포함하는 100mm 배양 접시에있는 +와 함께 전체 머리를 제거합니다.
- 한 포셉, 다른 집게 별도의 반구, 해마와 striatum을 제거, 별도의 피질 조심스럽게 meninges에서 대뇌 피질의 조직에서 껍질과 뇌 줄기를 잡아.
- 수영장 대뇌 피질의 조직를 해부, 간략하게 말하다 4 ML을 포함한 15 ML 튜브로 전송 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %의 트립신, 0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), HyClone SH30042.01에서 HyQ 트립신)에 대해 37 ° C 물 목욕으로 품어 ~ 15 분,, 일회용 플라스틱 피펫과 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 최대한 제거 1.5 ML의 연결 매체를 추가하십시오.
- 5 ML 피펫 (~ 10 스트로크, 공기 방울을 생성하지 않도록)과 부드러운 pipetting하여 기계적 소화 조직을 떼어 놓다, 15 ML 튜브에 2 ML의 뜨는을 전송 후, 30 초에 대한 정착하게, 2 ML 매체를 추가합니다.
- (~ 15 분 정도 걸릴 총한다) 두 번 6 단계를 반복합니다.
- 2 분 200g에 세포 현탁액을 스핀.
- 뜨는을 (5 ML 피펫과 - 진공 대기음은하지 않음) 제거, 50 ML 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 5 ML 매체와 필터에 resuspend 세포 펠릿, 하단으로부터 손가락을 틀지하여 펠렛을 푸세요.
- 10 μl 세포 현탁액 10 μl trypan 파랑 혼합, hematocytometer로 가능한 세포 (trypan 파란색 제외) 백작.
- 전형적인 수율 : 5 X 10 6 세포 / 두뇌, 도금을 위해 원하는 밀도 (예 : 1.5 X 10 6 세포 / ML)로 희석.
- 폴리 - D - 라이신과 코팅 18mm의 원형이나 22x22 mm 정사각형 coverslips를 포함 (총 볼륨 마이너스 도금 볼륨), (도금 미디어 (stretomycin Neurobasal 미디어 2퍼센트 B27, 0.5 MM의 글루타민, 1 % 페니실린과 보충)에 문화 접시를 채우 0.2 MG / ML, 시그마)는 0.1 M Borate 버퍼 (3.1g / L 붕소의 소산, 4.8g / L 붕사, 산도 8.5, 필터 소독)에 용해, 12 자 판 = 0.8 ML / 음에 대한 전체 볼륨을.
- 다음 단계에 제공된 밀도에서 플레이트 뉴런은, 락을 / 도청 부드러운하여 균등하게 세포를 해산.
- ; 6 - 웰 플레이트 (하이 밀도 3 X 10 5 자 / = 857/mm 2) (중간 밀도 1.5 X 10 5 자 / = 430/mm 2) : 12 - 잘 접시 (물론 3.5cm 2 /)에 대한 (9.6cm 2 / 잘) : (하이 밀도 9 X 10 5 자 / = 624/mm 2) (중간 밀도 4.5 X 10 5 자 / = 312/mm 2).
- 한 시간 도금 후, 신선한 매체 (stretomycin 2% B27, 0.5 MM의 글루타민, 1 % 페니실린과 보충 Neurobasal 미디어) 모든 매체를 교체하십시오. 언제든지 세포를 건조하게하지주의, 세포 파편이 파편의 제거를 촉진하기 위하여 먼저 잘, 소용돌이 접시의 한가운데에 정착하는 경향이 있어요.
- 변경 ½ 매체 회 매주 이후 (각 우물에서 ~ 300-350 μl를 제거하고 400 μl 각 잘 신선한 먹이 매체를 따뜻하게 추가).
옵션 : DIV 4 일 200 μm의 D, 매체를 공급하는 L - 아미노 phosphonovalerate 산 (D, L - APV, 아센트 과학) 추가; 2% B27, 0.5 MM의 글루타민, 1 % 페니실린과 보충 Neurobasal 매체 문화 뉴런 : stretomycin을 + 200 μm의 APV. - 본 시간 포인트 돌기의 쪽이에서 체외 (DIV)에 24-28일위한 대뇌 피질의 뉴런의 주요 문화를 성장가 (즉, 그들은 미리 시냅스 파트너와의 연결을 형성하고, 맑은 머리와 같은 구조를 가지고) 성숙 형태를 표시하고 3-4 설치류 초기 청소년기에 해당합니다. 18mm의 원형 coverslips에서 성장 뉴런은 고정 immunostained 및 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데와 돌기 쪽이 자세한 morphometeric 분석에 사용되기 전에, pharmacologically tranfected 및 치료를하실 수 있습니다. 22x22 mm 평방 coverslips에 성장 세포 돌기 후 척추 역학을 조사하기 위해 시간 저속 영상 실험에서 사용할 수 있습니다.
