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Neuroscience

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine ​​sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine ​​associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.

Abstract

Spine dendritiche sono i siti della maggior parte delle connessioni eccitatorie all'interno del cervello, e la forma post-sinaptica vano di sinapsi. Queste strutture sono ricchi di actina e hanno dimostrato di essere altamente dinamica. In risposta alla classica plasticità Hebbian così come i segnali neuromodulatori, spine dendritiche possono cambiare forma e numero, che è pensato per essere critica per la raffinatezza dei circuiti neurali e della trasformazione e conservazione delle informazioni all'interno del cervello. All'interno di spine dendritiche, una complessa rete di proteine ​​collegamento segnali extracellulari con il cyctoskeleton actina permettendo il controllo della morfologia e il numero di spine dendritiche. Gli studi neuropatologici hanno dimostrato che un certo numero di stati patologici, che vanno dalla schizofrenia ai disturbi dello spettro autistico, display anomalie morfologiche dendritiche colonna vertebrale o numeri. Inoltre, recenti studi genetici hanno identificato mutazioni in numerosi geni che codificano proteine ​​sinaptiche, portando a suggestioni che queste proteine ​​possono contribuire alla plasticità della colonna vertebrale aberrante che, in parte, alla base della fisiopatologia di questi disturbi. Per studiare il potenziale ruolo di queste proteine ​​nel controllo delle morfologie spine dendritiche / numero, l'uso di colture di neuroni corticali offre diversi vantaggi. In primo luogo, questo sistema permette di imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche in cellule fisse e time-lapse imaging di cellule vive. In secondo luogo, questo sistema in vitro permette una facile manipolazione della funzione della proteina da parte espressione di proteine ​​mutanti, l'abbattimento da costrutti shRNA, o trattamenti farmacologici. Queste tecniche permettono ai ricercatori di iniziare a sezionare il ruolo di proteine ​​associate alla malattia e per prevedere come le mutazioni di queste proteine ​​possono funzionare in vivo.

Protocol

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Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per esaminare la morfologia dendritica e la dinamica della colonna vertebrale in qualsiasi sistema primario colta.

