Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Analys av Dendritiska Spine Morfologi i odlade CNS Neuroner

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

Många nyare studier har identifierat mutationer i synaptiska proteiner associerade med hjärnan sjukdomar. Primär odlade kortikala neuroner ger stor flexibilitet för att undersöka effekterna av dessa sjukdomar associerade proteiner på dendritiska ryggraden morfologi och motilitet.

Abstract

Dendritutskotten är platsen för de flesta av excitatoriska kopplingar i hjärnan, och utgör den postsynaptiska fack av synapser. Dessa strukturer är rika på aktin och har visat sig vara mycket dynamisk. Som svar på klassiska Hebbianskt plasticitet samt signaler neuromodulatory kan Dendritutskotten ändra form och antal, som tros vara avgörande för förädling av nervbanor och bearbetning och lagring av information i hjärnan. Inom Dendritutskotten, ett komplext nätverk av proteiner länk extracellulära signaler med aktin cyctoskeleton möjliggör styrning av dendritiska ryggraden morfologi och nummer. Neuropatologiska studier har visat att ett antal sjukdomstillstånd, allt från schizofreni till autismspektrumstörningar, visa onormala dendritiska ryggraden morfologi eller siffror. Dessutom har senare tids genetiska studier identifierades mutationer i flera gener som kodar synaptiska proteiner, vilket leder till förslag att dessa proteiner kan bidra till avvikande ryggraden plasticitet som delvis ligger till grund för patofysiologin vid dessa sjukdomar. För att studera vilken roll dessa proteiner i kontrollen av dendritiska ryggraden morfologier / nummer ger användningen av odlade kortikala neuroner flera fördelar. För det första kan detta system för högupplöst avbildning av Dendritutskotten i fasta celler samt tidsförlopp avbildning av levande celler. För det andra ger detta in vitro-system för enkel hantering av proteiners funktion genom uttryck av muterade proteiner, ÖVERVÄLDIGANDE av shRNA konstruerar eller farmakologisk behandling. Dessa tekniker tillåter forskare att börja dissekera betydelsen av sjukdomar associerade proteiner och att förutse hur mutationer av dessa proteiner kan fungera in vivo.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som beskrivs här kan användas för att undersöka dendritiska ryggraden morfologi och dynamik i alla primära odlade system.