2. 기본 교양 피질 뉴런의 Transfection
- 대뇌 피질의 뉴런은 2-3일 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5를 사용하여 실험을하기 전에 transfected 있습니다.
- DMEM (Dulbecco의 수정된 이글 매체의 산도 균형을하여 "H - DMEM"를 준비 없으며 아무런 글루타민을10 MM 무균 HEPES와 Invitrogen 11965-092) (4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산성, MediaTech Cellgro 25-060 - CI, 1M, pH를 7). 37 ° C.에 따뜻한
- 1,000분의 600 μl (18/22x22 mm의 coverslips) 미리 따뜻하게 (37 ° C) humidified 37 ° C 배양기에서 새 항생제 무료 매체 (Neurobasal 매체, B27, 0.5 MM의 글루타민) 및 부화 세포 보충하기 위해 coverslips을 전송 5 % 30 분 2 CO와 함께.
- H - DMEM 50 μl로, 각 coverslip 들면, DNA의 지정 금액 (구성에 따라 1-2 μg 하나 또는 여러 개의 DNA의 plasmids, 세포 형태학 및 태그 - 돌연변이 시냅스 단백질을 대략적으로 예를 들어 pEGFP); 추가 5 서 수 분.
- 각 coverslip 들어, 50 μl H - DMEM에 6분의 4 μl (18/22x22 mm의 coverslips) Lipofectamine 2000 추가, 5 분 서 수 있습니다.
- 철저하게 5 % CO 2와 보충 humidified 37 ° C 배양기에서 적어도 20 분 동안 유지 단계 1.3 및 1.4에서 튜브를 섞는다. 콤플렉스는 제조 업체에 따라 최대 6 시간 동안 안정합니다.
- 단계 1.5 dropwise의 세포로 Lipofectamine 2000/DNA 혼합물을 추가합니다. 4 시간 동안 5 % CO2와 보충 humidified 37 ° C 배양기에서 세포를 품어.
- 단계 1.1 (600분의 300 μl), 사전 예열과 보완의 먹이 매체를 사용하여 (37 ° C) 800분의 400 μl 신선한 먹이 매체 (18/22x22 mm의 coverslips). 다음 단계의 1.6 오래된 신선한 먹이 미디어를 포함하는 중간에 전송 coverslips.
- plasmids 표현 2-3 일 동안 계속하실 수 있습니다.
3. 기본 교양 피질 뉴런의 치료 18 mm의 coverslips에서 성장
이전 transfected 18mm의 coverslips에 성장 뉴런은 쉽게 약리 치료를 받게 될 수 있습니다.
- ACSF를 (; : 125 NaCl, 2.5 KCl, 26.2 NaHCO 3, 1 저질 2 PO 4, 11 포도당, 5 HEPES, 2.5 CaCl 2 200 μm의와 1.25 MgCl 2 D, L - APV MM의 인공 뇌척수) 준비. 37 ° C.에 따뜻한 30~60분 900 μl 따뜻한 ACSF에 미리 품어 coverslips. 억제제와 전처리이 시간 동안 수행할 수 있습니다.
- 10X 작업 농도 재고 솔루션에서 약리 대리인 / 차량 준비, ACSF에서 솔루션의 dilutions을 수행합니다. 조심스럽게 세포 (1X 대리인 / 차량의 최종 농도 1000 μl의 최종 볼륨) 요원 / 차량을 추가하고, 치료를 원하는 시간 5 계속하실 수 있습니다.
- 다음 치료 (들), immunocytohistochemistry을위한 세포 및 프로세스를 수정.
4. 고정 및 immunocytohistochemistry (ICC)
- PBS의 배 세척 다음 실온에서 10 분 동안 4 % 포름 알데히드 / 실온에서 20 분 4퍼센트 자당 PBS (800 μl) 중 하나의 뉴런을 수정, 또는 4 %의 포름 알데히드에 / 4퍼센트 자당 PBS (800 μl) , 4 사전 냉장 (-20 ° C) 메탄올 (800 μl)로 수정 십분 ° C. 다음 메탄올의 고정은 단백질 denaturing하고 precipitating 작품. 이 절차는 이후 시냅스 밀도 (PSD)에있는 단백질의 unmasking뿐만 아니라 지질이 풍부한 지역에 발생합니다.
- 십분 각 PBS (800 μl), 2X에 coverslips 씻으십시오.
- Permeabilize와 PBS는 실온에서 1 시간에 대한 2퍼센트 정상 염소 혈청과 0.1 % 트리톤 - X - 100 (800 μl)이있는 동시에 세포를 차단합니다.