1. Preparazione di colture primarie di neuroni corticali

  1. Preparare ad alta densità culture neuroni corticali di ratto Sprague-Dawley E18 embrioni e la cultura nelle cellule gliali condizionata mezzo privo di siero 1-2.
  2. Euthanize un ratto in gravidanza (E18) in base alle procedure ACUC; rimuovere rapidamente utero (con feti in esso) e porre in un piatto da 100 millimetri di Petri sul ghiaccio.
  3. Tagliare utero aperto e membrana amniotica, tenere feto per il collo (cordone ombelicale intatto) con una pinza, utilizzare un altro forcipe per cuoio capelluto buccia da dietro in avanti, e spacco il cranio aperto con una pinza tagliente punta lungo la linea mediana da dietro in avanti.
  4. Rimuovere l'intero cervello con una pinza curva (con un movimento scoop) e porre in un piatto da 100 mm di Petri contenente 10 ml ghiacciata Ca2 + - e Mg 2 + senza HBSS.
  5. Tenere tronco cerebrale con una pinza, emisferi separati con un'altra pinza, togliere ippocampo e striato, la corteccia separata e con attenzione buccia del tessuto corticale fuori dal meningi.
  6. Piscina sezionato tessuti corticali, tritare brevemente e trasferire in una provetta da 15 ml contenente 4 ml preriscaldata tripsina / EDTA (0,25% tripsina, 0,53 mM EDTA; HyQ tripsina da Hyclone SH30042.01); incubare in acqua a 37 ° C da bagno per ~ 15 min; rimuovere tripsina / EDTA per quanto possibile, con una pipetta di plastica usa e getta, aggiungere 1,5 ml di media neuronale.
  7. Dissociare i tessuti digerito meccanicamente pipettando dolce con una pipetta da 5 ml (~ 10 colpi, evitare di creare bolle d'aria), aggiungere 2 ml di mezzo, lasciare riposare per 30 secondi, poi il trasferimento 2 ml di surnatante in una provetta da 15 ml.
  8. Ripetere il passaggio 6 per due volte (dura circa ~ 15 minuti totali).
  9. Spin sospensione cellulare a 200 g per 2 minuti.
  10. Rimuovere il surnatante (con una pipetta da 5 ml - non aspirare a vuoto), allentare il pellet girando le dita contro il fondo; risospendere pellet in 5 ml di mezzo e filtrare attraverso un filtro di 40 micron di cellule in una provetta da 50 ml.
  11. Mix 10 microlitri di sospensione cellulare e 10 microlitri trypan blu; Conte cellule vitali (tripano esclusione blu) con un hematocytometer.
  12. Tipica resa: 5 x 10 6 cellule / cervello; diluire a densità desiderata (ad esempio 1,5 x 10 6 cellule / ml) per la placcatura.
  13. Riempire con piastre di coltura terreni in piastra (media Neurobasal integrato con il 2% B27, 0,5 mM glutamina e 1% di penicillina: stretomycin) (volume totale meno il volume placcatura) contenente 18 mm o tondo coprioggetto 22x22 millimetro quadrato, rivestito con poli-D-lisina ( 0,2 mg / ml, Sigma) disciolto in 0,1 M tampone borato (3.1g / L di acido borico, 4,8 g / L borace, pH 8,5, filtro sterilizzato); volume totale di 12-pozzetti = 0,8 ml / pozzetto.
  14. Neuroni piastra alla densità fornita nella fase successiva; disperdere le cellule in modo uniforme dal dolce dondolio / maschiatura.
  15. Per i 12-pozzetti (3.5cm 2 / e): (ad alta densità 3 x 10 5 / pozzetto = 857/mm 2) (media densità di 1,5 x 10 5 / pozzetto 430/mm = 2); 6 pozzetti (9,6 centimetri 2 / e): (ad alta densità di 9 x 10 5 / pozzetto = 624/mm 2) (media densità di 4,5 x 10 5 / pozzetto 312/mm = 2).
  16. Un'ora dopo la placcatura, sostituire tutti i media con fresco di media (media Neurobasal integrato con il 2% B27, 0,5 mM glutamina e 1% di penicillina: stretomycin). Perché detriti cellulari tendono a stabilirsi nel mezzo del pozzo, agitare i primi piatti per facilitare la rimozione dei detriti; fare attenzione a non lasciare pile a secco in qualsiasi momento.
  17. Cambia ½ media due volte ogni settimana in seguito (rimuovere ~ 300-350 microlitri di ogni bene e aggiungere 400 microlitri riscaldato mezzo fresco di alimentazione in ciascun pozzetto).
    Opzionale: Il DIV 4 aggiungere 200 mM D, L-amino-acido phosphonovalerate (D, L-APV, Salita scientifico) ad alimentare media; neuroni cultura in media Neurobasal integrato con il 2% B27, 0,5 mM glutamina e 1% di penicillina: stretomycin + 200 mM APV.
  18. Crescere colture primarie di neuroni corticali per i giorni 24-28 in vitro (DIV), come in questo momento-point spine dendritiche visualizzare una morfologia matura (cioè formano connessioni con pre-sinaptica partner, ed avere una chiara testa struttura simile) e corrispondono alla prima adolescenza nei roditori 3-4. I neuroni coltivati ​​su vetrini coprioggetto da 18 mm tondo può essere tranfected e trattati farmacologicamente, prima di essere fisso, immunoistochimica, e fotografato con un microscopio confocale e utilizzato per l'analisi dettagliata morphometeric delle spine dendritiche. Cellule coltivate su vetrini coprioggetto 22x22 mm quadrati può quindi essere utilizzata in time-lapse esperimenti di imaging per studiare la dinamica spine dendritiche.

2. Trasfezione di colture di neuroni corticali primari

  1. Neuroni corticali sono transfettate 2-3 giorni prima di esperimenti usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Preparare "h-DMEM" bilanciando il pH della DMEM (Dulbecco Modified Aquila media; non glutammina,Invitrogen 11965-092) con 10 mM HEPES sterile (4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido; Mediatech Cellgro 25-060-CI, 1M, pH 7). Calda a 37 ° C.
  3. Trasferimento coprioggetto a 600/1000 microlitri (18/22x22 coprioggetto mm) pre-riscaldato (37 ° C) nuovo antibiotico-free medio (medio Neurobasal, B27, 0,5 mM glutamina), e le cellule incubare in un umidificata 37 ° C incubatore, integrati con 5% di CO 2 per 30 minuti.
  4. Per ogni vetrino, aggiungere la quantità designata di DNA (uno o più plasmidi DNA, ad esempio pEGFP di delineare la morfologia cellulare e tag-mutante proteina sinaptica; 1-2 mg a seconda del costruire) a 50 ml di DMEM-h, lasciare riposare per 5 minuti.
  5. Per ogni vetrino, aggiungere 4 / 6 microlitri (18/22x22 coprioggetto mm) Lipofectamine 2000-50 microlitri h-DMEM, lasciar riposare per 5 minuti.
  6. Mescolare bene tubi da 1,3 punti e 1.4, conservare per almeno 20 minuti in un umidificata 37 ° C incubatore, integrato con il 5% di CO 2. Complesso è stabile fino a 6 ore a seconda del produttore.
  7. Aggiungi Lipofectamine miscela 2000/DNA dal passo 1,5 goccia a goccia per le cellule. Incubare le cellule in una umidificata 37 ° C incubatore, arricchito con 5% di CO2, per 4 ore.
  8. Utilizzando media di alimentazione a partire dal punto 1.1 (300/600 microlitri), integrare con pre-riscaldato (37 ° C) media 400/800 microlitri di alimentazione fresca (18/22x22 coprioggetto mm). 1,6 passo successivo, coprioggetto trasferimento in mezzo contenente medio alimentazione vecchio e fresco.
  9. Permettere l'espressione di plasmidi di continuare per 2-3 giorni.