1. Beredning av primär kortikal neuron kulturer

  1. Förbered hög densitet kortikala neuron kulturer från Sprague-Dawley råtta E18 embryon och kultur i Glia med luftkonditionering serumfritt medelstora 1-2.
  2. Euthanize en dräktig råtta (E18) enligt ACUC förfaranden, snabbt ta bort livmodern (med foster i den) och placera i en 100 mm petriskål på is.
  3. Skär öppna livmodern och fosterhinnan, håller fostret vid halsen (navelsträngen intakt) med en pincett, använda en annan pincett att skala hårbotten bakifrån och framåt, och skära skallen öppnas med en vass pincett spets längs mittlinjen bakifrån och framåt.
  4. Ta bort hela hjärnan med en böjd pincett (i en skopa motion) och placera i en 100 mm petriskål som innehåller 10 ml iskall Ca2 + - och Mg 2 +-fri HBSS.
  5. Håll hjärnstammen med en pincett, separat halvklot med en annan tång, ta bort hippocampus och striatum, separat cortex och försiktigt skala kortikala vävnad bort från hjärnhinnorna.
  6. Pool dissekerade kortikal vävnad, skräder kort och överför till en 15 ml tub innehåller 4 ml förvärmda trypsin / EDTA (0,25% trypsin, 0,53 mM EDTA; HyQ Trypsin från HyClone SH30042.01), inkubera i 37 ° C vattenbad för ~ 15 min, avlägsna trypsin / EDTA så mycket som möjligt med en disponibel plastpipetten, tillsätt 1,5 ml neuronala medium.
  7. Dissociera de uppdelade vävnader mekaniskt genom försiktig pipettering med en 5 ml-pipetten (~ 10 slag, undvika att skapa luftbubblor), tillsätt 2 ml medium, låt nöja 30 sek, sedan överföra 2 ml supernatanten i ett 15 ml rör.
  8. Upprepa steg 6 gånger (tar ungefär ~ 15 min totalt).
  9. Spin cellsuspension på 200g i 2 min.
  10. Avlägsna supernatanten (med en 5 ml pipett - inte vakuum aspirera), lossa pellets genom att bläddra med fingrarna mot botten; resuspendera cellpelleten i 5 ml medium och filtrera genom ett 40 ìm cell sil i ett 50 ml rör.
  11. Blanda 10 l cellsuspension och 10 l trypan blå; Räkna livskraftiga celler (trypan blå utslagning) med en hematocytometer.
  12. Typiska Direktavkastning: 5 x 10 6 celler / hjärnan, späd till önskad densitet (t ex 1,5 x 10 6 celler / ml) för plätering.
  13. Fyll odlingsplattor med plätering media (Neurobasal media kompletteras med 2% B27, 0,5 mM glutamin och 1% penicillin: stretomycin) (totala volymen minus plätering volym) med 18 mm rund eller 22x22 mm fyrkant täckglas, täckta med poly-D-lysin ( 0,2 mg / ml, Sigma) löst i 0,1 M boratbuffert (3,1 g / L Borsyra, 4,8 g / L borax, 8,5 pH, filtersteriliserad), totala volymen för 12-brunnar = 0,8 ml / brunn.
  14. Tavla nervceller vid täthet som i nästa steg, skingra celler jämnt genom att försiktigt gungande / knacka.
  15. För 12-brunnars plattor (3,5 cm 2 / brunn): (hi-density 3 x 10 5 / brunn = 857/mm 2) (mitten av densitet 1,5 x 10 5 / brunn = 430/mm 2), 6-brunnars plattor (9.6cm 2 / brunn): (hi-täthet 9 x 10 5 / brunn = 624/mm 2) (mitten av densitet 4,5 x 10 5 / brunn = 312/mm 2).
  16. En timme efter plätering, ersätta alla medium med färska medium (Neurobasal media kompletteras med 2% B27, 0,5 mM glutamin och 1% penicillin: stretomycin). Eftersom cellfragment tenderar att bosätta sig i mitten av väl, snurra tallrikar första som underlättar borttagning av skräp, vara noga med att inte låta cellerna torka när som helst.
  17. Ändra ½ medelstora två gånger varje vecka därefter (ta bort ~ 300-350 l från varje brunn, och tillsätt 400 l värmde färska utfodring i varje brunn).
    Tillval: På DIV 4 tillsätt 200 mikroM D, L-amino-phosphonovalerate syra (D, L-APV, Ascent Scientific) för utfodring medium; kultur nervceller i Neurobasal medelstora kompletterad med 2% B27, 0,5 mM glutamin och 1% penicillin: stretomycin + 200 mikroM APV.
  18. Odla primära kulturer av kortikala neuroner i 24-28 dagar in vitro (DIV), som vid denna tid-punkt Dendritutskotten visa en mogen morfologi (dvs de bildar anslutningar med presynaptisk partners och har ett klart huvud-liknande struktur) och motsvarar tidiga tonåren hos gnagare 3-4. Nervceller som odlas på 18 täckglas mm runda kan tranfected och behandlas farmakologiskt, innan det fast, immunostained och avbildas med en konfokalmikroskop och används för detaljerad morphometeric analys av Dendritutskotten. Celler odlas på 22x22 mm stora täckglas kan sedan användas i tidsförlopp imaging experiment för att undersöka dendritiska ryggraden dynamik.