- PBS가 적절한 농도에서 혈청 2퍼센트 정상 염소를 포함하는 GFP, 에피토프 태그에 대해 제기된 주요 항체 (그의, myc, V5 예를 들어) 또는 내생 단백질을 추가합니다. , 15cm의 접시를 타고 네모로 그것을 분할, 숫자들을, 그리고 parafilm로 커버. 세포가 아래로 향하게와 항체 / 블록 믹스에 80 parafilm하는 항체와 블록 혼합물의 μl (평방 당 하나의 드롭) 및 장소 coverslip에 대한 추가합니다. 4 OC에서 하룻밤 Incubated.
- 십오분 각 배 PBS에서 coverslips을 씻으십시오.
- PBS가 적절한 농도에서 2% 정상 염소 혈청을 포함하는으로 알렉사 - 복합 이차 항체 (Invitrogen)를 희석. 가벼운로부터 보호 1 시간을 위해 상온에서 단계 3.4에서와 동일한 방식으로 보조 항체를 품어.
- 워시는 PBS에 추가 배 15 분 coverslips.
- 표준 현미경에 마운트 coverslips 골드 antifade 시약 (Invitrogen)를 연장 사용하는 슬라이드.
5. 척추 morphologies의 정량 분석
우리는 자이스 혈구 LSM5 파스칼 공촛점 현미경을 사용하여 단일 및 이중 스테인드 뉴런 (세포가 GFP과 관심의 구축이나 내생 단백질을 표현)의 공촛점 이미지를 구하십시오. 모든 영상 실험은 후속 분석 군데하고 사용할 수 있도록 건강 피라미드 뉴런을 선택하십시오. 건강한 뉴런은 blebbing이나 치료 또는 고정으로 인한 고통의 기호를 표시하지 않으며 전체, 중단 돌기의 아버이 포함되어 세포 수 있습니다.
- NA와 63x 기름 침지 목표 (자이스 혈구)를 사용하는 뉴런의 이미지를 취득 (NUM1.4의 조리개 erical)은 3-8 이미지의 Z - 시리즈로, 0.37 μm의 간격, 섹션마다 2.5 초 스캔 속도 1024x1024 픽셀 해상도, 4 번 평균. 직접 비교 예정이다 문화는 동일한 인수 매개 변수와 함께 몇 군데해야합니다. 3-5 별도의 실험, 그리고 신경 세포 당 100 μm의 2 dendrites 10-20 뉴런 / 상태, 각 분석해야합니다. 실험은 맹인과 자매 문화에서 수행되어야합니다. 검출기 이득을 조정하고 척추의 형광 신호와 배경 사이의 전환 정확한 부량를 허용 날카로운는 이러한 dendrite 주위에 후광을 만들지 않고도 dimly 형광 얇은 쪽이를 포함하는 오프셋. 동일한 실험 내의 모든 검색에 대한 인수 매개 변수에게 동일하게 유지.
- GFP 이미지는 488 nm의에서 신나는 아르곤 레이저 라인을 사용하고 505-530 nm의에서 대역 통과 필터 수집 취득하실 수 있습니다. overexpressed 단백질이나 내생 단백질의 이미지 알렉사 568 차 항체 (Invitrogen)이 543 nm의에서 신나는 HeNe 레이저를 사용하여 수집하고, 560 nm의에서 긴 패스 필터를 사용하여 수집 수와 immunostained. 샘플 photobleaching 피하기 위해 최소한으로 레이저 파워 보관하십시오.
- 2 차원, 배경 - 빼서, Z 시리즈 이미지의 최대 투영 reconstructions가 morphometric 분석 및 부량 사용됩니다 MetaMorph 소프트웨어 (분자 디바이스 주식 회사)를 사용합니다. 돌기 쪽이의 morphologies을 확인하려면, 붕괴 Z - 시리즈 이미지, 임계값이 쪽이의 개요 (그림의 2E, F)에 정확하게 대응하는 방식으로 모든 쪽이을 포함하도록 임계값 다음 필요한 거리를 보정합니다. 두 번째와 세 번째 차 dendrites (신경 세포 당 100 μm의 총 길이)에서만 쪽이은 다양성을 줄이기 위해 측정하고, 세그먼트의 측정 지점 지점 사이에 만들어진해야한다. 그것이 닫힌 경계선 (그림 2G) 될 수 있도록 수동으로 각각의 척추도 포함되어 있습니다.
- MetaMorph에서 자동으로 다음과 같은 척추 매개 변수를 측정할 수 : 척추 길이, 척추 폭, 단면적과 척추 돌기 선형 밀도. 부량 위해 Excel로 돌기 척추 morphometric 매개 변수를 내보냅니다. 두 그룹 사이의 차이의 통계적 중요성을 결정하기 위해 학생의 unpaired t 테스트를 사용하여, 편도 ANOVA는 Tukey - B 게시물을 임시 다중 비교를 위해 다음 세 이상의 그룹을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 통계 분석은 엑셀, GraphPad 또는 SPSS에서 수행할 수 있습니다. Kolmogorov - 스미 르 노프 시험 (KS 테스트) 2,5-6를 사용하여 누적 음모를 분석할 수 있습니다.