3. Trattamento di primaria neuroni corticali in coltura coltivate su vetrini coprioggetto da 18 mm

I neuroni cresciuti del 18 coprioggetto mm, precedentemente transfettate, può anche essere facilmente sottoposti a trattamenti farmacologici.

  1. Preparare ACSF (artificiale liquido cerebrospinale, in mM: 125 NaCl, 2.5 KCl, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 di glucosio, 5 HEPES, 2,5 CaCl 2 e 1,25 MgCl 2 con 200 micron D, L-APV). Calda a 37 ° C. Pre-incubazione coprioggetto in 900 microlitri ACSF caldo per 30-60 minuti. Pre-trattamento con inibitori può essere eseguita durante questo periodo.
  2. Preparare agenti farmacologici / veicolo da soluzioni di riserva ad una concentrazione 10 volte di lavoro; eseguire diluizioni di soluzioni in ACSF. Aggiungere con cautela agente / veicolo a celle (volume finale di 1000 ml, ad una concentrazione finale di 1X agente / veicolo), e consentono il trattamento di portare avanti per il tempo desiderato 5.
  3. Dopo il trattamento (s), fissare le cellule e di processo per immunocytohistochemistry.

4. Fissazione e immunocytohistochemistry (ICC)

  1. Fissare i neuroni sia in formaldeide al 4% / 4% di saccarosio PBS (800 mL) per 20 minuti a temperatura ambiente, o in formaldeide al 4% / 4% di saccarosio PBS (800 mL) per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da lavaggi in PBS 2X , seguita da 10 minuti fissare con pre-raffreddata (-20 ° C) metanolo (800 mL) a 4 ° C. Fissazione metanolo opere di denaturazione e precipitazione delle proteine. Questa procedura porta ad un smascheramento delle proteine ​​nel periodo post-sinaptico densità (PSD), così come in aree ricche di lipidi.
  2. Lavare coprioggetto in PBS (800 microlitri), 2x, per 10 minuti ciascuno.
  3. Permeabilize e contemporaneamente di bloccare le cellule in PBS contenente 2% di siero normale di capra e di 0,1% Triton X-100 (800 microlitri) per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Aggiungi anticorpi primari sollevate contro GFP, epitopo tag (ad esempio, la sua, myc, V5) o proteine ​​endogene, di PBS contenente 2% di siero normale di capra alla concentrazione adeguata. Prendete un piatto di 15 cm, dividerla in quadrati, numero di loro, e coprire con parafilm. Aggiungere circa 80 ml di miscela di anticorpi e il blocco di parafilm (una goccia al quadrato), e coprioggetto luogo il all'anticorpo / blocco mix con le cellule verso il basso. Incubate overnight a 4 ° C.
  5. Lavare coprioggetto in PBS, 3 volte per 15 minuti ciascuno.
  6. Diluire anticorpi secondari coniugati con Alexa (Invitrogen) in PBS contenente 2% di siero normale di capra alla concentrazione adeguata. Incubare gli anticorpi secondari nella stessa maniera come al punto 3.4, a temperatura ambiente per 1 ora, al riparo dalla luce.
  7. Lavare coprioggetto un ulteriore 3x 15 minuti in PBS.
  8. Coprioggetto montare sul microscopio standard diapositive usando Prolungare reagente Oro Antifade (Invitrogen).

5. L'analisi quantitativa delle morfologie colonna vertebrale

Otteniamo immagini confocale di singoli neuroni e doppio macchiato (cellule che esprimono GFP e proteina costruire o endogena di interesse) utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM5 Pascal. Per tutti gli esperimenti di imaging scegliere sano neuroni piramidali di essere ripreso e utilizzato in analisi successive. I neuroni sono cellule sane che non presentano alcun segno di blebbing o disagio a causa di un trattamento o fissazione e che contengono una piena, pergolato ininterrotto dendritiche.