2. Transfektion av primär odlade kortikala neuroner

  1. Kortikala nervceller är transfekterade 2-3 dagar innan experiment med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Förbered "H-DMEM" genom att balansera pH-värdet i DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium, ingen glutamin,Invitrogen 11965-092) med 10 mM steril HEPES (4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazineethanesulfonic syra, Mediatech Cellgro 25-060-CI, 1M, pH 7). Varm till 37 ° C.
  3. Överföring täckglas till 600/1000 l (18/22x22 mm täckglas) förvärmda (37 ° C) nya antibiotika-fria medium (Neurobasal medium, B27, 0,5 mM glutamin) och inkubera celler i en fuktig 37 ° C inkubator, kompletterat med 5% CO 2 i 30 minuter.
  4. För varje täckglas, tillsätt utsedda mängd DNA (en eller flera plasmider DNA, t.ex. pEGFP att beskriva cellmorfologin och märkta-mutant synaptiska protein, 1-2 mikrogram beroende på konstruktion) till 50 ìl av h-DMEM, låt stå i 5 minuter.
  5. För varje täckglas, tillsätt 4 / 6 l (18/22x22 mm täckglas) Lipofectamine 2000 till 50 l h-DMEM, låt stå i 5 minuter.
  6. Blanda rör från stegen 1,3 & 1,4, under minst 20 minuter i en fuktig 37 ° C inkubator, kompletterat med 5% CO 2. Komplexa är stabil i upp till 6 timmar enligt tillverkaren.
  7. Lägg Lipofectamine 2000/DNA blandningen från steg 1,5 droppvis till celler. Inkubera cellerna i en fuktig 37 ° C inkubator, kompletterat med 5% CO2 i 4 timmar.
  8. Använda utfodring medium från steg 1.1 (300 / 600 l), komplettera med förvärmda (37 ° C) 400/800 l färska utfodring medium (18/22x22 mm täckglas). Efter steg 1,6, överföring täckglas i ett medium som innehåller gamla och färska utfodring medium.
  9. Tillåt uttryck för plasmider för att fortsätta i 2-3 dagar.

3. Behandling av primär odlade kortikala nervceller som odlas på 18-mm täckglas

Nervceller som odlas på 18 mm täckglas, tidigare transfekterade, kan också lätt utsättas för farmakologisk behandling.

  1. Förbered ACSF (artificiell cerebrospinalvätska, i mm: 125 NaCl, 2,5 KCl, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glukos, 5 HEPES, 2,5 CaCl 2 och 1,25 MgCl 2 med 200 mikroM D, L-APV). Varm till 37 ° C. Pre-inkubera täckglas i 900 l varmt ACSF i 30-60 minuter. Förbehandling med inhibitorer kan utföras under denna tid.
  2. Förbered farmakologiska agenter / fordon från lager lösningar till ett 10X arbeta koncentration; utföra spädningar av lösningar i ACSF. Tillsätt försiktigt agent / fordon till celler (slutlig volym på 1000 l, till en slutlig koncentration av 1X agent / fordon) och låt behandling pågå i önskad tid 5.
  3. Efter behandling (s), fixa celler och process för immunocytohistochemistry.

4. Fixering och immunocytohistochemistry (ICC)

  1. Fix nervceller i antingen 4% formaldehyd / 4% sackaros PBS (800 l) i 20 minuter i rumstemperatur eller i 4% formaldehyd / 4% sackaros PBS (800 l) i 10 minuter vid rumstemperatur, följt av 2X tvättar i PBS , följt av 10 minuter fixa med redan kyld (-20 ° C) metanol (800 l) vid 4 ° C. Metanol fixering fungerar genom att denaturera och utlösande proteiner. Detta förfarande leder till ett avslöjande av proteiner i postsynaptiska densitet (PSD), liksom i lipid-rika områden.
  2. Tvätta täckglas i PBS (800 l), 2x, i 10 minuter vardera.
  3. Permeabilize och blockera celler samtidigt i PBS innehållande 2% normal get serum och 0,1% Triton-X-100 (800 l) för 1 timme i rumstemperatur.
  4. Lägg primära antikroppar som riktats mot GFP, epitop tagg (t.ex. Hans, Myc, V5) eller kroppsegna proteiner, till PBS innehållande 2% normal get serum vid lämplig koncentration. Ta en 15 cm parabolantenn, dela upp den i fyrkanter, numrera dem och täck med parafilm. Tillsätt ca 80 l av antikroppar och blockera blandningen parafilm (en droppe per kvadrat), och placera täckglas till antikropp / blockera blanda med celler nedåt. Inkuberas över natten vid 4 oC.
  5. Tvätta täckglas i PBS, 3x i 15 minuter vardera.
  6. Späd Alexa-konjugerade sekundära antikroppar (Invitrogen) i PBS innehållande 2% normal get serum vid lämplig koncentration. Inkubera sekundära antikroppar på samma sätt som i steg 3,4, i rumstemperatur i 1 timme, skyddat från ljus.
  7. Tvätta täckglas ytterligare 3x 15 minuter i PBS.
  8. Mount täckglas på standard objektglas med Förläng Guld antifade reagens (Invitrogen).