6. 정량 immunofluorescence (IF)
특정 시냅스 단백질에 대한 항체의 immunofluorescence 사용 부량는 클러스터링 및 내생 시냅스 시냅스 단백질 지방화의 변화를 검사하는 데 사용할 수있는, 알렉사 568 차 항체 (Invitrogen)을 사용하여 시각.
- 위에서 설명한 것처럼 공촛점 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 아르곤과 HeNE 레이저 (위 참조) 이미지를 두 번 묻은 뉴런을 사용하십시오. 단지 이미지 건강한 피라미드 고통의 흔적이 표시되지 않습니다 뉴런.
- 형광 강도 측정, MetaMorph을 사용하여 "배경 - 빼서"이미지 (그림 2J) 생성하는 돌기 축 (그림 2I, 노란색 사각형)에 해당하는 배경을 뺍니다. 마찬가지로 임계값 이미지 강도 인접한 dendrite (그림 2K) 상기 적어도 두 배와 클러스터를 포함합니다. MetaMorph를 사용하여 "경계"유틸리티 (그림 2D)과 자동으로 선형 밀도 (number/100 μm의의 dendrite 길이)를 측정하고, 각각의 시냅스 클러스터의 통합 강도 (강도 IF 총)를 사용하여 dendrites (신경 세포 당 100 μm의) 함께 개요 지역 7-9.
- 시냅스 단백질의 상대적인 척추 컨텐츠를 측정하려면 먼저 MetaMorph를 사용하여 척추의 형태 (그림의 2E, F)을 결정하기 위해 GFP 이미지를 thresholding하여 단백질 클러스터링을 결정합니다. 단지 다른 채널 (그림 2G, H)에서 캡처한 관심의 단백질의 이미지를 포함 쪽이 관심의 영역을 전송합니다. 단백질 클러스터의 개수를 카운트하고 척추의 단백질 함량을 평가하기 위해 쪽이 내부의 immunofluorescence 통합 강도를 측정합니다.
- 수출 IF 부량 위해 Excel로 시냅스 단백질의 매개 변수입니다. 두 그룹 사이의 차이의 통계적 중요성을 결정하기 위해 학생의 unpaired t 테스트를 사용하여, 편도 ANOVA는 Tukey - B 게시물을 임시 다중 비교를 위해 다음 세 이상의 그룹을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 통계 분석은 엑셀, GraphPad 또는 SPSS에서 수행할 수 있습니다.
7. 시간 저속 영상
이러한 질병에 관련된 시냅스 단백질의 존재 또는 부재의 척추 운동성 또는 개별 쪽이의 척추 형태의 변화로 돌기 척추 역학을 조사 24-28 DIV위한 22x22 mm 평방 coverslips에 교양 기본 대뇌 피질의 뉴런의 성장을. Neur기능은 세포 형태를 정의하기 위해 GFP / mCherry와 함께 더블 transfected, 그리고 위에서 설명한 찬란 돌연변이 시냅스 단백질에 태그를하실 수 있습니다. 모든 이미징 실험을 위해, 두 구조를 표현하는 건강한 피라미드 뉴런을 선택,이 세포는 약리 치료의 대상이 몇 군데 이후 분석에서 사용할 수 있습니다.
- humidified 37 ° C 배양기에서 30~60분에 대해 1.5 ML ACSF에서 22x22 mm의 coverslips에서 성장 사전 품어 뉴런은 5 % CO 2 보충. 세포는 또한뿐만 아니라이 단계에서 약물과 사전 처리하실 수 있습니다. 다음 pre-incubation/treatment, 동봉된 영상 무대 챔버 (워너, RC - 30HV)로 전송 세포. 37 온도를 유지 컨트롤러 유닛과 함께 ° C (워너, TC - 344B) 2,5-6,10.
- 척추의 운동성, 이미징 챔버에 세포를 전송하기 전에 최대 30~60분에 대한 약물 또는 차량과 사전 치료 세포를 검사합니다. 이것은 약물 / 차량에 대한 충분한 시간이 신경 세포 내에서 두번째 메신저 경로를 시작하실 수 있습니다. 십분 간격으로 2X 평균과 63X 목표 (Ziess, NA 1.4)를 통해 이미지를 획득. GFP / mCherry 또는 형광 - 태그 단백질을 표현하는 전반적인 피라미드 morphologies로 건강한 뉴런을 선택합니다. photodamage을 최소화하기 위해, 0.5-1 %로 레이저 파워를 줄일 수 있습니다. 약물 치료 세포 대 차량 처리의 비교는 척추의 운동성 변화를 보여주는 것입니다. 또는 척추의 운동성는 약물 / 차량의 재관류 (아래 참조)에 의해, 치료 전후의 평가하실 수 있습니다. 각 시점에서 Z - 스택을 수집합니다.