  1. Acquisire immagini di neuroni con un 63x ad immersione in olio obiettivo (Zeiss) con un NA (numapertura erical) di 1,4, come una serie Z di 3-8 immagini in media 4 volte, con intervalli di 0,37 micron, 1024x1024 pixel di risoluzione con una velocità di scansione di 2,5 secondi per ogni sezione. Culture che devono essere direttamente confrontati bisogno di essere ripreso con i parametri di acquisizione stesso. 10-20 neuroni / condizione, ogni 3-5 esperimenti separati, e 2 dendriti di 100 micron per neurone dovrebbero essere analizzati. Esperimenti dovrebbe essere fatto cieco e sulle culture sorella. Regolare il guadagno del rivelatore e offset di inserire spine sottili anche scarsamente fluorescenti senza creare un alone intorno al dendrite, in modo che la transizione tra il segnale fluorescente nella spina dorsale e lo sfondo è nitido, che consente una precisa quantificazione. Mantenere i parametri di acquisizione la stessa per tutte le scansioni all'interno dell'esperimento stesso.
  2. GFP immagini possono essere acquisite tramite una linea di argon laser, emozionante a 488 nm e la raccolta con un filtro passa-banda a 505-530 nm. Immagini di proteine ​​sovra o proteine ​​endogene immunoistochimica con un anticorpo secondario Alexa 568 (Invitrogen) possono essere raccolti utilizzando un laser HeNe emozionante a 543 nm, e la raccolta utilizzando un filtro passa-tempo a 560 nm. Tenere potenze laser al minimo per evitare photobleaching di campioni.
  3. Utilizzando MetaMorph software (Molecular Devices, Inc.), bidimensionale, background-sottratto, ricostruzioni sporgenza massima di Z-series immagini sono utilizzate per l'analisi morfometrica e quantificazione. Per esaminare la morfologia delle spine dendritiche, crollo serie Z immagini, calibrare la distanza richiesta, e poi la soglia di includere tutte le spine in modo che la soglia corrisponde esattamente al profilo delle spine (Fig. 2E, F). Solo su spine dendriti secondari e terziari (lunghezza totale di 100 micron per neurone) dovrebbe essere misurato per ridurre la variabilità, e le misure di segmenti devono essere effettuate tra i punti ramo. Manualmente il profilo di ogni colonna vertebrale in modo che diventi un perimetro chiuso (Fig. 2G).
  4. Misurare i parametri della colonna vertebrale in seguito automaticamente MetaMorph: lunghezza della colonna vertebrale, la larghezza della colonna vertebrale, sezione trasversale, e la densità di spine dendritiche lineare. Esportare i parametri morfometrici spine dendritiche in Excel per la quantificazione. Utilizzare i test non appaiati t di Student per determinare la significatività statistica delle differenze tra i due gruppi; ANOVA può essere usato per confrontare tre o più gruppi, seguiti da b-Tukey post-hoc per confronti multipli. L'analisi statistica può essere eseguita in Excel, GraphPad o SPSS. Analizzare le trame complessivo utilizzando Kolmogorov-Smirnov (KS test) 2,5-6.

6. Quantitativa immunofluorescenza (IF)

Quantificazione di immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici contro proteine ​​sinaptiche, visualizzati utilizzando un anticorpo secondario Alexa 568 (Invitrogen), può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nel clustering e di localizzazione sinaptica endogena proteine ​​sinaptiche.

  1. Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale come descritto sopra. Utilizzare un argon e un laser HeNe (vedi sopra) per doppia immagine macchiata di neuroni. Solo immagine neuroni sani piramidale che non mostrano alcun segno di disagio.
  2. Per le misure di intensità di fluorescenza, sottrarre il fondo corrispondente all'albero dendritiche (Fig. 2I, giallo quadrato) per generare un'immagine "background-sottratto" (Fig. 2J) utilizzando MetaMorph. Allo stesso modo le immagini soglia di includere i cluster con intensità almeno due volte al di sopra del dendrite adiacente (Fig. 2K). Regioni Outline lungo dendriti (100 micron per neurone) utilizzando l'utility "perimetri" (Fig. 2D) e automaticamente misurare la densità lineare (number/100 lunghezza dendrite micron), e l'intensità integrata (IF totale intensità) di ogni cluster sinaptica utilizzando MetaMorph 7-9.
  3. Per misurare il contenuto di relativa spina dorsale di una proteina sinaptica, per prima cosa determinare il clustering proteina GFP soglia dell'immagine per determinare la morfologia della colonna vertebrale (Fig. 2E, F) utilizzando MetaMorph. Trasferimento alle regioni di interesse che includono solo spine alle immagini della proteina di interesse catturato nel canale (Fig. 2G, H). Contare il numero di cluster proteine ​​e misurare l'intensità di immunofluorescenza integrato all'interno spine per valutare contenuto proteico della colonna vertebrale.
  4. Esportare il SE parametri di proteine ​​sinaptiche in Excel per la quantificazione. Utilizzare i test non appaiati t di Student per determinare la significatività statistica delle differenze tra i due gruppi; ANOVA può essere usato per confrontare tre o più gruppi, seguiti da b-Tukey post-hoc per confronti multipli. L'analisi statistica può essere eseguita in Excel, GraphPad o SPSS.

7. Time-lapse imaging

Per esaminare le dinamiche spine dendritiche, come le modifiche della motilità della colonna vertebrale o nella morfologia della colonna vertebrale di spine singoli, in presenza o assenza di proteine ​​sinaptiche associate alla malattia, crescono primario neuroni corticali coltivati ​​su coprioggetto 22x22 mm quadrati per DIV 24-28. Neurons possono essere a doppio trasfettate con GFP / mCherry per definire la morfologia delle cellule, e fluorescente tag mutante proteine ​​sinaptiche come descritto sopra. Per tutti gli esperimenti di imaging, scegliere sano neuroni piramidali che esprimono entrambi i costrutti, queste cellule possono essere sottoposti a trattamento farmacologico, fotografato e utilizzato in analisi successive.