5. Kvantitativ analys av ryggraden morfologier

Vi får konfokala bilder av enkel-och dubbel-färgade neuroner (celler som uttrycker GFP och konstruera eller endogena proteinet av intresse) med en Zeiss LSM5 Pascal konfokalmikroskop. För alla imaging experiment välja hälsosamma pyramidala nervceller som ska avbildas och används i efterföljande analys. Friska nervceller är celler som inte visar några tecken på blebbing eller oro på grund av behandling eller fixering och som innehåller en fullständig, oavbruten dendritiska berså.

  1. Förvärva bilder av nervceller med hjälp av en 63x olje-nedsänkning mål (Zeiss) med en NA (numerical bländare) på 1,4, som en Z-serie av 3-8 bilder, i genomsnitt fyra gånger, med 0,37 ìm mellanrum, 1024x1024 pixlars upplösning vid en skanningshastighet på 2,5 sekunder per avsnitt. Kulturer som är direkt jämföras måste avbildas med samma förvärvet parametrar. 10-20 nervceller / skick, varje 3 till 5 olika experiment, och 2 dendriter på 100 ìm per neuron bör analyseras. Experiment bör göras blinda och syster kulturer. Justera detektorn förstärkning och offset till att omfatta även svagt fluorescerande tunna ryggar utan att skapa en gloria runt Dendrite, så att övergången mellan fluorescerande signal i ryggraden och bakgrunden är skarp, som möjliggör exakt kvantifiering. Håll förvärvet parametrarna desamma för alla scanningar inom samma experiment.
  2. GFP bilder kan förvärvas med hjälp av en argon laser linje, spännande vid 488 nm och samla in med ett bandpassfilter på 505-530 nm. Bilder av överuttryckt proteiner eller kroppsegna proteiner immunostained med en Alexa 568 sekundär antikropp (Invitrogen) kan samlas in med hjälp av en HeNe laser spännande på 543 nm, och samla in med hjälp av en lång-pass filter vid 560 nm. Håll laser befogenheter till ett minimum för att undvika fotoblekning av prover.
  3. Använda metamorfa programvara (Molecular Devices, Inc.), två-dimensionell,-bakgrund subtraheras, är maximal projektion rekonstruktioner av Z-serie bilder som används för morfometriska analys och kvantifiering. För att undersöka morfologier av Dendritutskotten, kollaps Z-serie bilder, kalibrera det nödvändiga avståndet och sedan tröskel att ta med alla taggar på ett sådant sätt att tröskeln exakt motsvarar kontur taggar (bild 2E, F). Bara ryggar på sekundär och tertiär dendriter (total längd av 100 ìm per neuron) bör mätas för att minska variabilitet och mätningar av segment behöver göras mellan gren poäng. Manuellt beskriva varje ryggraden så att det blir en sluten omkrets (fig. 2G).
  4. Mät följande ryggraden parametrar automatiskt i metamorfa: ryggrad längd, rygg bredd, tvärsnittsarea, och dendritiska ryggraden linjär densitet. Exportera dendritiska ryggraden morfometriska parametrar till Excel för kvantifiering. Använd Students oparade t tester för att fastställa den statistiska signifikansen av skillnader mellan två grupper, en-vägs ANOVA kan användas för att jämföra tre eller fler grupper, följt av Tukey-b post hoc för multipla jämförelser. Statistisk analys kan utföras i Excel, GraphPad eller SPSS. Analysera kumulativa tomter med Kolmogorov-Smirnov test (KS test) 2,5-6.