- 형태의 기본 변경 사항을 설정하는 시간이 지남에 따라 돌기 척추 형태의 변화, 1 시간 동안 이미지 coverslips를 추적합니다. 이때 추가로 시간 연동 펌프 (길슨, Minipuls 3), 및 이미지 신경 세포를 사용하여 이미징 챔버에 약물 / 차량 perfuse. 2X가 10 분마다 평균과 63X 석유 목표 (Ziess, NA 1.4), 사용 공촛점 Z - 스택을 습득. photodamage을 최소화하기 위해 0.5-1 %로 레이저 파워를 줄입니다.
- 각 이미지 세션이 끝날 때, photodamage의 확인할 수준으로 전체 신경 세포의 20X 이미지를 구하십시오. 고통의 흔적을 전시하는 모든 뉴런은 부량에서 생략한다. 각각의 시간 점의 Z - 스택은 Metamorph에서 2D 전망으로 붕괴한다. 중간 통과 필터 또는 배경 제거, transfection의 이미지 품질과 수준에 따라이 분석을 위해 명확한 이미지를 생산하는 Metamorph에 적용할 수 있습니다.
- 척추 모핑 및 운동성을 평가, 100 분 영상 세션의 시작, 중간 및 마지막에 찍은 이미지는 색깔과 MetaMorph에 중첩되어야합니다. 셀 당 dendrite 최소 100 μm의 분석을해야합니다. 전체 척추의 운동성 분율은 운동성 이벤트, 즉 확장, 철회, 모핑 머리 또는 척추 번호 6,11으로 표준 밀어내는 운동성의 총 숫자로 정의됩니다. 그것이 수영장 사건의 모든 유형을, 및 전반적인 운동성의 일반적인 견적이며이 방법은 자신의 magnitudes을 고려하지 않고, 사건의 빈도를 측정합니다. 밀어내는 이벤트가 척추 헤드 또는 돌기 샤프트에서 새로운 과도 돌출부의 모양으로 정의됩니다. 철회 이벤트는 척추의 머리 또는 돌기 축에 위치한 기존 또는 과도 돌출부의 실종로 정의됩니다. 돌출 및 확장 이벤트의 합계는 계량입니다 dendrite의 지역에서 쪽이의 총 개수로 나누어집니다.
- 약물 치료에 대한 응답으로 개별 척추 형태의 변화를 평가하기 위해 즉시 치료를 선행하고 각 시점의 아래에서 교차 단면 돌기 쪽이 면적, 또는 시점 -1 시간 (재관류 전에 1 시간)에 돌기 척추 선형 밀도를 측정 치료. 1 시간 전에 - 투 - 치료 시점에 각 시점을 정상화. 척추 돌기 형태 또는 선형 밀도의 변화가 photodamage으로 인한되지 않은 것을 확인하려면, 차량과 perfused 뉴런을 분석할 수 있습니다. 의미의 차이는 학생의 unpaired t 테스트 또는 한 샘플 t 테스트에 의해 결정하실 수 있습니다.
8. 성공을 다른 방법과 키
- 우리는 만기까지 DIV 4 (DIV24 - 28)에서 L - APV, NMDA 수용체 억제제, D의 면전에서 대뇌 피질의 뉴런 culturing 설명했습니다. 이것은 D의 존재에 culturing 대뇌 피질의 뉴런 반면, L - APV는 장기 피질의 연결을 문화, D의 존재의 좋은 건강을 유지의 이익을 가지고, L - APV가 버렸네 개발 영향을 줄 수 있다고 언급한다. 이러한 대안은 D, L - APV 2,5의 부재에서 문화 뉴런으로 때문입니다. D의 부재에 culturing의 뉴런은 L - APV 추가주의 과도한 Ca2에 의한 세포 사망의 증가 가능성이 + 세포 독성은 지나치게 활성 NMDA 수용체 활성화를 통해가로, 문화의 전반적인 건강에 지불하여야한다.
- 이 프로토콜에서 설명의 연결을 문화가 돌기 척추 형태와 dendriti의 운동성 규제에 대한 관련된 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다C는 성숙한 형태로 (즉, 그들은 사전에 시냅스 파트너와의 연결을 형성하고, 맑은 머리와 같은 구조를 가지고) 2,4,5를 표시하는 쪽이. 또는 시간이 지점 이전에 문화의 사용 예 DIV11 - 16는 초기 개발하는 동안 척추 돌기 형성, 또는 돌기 쪽이 규제 관련 질문을 해결하기 위해 더 적절한 수 있습니다.