  1. Pre-incubazione neuroni coltivate su vetrini coprioggetto 22x22 millimetri in 1,5 ml ACSF per 30-60 minuti in un umidificata 37 ° C incubatore, integrato con il 5% di CO 2. Le cellule possono anche essere pre-trattati con farmaci a questo punto pure. Pre-incubation/treatment seguito, le cellule trasferimento in una camera chiusa fase di imaging (Warner, RC-30HV). Mantenere una temperatura di 37 ° C con una unità di controllo (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Per esaminare la motilità della colonna vertebrale, pre-trattamento di cellule con farmaci o di un veicolo per un massimo 30-60 minuti prima di trasferire le cellule alla camera di imaging. Questo permette un tempo sufficiente per la droga / veicolo di avviare percorsi di secondo messaggero all'interno del neurone. Acquisire le immagini attraverso un obiettivo 63x (Ziess, NA 1,4) con una media di 2X ad intervalli di 10 minuti. Scegli neuroni sani, nel complesso, morfologie piramidale che esprimono GFP / mCherry o fluorescente-tagged proteine. Per ridurre al minimo fotodanneggiamento, riducendo la potenza del laser per 0,5-1%. I confronti di veicoli trattati con farmaci contro cellule trattate a dimostrare i cambiamenti della motilità della colonna vertebrale. In alternativa, la motilità della colonna vertebrale possono essere valutati prima e dopo il trattamento, per perfusione del farmaco / veicolo (vedi sotto). Raccogliere Z-stack in ogni punto del tempo.
  3. Per tenere traccia dei cambiamenti nella morfologia spine dendritiche nel corso del tempo, lamelle immagine per 1 ora per determinare le variazioni di base della morfologia. A questo punto, profumato il farmaco / veicolo nella camera di imaging utilizzando una pompa peristaltica (Gilson, Minipuls 3), e neurone immagine per un'altra ora. Acquisire confocale Z-stack utilizzando un obiettivo 63x olio (Ziess, NA 1,4), con 2X media ogni 10 minuti. Ridurre la potenza del laser per 0,5-1% per minimizzare fotodanneggiamento.
  4. Alla fine di ogni sessione di imaging, ottenere un 20X immagine del neurone intero accertare il livello di fotodanneggiamento. Qualsiasi neuroni mostrano segni di sofferenza deve essere omessa dalla quantificazione. Z-pile di ogni time-point dovrebbero essere crollati in proiezioni in 2D Metamorph. A seconda della qualità dell'immagine e il livello di transfezione, un filtro passa-mediana o sottrazione del fondo possono essere applicati in Metamorph per produrre immagini chiare per l'analisi.
  5. Per valutare il morphing e la motilità della colonna vertebrale, le immagini scattate ad inizio, metà e fine della sessione di imaging 100 minuti devono essere colorati e sovrapposti in MetaMorph. Almeno 100 micron di dendrite per cella devono essere analizzati. Il totale frazione motilità della colonna vertebrale è definita come il numero totale di eventi motilità, cioè l'estensione, retrazione, testa morphing o motilità protrusiva normalizzato al numero della colonna vertebrale 6,11. Questo metodo misura la frequenza degli eventi, senza considerare le loro grandezze, ma le piscine di tutti i tipi di eventi, ed è una stima generale della motilità generale. Un evento protrusiva è definita come la comparsa di una nuova sporgenza transitoria da una testa di colonna vertebrale o albero dendritiche. Un evento di retrazione è definita come la scomparsa di una protrusione esistente o transitorio trova su una testa di colonna vertebrale o albero dendritiche. La somma degli eventi protrusione ed estensione sono divisi per il numero totale di spine nella regione di dendrite che è quantificato.
  6. Per valutare i cambiamenti nella morfologia della colonna vertebrale individuale in risposta al trattamento farmacologico, misurare la sezione trasversale di spine dendritiche, o densità di spine dendritiche lineare nelle ore di tempo punto -1 (1 ora prima di perfusione), che precede immediatamente il trattamento e ad ogni successivo punto temporale trattamento. Normalizzare ogni volta al punto 1 prima hr-to-trattamento punto di tempo. Per determinare che i cambiamenti nella morfologia spine dendritiche o la densità lineare non erano dovuti a fotodanneggiamento, analizzare i neuroni perfusi con il veicolo. Le differenze di mezzo può essere determinata dai test appaiati t di Student o un campione t test.

8. Approcci alternativi e chiavi del successo

  1. Abbiamo descritto i neuroni corticali coltura in presenza di D, L-APV, un inibitore del recettore NMDA, da DIV 4 fino a scadenza (DIV24-28). Va notato che, mentre i neuroni corticali coltura in presenza di D, L-APV ha il vantaggio di mantenere la buona salute delle culture neuronali corticali a lungo termine, la presenza di D, L-APV può influenzare lo sviluppo delle sinapsi. Come tale alternativa è quella di neuroni cultura in assenza di D, L-APV 2,5. Quando i neuroni coltura in assenza di D, L-APV particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla salute generale delle culture, in quanto vi è una probabilità aumento di morte cellulare a causa di un eccessivo citotossicità Ca2 + tramite iperattiva l'attivazione del recettore NMDA.
  2. Le culture neuronali descritti in questo protocollo può essere usato per esaminare i meccanismi che sono rilevanti per la regolazione della morfologia e la motilità della colonna vertebrale dendritiche dei dendritic spine visualizzazione di una morfologia matura (cioè formano connessioni con pre-sinaptica partner, ed avere una chiara testa struttura simile) 2,4,5. In alternativa, uso di colture in un precedente momento-point, per esempio DIV11-16, può essere più adatto ad affrontare questioni rilevanti per la formazione delle spine dendritiche, o regolamento di spine dendritiche durante lo sviluppo iniziale.
  3. Un'alternativa per l'utilizzo del microscopio confocale, è quello di utilizzare a grande campo epi-fluorescenza per acquisire immagini di colture di neuroni corticali trattati. In combinazione con gli algoritmi di deconvoluzione del caso, una dettagliata analisi morfometrica di spine può essere effettuata in cellule fisse o dal vivo. Inoltre, è possibile utilizzare software alternativi come ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) o Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ), che sono software libero, per l'analisi della morfologia spine dendritiche.
  4. In sede di esame della motilità della colonna vertebrale dendritiche / morphing con time-lapse imaging, va rilevato che l'utilizzo di brevi intervalli di tempo-intervallo, per esempio 5-10 minuti, può fornire un'analisi molto più dettagliata delle spine dendritiche turnover2, 5. L'uso di intervalli di tempo più brevi possono inoltre individuare le forme più rapido della colonna vertebrale morphing che non sarebbero rilevati utilizzando intervalli di tempo più lungo.
  5. L'uso di colture di neuroni corticali ha una serie di svantaggi e le preoccupazioni che devono essere prese in considerazione. In primo luogo, una preoccupazione di utilizzare colture di neuroni corticali è che ci può essere variabilità tra le culture che possono influenzare i parametri come la densità di spine dendritiche. Come tale, è essenziale che i seguenti punti sono accuratamente aderito a garantire la quantità minima di variabilità. In primo luogo, i parametri di coltura e reagenti deve essere il più coerente possibile, oltre a buone pratiche di coltura, questo ridurrà di molto il livello di variabilità tra le culture. In secondo luogo, è essenziale che tutti gli esperimenti devono essere effettuati allo stesso tempo-point, e sulle culture sorella. Inoltre, il tempo-punto in cui vengono eseguiti gli esperimenti devono essere scelti con cura per consentire lo sperimentatore di porre le domande appropriate (vedi punto 2). Infine, è fondamentale che controlli adeguati sono utilizzati in tutti gli esperimenti, in modo che le condizioni di trattamento sono sempre esaminati relativamente a questi controlli interni. Questo rimuoverà qualsiasi preoccupazione di variabilità tra le culture.
  6. L'uso di colture di neuroni corticali è un potente strumento per consentire ai ricercatori di esaminare criticamente i meccanismi che sono essenziali per la regolazione della morfologia e la motilità della colonna vertebrale dendritiche. Tuttavia, è importante notare che queste culture non recapitulate uno nella situazione in vivo, e componenti quali l'organizzazione strato corticale e l'effetto di altri tipi di cellule, come le cellule gliali, sulla formazione delle sinapsi non possono essere affrontati nel sistema descritto sopra. Tuttavia, un tale sistema può essere utilizzato per identificare meccanismi potenzialmente cruciale alla base della regolazione della morfologia e la motilità della colonna vertebrale dendritiche.

9. Rappresentante Risultati

I saggi di cui sopra sono stati progettati per studiare le modifiche in dendritiche morfologia della colonna vertebrale, il numero e la motilità in risposta a trattamenti farmacologici e / o manipolazioni genetiche della funzione della proteina in vitro. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato queste tecniche per caratterizzare il ruolo delle proteine ​​sinaptiche che regolano il citoscheletro di actina in spine dendritiche, alterando così la loro struttura 2,9. Inoltre, abbiamo usato questo test per determinare come i composti neuroattivi, come neuromodulatori possono guidare i cambiamenti in dendritiche morfologia della colonna vertebrale, il numero o la forma, da solo 4,6,10, o in presenza di attività-dipendente stimoli 5.