- 공촛점 현미경의 사용에 대안은, 치료 교양 대뇌 피질의 뉴런의 이미지를 얻기위한 넓은 분야 에피 형광을 사용하는 것입니다. 조합 적절한 deconvolution 알고리즘과 함께 쪽이의 상세 morphometric 분석은 고정 또는 라이브 세포 만들 수 있습니다. 또한, 같은 ImageJ합니다 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) 또는 Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns을 . HTML ) 이것은 척추 돌기 형태의 분석, 자유 소프트웨어입니다.
- 돌기 척추 운동성를 검사 / 시간 - 저속 이미징을 사용하여 모핑 때, 그것은 짧은 시간 경과 간격의 사용 예 50~10분이 돌기 척추 turnover2, 5 훨씬 더 상세한 분석을 제공할 수 있다고 언급한다. 짧은 시간 간격도 더 이상 시간 간격을 사용하여 검색되지 않을 것이라고 모핑 척추 더 빠른 형태를 식별할 수 중 하나를 사용하십시오.
- 교양 피질 뉴런의 사용은 고려해야 단점과 우려의 숫자를하고 있습니다. 첫째, 교양 대뇌 피질의 뉴런을 사용하는 우려는 돌기 척추 밀도와 같은 매개 변수에 영향을 줄 수 문화 사이에 변화가있을 수 있습니다. 따라서, 그것은 다음 사항을 신중하게 변화의 최소 금액을 보장하기 위해 준수하는 것이 필수적입니다. 첫째, culturing 매개 변수와 시약은 좋은 culturing 관행 이외에 가능한 한 일관성을 유지한다, 이것은 크게 문화 간의 다양성의 수준을 줄일 수 있습니다. 둘째, 그것은 모든 실험 시간 같은 지점에서 수행하고, 자매 문화 것이 중요합니다. 또한 실험이 수행되는 시점에 포인트는 신중하게 (위의 포인트 2 참조) 실험자의 적절한 질문을 수 있도록 선택되어야합니다. 마지막으로, 그것은 적절한 컨트롤이 치료 조건은 항상 이러한 내부 컨트롤에 상대적으로 검사되도록 모든 실험에서 사용되는 것이 중요합니다. 이것은 문화 간의 다양성의 우려를 제거합니다.
- 교양 피질 뉴런의 사용은 연구자들이 비판적 돌기 척추의 형태와 운동성의 규정에 필수적인 메커니즘을 조사하기 위해 사용으로 강력한 도구입니다. 그러나, 그것을 이러한 문화가 생체내 상황에서이 요점을 되풀이하지 않습니다하는 것이 중요하다, 그리고 대뇌 피질의 계층 조직과 같은 버렸네 형성에 glial 세포 등 다른 세포 유형의 효과와 같은 구성 요소는 위에서 설명한 시스템에서 해결하실 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 시스템은 척추 돌기 형태와 운동성의 규정을 기본 잠재적으로 중요한 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
9. 대표 결과
위에서 설명한 assays는 약리 요법 및 / 또는 체외에서 단백질 기능의 유전자 조작에 대한 응답으로 돌기 척추 형태, 번호 및 운동성 변화를 조사하기 위해 고안되었습니다. 우리가 실험실에서, 우리는 따라서 그들의 구조 2,9를 변경, 돌기 쪽이에서 굴지의 cytoskeleton을 조절 시냅스 단백질의 역할을 특성화하기 위해 이러한 기술을 활용합니다. 또한, 우리는 neuromodulators로 neuroactive 화합물이 돌기 척추 형태, 숫자 또는 모양의 변경, 단독 4,6,10, 또는 활동에 의존 자극 5 존재 안에 메이 드라이브 방식을 결정하는이 분석을 사용했습니다.
1D 또는 2D 매개 변수가 우리의 측정의 정확도를 평가하기 위해, 우리는 연구를 통해 뉴런과 같은 조건에 탑재 알려진 차원의 형광 라텍스 microspheres (듀크 과학) (0.2, 0.52, 1.0 μm의)의 직경과 영역을 측정. 척추 측정 (63X NA = 1.4 기름 침지 목표, LSM 5 파스칼)에 대해 같은 이미징 조건을 사용하여 우리는 microspheres 몇 군데, 그리고 마찬가지로 우리의 척추 측정 Metamorph 그들의 직경과 영역을 결정. 우리는 다음 microspheres의 알려진 크기와 실제 측정을 비교했다.