Per valutare l'accuratezza delle nostre misurazioni dei parametri 1D o 2D, abbiamo misurato i diametri e le aree di microsfere fluorescenti lattice (duca Scientifica) di dimensioni note (0,2, 0,52, 1,0 micron) montato nelle stesse condizioni, come i neuroni durante lo studio. Utilizzando le condizioni di imaging come per le misurazioni della colonna vertebrale (63x NA = 1.4 olio-immersion obiettivo, LSM 5 Pascal) abbiamo ripreso le microsfere, e poi determinato la loro diametri e le aree in Metamorph, anch'esso con le nostre misurazioni colonna vertebrale. Abbiamo quindi confrontato le misure reali con le dimensioni delle microsfere.

Il grafico in figura 1 (Fig.1) mostra che si possa misurare con precisione le aree di microsfere di 0,52 e 1,0 micron (aree 2 = 0,21 micron e 0,78 micron 2 rispettivamente) (deviazione standard misurato ~ 15%; produttori determinata deviazione standard ~ 9%). Anche per le microsfere 0,2 micron nostre misurazioni sono state abbastanza vicina alle dimensioni reali (anche se con grandi SD). Ciò è coerente con la risol calcolato laterale distribuzione pesi del nostro microscopio confocale utilizzando questo particolare obiettivo, 0,3 micron (utilizzando l'equazione Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Questo è significativamente migliore rispetto alla risoluzione assiale, che è noto per essere poveri per microscopi confocale e 2-fotone. Inoltre, abbiamo determinato sperimentalmente il laterale (x / y asse) funzione di diffusione del punto (PSF) misurando verde fluorescente microsfere di diametro 200 nm (Duke scientifico) da ~ 0,5 micron. Questa stima è stata effettuata con il foro aperto, e quindi si può presumere che quando il foro è chiuso, che la FPF sarebbe in realtà più piccole. Tuttavia, questo indica ancora una volta che siamo in grado di misurare con precisione superficie superiore a 0,196 micron 2 (diametro = 0,5 micron). L'indicazione della reale FPF laterale è data in (Svoboda et al.) 13 come "non molto inferiore a 0,4 micron, che si tradurrebbe in una superficie di 0,16 micron 2". Questi confronti e considerazioni teoriche indicano che siamo in grado di misurare con precisione le aree di oggetti di dimensioni simili a spine, dal momento che le dimensioni delle spine abbiamo misurato era più grande di questo limite di risoluzione (> 0,25 micron 2). Per tali condizioni, "classico tecniche morfometriche sono di tipo quantitativo" 13, indicando che si può attendibilmente valutare le aree della colonna vertebrale, e con precisione confrontare morfologie della colonna vertebrale nelle diverse condizioni di trattamento.

Al fine di misurare con precisione la morfologia dendritica colonna vertebrale, abbiamo transfettate DIV 23 neuroni corticali con un costrutto EGFP per 2 giorni. A seguito di trasfezione, le cellule possono essere sottoposti a trattamento, e sono fissati e trattati per ICC, in cui è migliorato il segnale GFP per consentire una distribuzione uniforme in tutto il dendrite (o neurone). La Figura 2 mostra un'immagine rappresentativa di un neurone corticale trasfettate con GFP, fotografato con un microscopio confocale con un obiettivo 63x (NA 1,4) (Fig. 2A). Questo permette di dettagliate immagini ad alta risoluzione delle spine dendritiche (Fig. 2B). Dettagliata analisi morfometriche delle spine dendritiche vengono eseguiti nel nostro laboratorio utilizzando il programma Metamorph. Questo programma ci permette non solo di misurare la morfologia dendritica colonna vertebrale, ma anche di esaminare la localizzazione delle proteine ​​endogene. Una panoramica di come effettuare questa analisi è fornita in figura 2 (Fig. 2C-G).

Un effetto ben caratterizzate di attività-dipendente stimoli è un aumento della dimensione spine dendritiche 2. La figura 3 mostra rappresentante time-lapse imaging di una spina dendritica di un EGFP 24 neurone corticale DIV esprimere, fotografato per 30 minuti prima e dopo una attività-dipendente stimolo. Questo time-lapse esperimento conferma che l'attività-dipendente stimoli aumentare le dimensioni della colonna vertebrale dendritiche (Fig. 3A, B). Per esaminare la motilità basale della colonna vertebrale, le immagini sono state acquisite in momenti 0, 50 e 100 minuti, e le estensioni della colonna vertebrale, ritrattazioni, la motilità e la testa protrusiva morphing sono stati misurati separatamente e combinati come motilità totale. Figura 3C-D conferma che anche in condizioni basali, le spine dendritiche dei neuroni corticali visualizzare un certo livello di motilità.

Figura 1
Fig. 1. Confronto tra le aree misurate e reali di microsfere fluorescenti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard delle aree misurato. Immagini di microsfere di 0,2 micron, 0,52 micron e 1 micron. Barra di scala = 5 micron.

Figura 2
Fig. 2. Quantificazione della morfologia della colonna vertebrale e IF. Immagine di A. DIV 25 EGFP che esprimono colta neuroni corticali. Ingrandimenti B. Alto tipica morfologia delle spine dendritiche trovato sui neuroni corticali. C. EGFP e proteine ​​endogene (GluR1) overlay. D. Collapsed serie Z di un EGFP transfettate piramidale dendriti delle cellule, la divisione tra l'albero e spine è tracciata manualmente E. distinte, le regioni superthreshold sono poi delineato da Metamorph e quantificato F. mano tracciata neuroni utilizzati per determinare la lunghezza della colonna vertebrale, larghezza e sezione trasversale G. regioni determinate... da Metamorph che corrispondono a spine. contorni Spine H. saranno trasferiti l'immagine del canale rosso (proteina endogena) per quantificare colonna vertebrale specifico segnale. IK. Per quantificare recettore o cluster di proteine ​​sinaptiche SE, proiezione di immagini della serie Z sono utilizzati. sfondo albero I. dendritiche IF (quadrato giallo) viene sottratto per generare un "background-sottratto" l'immagine. J. Questa immagine è poi thresholded e il programma automaticamente misure zona a grappolo, la densità lineare, grigio e valore totale (IF intensità) K. immagine Thresholded da bar Scala H., A = 15 micron, B = 1 micron.

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Fig. 3. Attività-dipendente cambiamenti nella morfologia della colonna vertebrale, e la motilità basale di spine dendritiche. A. Time-lapse imaging di una spina dorsale rappresentante dendritiche prima e dopo l'aggiunta di una attività-dipendente stimolo. Attività-dipendente stimoli sono state indotte dal passaggio dei media sperimentale ASCF contenenti Mg2 + e APV per ACSF senza Mg2 + e APV, ma contenente 10 micron quantificazione glicina B. zona spine dendritiche (dimensione), normalizzato a punto tempo -30 minuti (30 minuti prima di perfusione). C. Rappresentante immagini dei punti di tempo 0, 50 e 100 minuti di motilità spine dendritiche. Immagini in alto mostra sovrapposizione di 0 (rosso), 50 (verde) e 100 (blu) punti di tempo minuto, mentre le immagini qui sotto sono ogni tempo separatamente. Asterisco indica estensione della colonna vertebrale; freccia bianca indica retrazione della colonna vertebrale; testa freccia verde indica la motilità protrusiva; aperto punta della freccia gialla indica la testa della colonna vertebrale morphing D. Quantificazione dei parametri dendritiche motilità della colonna vertebrale e la motilità totale E. 20X immagine dei neuroni corticali che esprimono immagini seguenti EGFP.. sessione di determinare la salute delle cellule.

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Le tecniche descritte sopra per la dettagliata analisi quantitativa della morfologia spine dendritiche, densità lineare e la motilità sia in neuroni primari fissa o vivere corticali sono focalizzati sulla comprensione degli effetti di post-sinaptico meccanismi che possono contribuire alla neuropatologie. Un approccio simile può essere utilizzato per quantificare la morfologia e la motilità della colonna vertebrale in qualsiasi neuroni spinosi, tra cui piramidali dell'ippocampo, Purkinje, o neuroni spinosi di media.

Il protocollo qui descritto può essere adattato a guardare le proprietà fondamentali delle proteine ​​sinaptiche e / o gli effetti dei trattamenti farmacologici su spine dendritiche. Inoltre, può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella localizzazione di proteine ​​endogene proteine ​​sinaptiche che vanno da impalcatura a recettori del glutammato. Inoltre, permette non solo un'analisi dettagliata morfometrica di spine fisse, ma anche la misurazione degli effetti delle proteine ​​sinaptiche o trattamento farmacologico sulla motilità spine dendritiche. Questi time-lapse tecniche di imaging possono anche essere modificati per esaminare il traffico di proteine, con o senza contemporaneamente esaminando morfologia dendritica colonna vertebrale.

Analisi dettagliata della morfologia e la motilità della colonna vertebrale dendritiche è uno strumento essenziale per lo studio degli effetti potenziali di mutanti proteine ​​sinaptiche, e come le mutazioni in queste malattie associate proteine ​​sinaptiche possono influenzare la struttura delle sinapsi e la funzione, contribuendo in tal modo la fisiopatologia di un certo numero di disturbi di il cervello.

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Disclosures

La produzione di questo lavoro è stato sostenuto da MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).

Acknowledgments

Ringraziamo Kelly Jones per l'editing accurato. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01MH 071316, l'Alzheimer Association, l'Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Schizofrenia e Depressione (NARSAD), e l'Alleanza Nazionale per la Ricerca Autismo (NAAR) (PP); American Heart Association borsa di studio post-dottorato (DPS); americano Heart Association Fellowship Predoctoral (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

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References

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Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC
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Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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