그림 1 (Fig.1)의 그래프는 우리가 정확하게 0.52의 microspheres 영역 및 1.0 μm의를 측정할 수 있다고 보여주는 (지역 = 0.21 μm의 2 0.78 μm의 각각 2) (측정 표준 편차 ~ 15 %, 표준 편차를 결정 제조 업체 ~ 9 %). 심지어는 0.2 μm의 microspheres 우리의 측정은 매우 (단 대형 SD)를 실제 크기에 가까운했다. 이것은 계산 측면 resol과 일치 이 특정 목표를 사용하여 우리 공촛점 현미경 ution, 0.3 μm의 (방정식을 사용하여 Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. 이것은 공촛점 및 2 광자 현미경을 위해 가난한 것으로 알려져 축 해상도보다 훨씬 낫습니다. 또한, 우리는 실험적으로 200 nm의 직경의 녹색 형광 microspheres (듀크 과학) 수 ~ 0.5 μm의를 측정하여 측면 (X / Y 축) 포인트 확산 기능 (PSF)를 결정. 이 견적은 핀홀 오픈과 함께 수행 있었고, 따라서 그것은 핀홀이 닫을 때, PSF 실제로 작은 것이 있다고 가정하실 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이것은 다시 우리가 정확하게 0.196 μm의 2 (직경 = 0.5 μm의)보다 큰 영역을 측정할 수있다는 것을 나타냅니다. 실제 측면 PSF의 표시가에 있습니다 (스보 외.) 13 "0.16 μm의 2 영역을 초래 하리라는 사실을 훨씬 덜하지보다 0.4 μm의"로. 이러한 비교와 이론적 고려 우리가 측정한 쪽이의 크기가이 해상도 제한 (> 0.25 μm의 2)보다 큰 때부터 우리가 정확하게 쪽이 크기의 유사한 객체의 영역을 측정할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 조건을 우리가 안정적으로 척추 영역을 측정하고, 정확하게 다른 처리 조건에서 척추 morphologies을 비교할 수있다는 표시, 13 "클래식 morphometric 기술은 양적합니다."
정확하게 척추 돌기 형태를 측정하기 위해, 우리는 2 일간 EGFP 구조와 DIV 23 피질 뉴런을 transfected 있습니다. transfection 후, 세포가 치료를 받게 될 수 있으며, 고정 및 GFP 신호가 dendrite (또는 신경 세포)에 걸쳐 균등 수 있도록 향상 ICC에 대한 처리됩니다. 그림 2는 GFP와 transfected 대뇌 피질의 신경 세포의 대표 이미지를 보여주는 객관적 63X (NA 1.4) (그림 2A)과 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데. 이 돌기 쪽이 (그림 2B)의 자세한 고해상도 이미지 수 있습니다. 돌기 쪽이의 상세 morphometric 분석은 Metamorph 프로그램을 사용하여 우리가 실험실에서 수행됩니다. 이 프로그램은 우리가 돌기 척추 형태를 측정하는뿐만 아니라 수 있습니다뿐만 아니라 내생적인 단백질의 지방화를 검사합니다. 우리가이 분석을 수행하는 방법에 대한 개요는 그림 2 (그림 2C - G)에 제공됩니다.
활동에 의존 자극의 효과는 잘 특징 돌기 척추 크기 2 증가입니다. 그림 3은 활동에 의존 자극 전후에 30 분 동안 몇 군데 DIV 피질 신경 세포 24 표현 EGFP의 돌기 척추의 대표적인 시간 저속 영상을 보여줍니다. 이 시간 - 저속 실험 활동에 의존 자극은 (그림 3A, B) 돌기 척추 크기를 늘리는 것이 확인합니다. 기초 척추 운동성을 검사하려면 이미지는 시간 지점에서 0, 50 백분을 인수했고, 척추 확장, retractions, 모핑 밀어내는 운동성 및 머리는 별도 측정 및 총 운동성으로 결합되었다. 그림 3C - D도 기초 조건 하에서 대뇌 피질의 뉴런의 돌기 쪽이은 운동성의 일부 수준을 표시 확인합니다.
그림. 1. 형광 microspheres. 오차 막대의 측정과 실제 지역의 비교 측정 분야의 표준 편차를 나타냅니다. 0.2 μm의의 microspheres의 이미지, 0.52 μm의 1 μm의. 스케일 바 = 5 μm의.
그림. 2. 척추의 형태 및 IF 부량. EGFP - transfected 피라미드의 DIV 25 EGFP - 표현 양식 대뇌 피질의 신경 세포를. 피질 뉴런에있는 전형적인 돌기 척추 형태의 B. 높은 배율이. C. EGFP와 내생 단백질 (GluR1) 오버레이가. D.이 무너 Z를 시리즈의 A. 이미지 세포 dendrite는, 축과 쪽이 사이의 분할을 수동으로 추적됩니다 E. 고유, superthreshold 영역은 다음 Metamorph에 의해 설명된 및 계량 아르 결정 F. 손으로 추적 척추의 길이, 폭, 단면적을 결정하는 데 사용 뉴런 G. 지역별... Metamorph하여 해당 쪽이 일치합니다. H. 스파인 윤곽선이 척추 특정 신호를 수치 빨간색 채널 이미지 (내생 단백질)로 전송됩니다. IK. Z - 시리즈의 투영 이미지가 사용되는 경우, 수용체 또는 시냅스 단백질 클러스터를 수치. I. 돌기 샤프트 배경 IF (노란색 사각형)은 J.이 이미지가 다음 thresholded 수 있습니다. "배경 - 빼는 '이미지를 생성 빼는 및 프로그램이 자동으로 클러스터 공간, 선형 밀도 및 총 회색 값 (강도 IF) K. 조치입니다 H.의 스케일 바, = 15 μm의에서 Thresholded 이미지, B = 1 μm의.
G "고도 ="그림 3 "/>
그림. 3. 활동 의존 척추 형태의 변화, 그리고 돌기 쪽이의 기저 운동성. 활동에 의존 자극을뿐만 아니라 전후 대표 돌기 척추 A. 시간은 저속 영상. 활동에 의존 자극은 Mg2 +와 APV없이 ACSF에 Mg2 +와 APV를 포함 ASCF에서 실험적 미디어 스위칭하지만 -30 분 시점 (30 표준 돌기 척추 지역의 10 μm의 글리신 B.의 부량 (크기)를 포함하여 유도되었다 이전 재관류로 분). 돌기 척추 운동성의 0, 50 백분 시간 포인트 C. 대표 이미지. 아래의 이미지가 별도로 각각의 시점하는 동안 상위 이미지는 0 (빨간색)의 오버레이, 50 (녹색) 100 (파란색) 분 시간이 지점을 보여줍니다. 별표 척추 확장을 나타냅니다; 흰색 화살표는 척추의 철회를 나타냅니다, 녹색 화살표 머리가 밀어내는 운동성을 나타냅니다; 오픈 노란색 화살표 머리가 척추 헤드가 변신 나타냅니다 D.의 돌기 척추 운동성 매개 변수의 부량, 총 운동성 EGFP 다음과 같은 이미지를 표현하는 대뇌 피질의 뉴런의 E. 20X 이미지.. 세포의 건강을 결정하기 위해 세션.
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Discussion
기술 neuropathologies에 기여할 수있다 포스트 시냅스 메커니즘의 영향을 이해에 초점을 아르 돌기 척추 형태, 중 고정 또는 라이브 주요 대뇌 피질의 뉴런의 선형 밀도와 운동성의 상세한 정량 분석을 위해 위에서 설명한. 비슷한 접근 방식은 hippocampal 피라미드, Purkinje, 또는 중간 가시의 뉴런 포함하여 가시의 신경 세포에서 척추의 형태 또는 운동성을 계량하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에서 설명한 프로토콜은 시냅스 단백질 및 / 또는 돌기 쪽이에 대한 약리 치료의 효과의 기본 속성을보고 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 수용체를 조미료로 비계 단백질에서부터 내생 시냅스 단백질의 지방화의 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 시냅스 단백질이나 돌기 척추 운동성에 대한 약리 치료의 효과 측정 또한 고정 쪽이 자세한 morphometric 분석뿐만 아니라 수 있지만. 이러한 시간 경과 영상 기법은 또한 또는 동시에 돌기 척추 형태를 검사하지 않고, 단백질의 거래를 조사하기 위해 수정할 수 있습니다.
돌기 척추의 형태와 운동성에 대한 상세한 분석은 돌연변이 시냅스 단백질의 잠재 효과를 조사하는 필수적인 도구이며, 어떻게 이러한 질병 관련된 시냅스 단백질의 돌연변 버렸네 구조와 기능에 영향을 미칠 수 있습니다함으로써의 장애의 숫자의 pathophysiology에 기여 뇌.
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Disclosures
이 작품은 제작이 MetaMorph (분자 디바이스 주식 회사)에 의해 지원되었다.
Acknowledgments
우리는주의 편집을 위해 켈리 존스 감사합니다. 미국 심장 협회 박사 과정 이수 원정대 (DPS),이 작품은 NIH 부여 R01MH 071316, 알츠하이머 협회, 정신 분열증과 우울증 (NARSAD)에 관한 연구에 대한 국가 연합, 그리고 자폐증 연구에 대한 국가 연합 (나르) (PP)에 의해 지원되었다 미국 심장 협회 Predoctoral 원정대 (KMW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | Mediatech, Inc. | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Millipore | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR international | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner Instruments | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner Instruments | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
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