6. Kvantitativa immunofluorescens (IF)

Kvantifiering av immunofluorescens med antikroppar mot specifika synaptiska proteiner, visualiseras med en Alexa 568 sekundär antikropp (Invitrogen), kan användas för att undersöka förändringar i klustring och synaptic lokalisering av endogena synaptiska proteiner.

  1. Hämta bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop som beskrivits ovan. Använd en argon och en HeNe laser (se ovan) för att bilden dubbel-färgade nervceller. Endast bild friska pyramidala nervceller som inte visar några tecken på ångest.
  2. För fluorescensintensitet mätningar, subtrahera bakgrunden motsvarar dendritiska axeln (bild 2I, gul fyrkant) för att generera en "bakgrund-korrigerad" bild (bild 2J) med hjälp av metamorfa. Lika tröskeln bilder till bland annat kluster med intensitet minst två gånger högre än den intilliggande Dendrite (bild 2K). Disposition regioner längs dendriter (100 ìm per neuron) att använda "perimetrar" utility (Fig. 2D) och automatiskt mäter linjära tätheten (antal/100 ìm Dendrite längd) och integrerad intensitet (total om intensitet) för varje synaptiska kluster med hjälp av metamorfa 7-9.
  3. För att mäta relativ ryggraden innehållet i en synaptisk protein, först bestämma protein klustring av tröskling GFP bilden för att avgöra ryggraden morfologi (bild 2E, F) med hjälp av metamorfa. Överför regioner av intresse som bara innehåller taggar till bilder av proteinet av intresse fångas i den andra kanalen (Fig. 2G, H). Räkna antalet av protein kluster och mäta immunofluorescens integrerade intensiteten inuti ryggar för att bedöma innehåll ryggraden protein.
  4. Exportera Om parametrar av synaptiska proteiner i Excel för kvantifiering. Använd Students oparade t tester för att fastställa den statistiska signifikansen av skillnader mellan två grupper, en-vägs ANOVA kan användas för att jämföra tre eller fler grupper, följt av Tukey-b post hoc för multipla jämförelser. Statistisk analys kan utföras i Excel, GraphPad eller SPSS.

7. Tidsförlopp imaging

För att undersöka dendritiska ryggraden dynamik, såsom förändringar i ryggraden motilitet eller i ryggraden morfologi individuella taggar, i närvaro eller frånvaro av sjukdom-associerad synaptiska proteiner, växa primära kortikala neuroner odlade på 22x22 mm fyrkant täckglas för 24-28 DIV. Neurons kan vara dubbel-transfererats med GFP / mCherry att definiera cellmorfologin och fluorescerande taggade mutant synaptiska proteiner som beskrivs ovan. För alla imaging experiment, välja hälsosamma pyramidala nervceller uttrycka både konstruerar, dessa celler kan bli föremål för farmakologisk behandling, avbildas och används i efterföljande analyser.

  1. Pre-inkubera nervceller som odlas på 22x22 mm täckglas i 1,5 ml ACSF i 30-60 minuter i en fuktig 37 ° C inkubator, kompletterat med 5% CO 2. Celler kan också förbehandlas med läkemedel i detta skede också. Efter pre-incubation/treatment, överföra celler till en sluten avbildning skede kammare (Warner, RC-30HV). Hålla en temperatur på 37 ° C med en controller enhet (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. För att undersöka ryggraden motilitet, förbehandla celler med drog-eller fordon för upp 30-60 minuter innan de överförs cellerna till avbildning kammaren. Detta gör att tillräckligt med tid för drog / fordon att inleda andra budbärare banorna inom neuron. Hämta bilder via en 63x mål (Ziess, NA 1,4) med 2X genomsnitt med 10 minuters intervall. Välj friska nervceller med övergripande pyramidal morfologier uttrycka GFP / mCherry eller fluorescerande-taggade proteinet. För att minimera fotoskador, minska laser makt att 0,5-1%. Jämförelser av fordon behandlas kontra narkotika behandlade cellerna kommer att visa förändringar i ryggraden motilitet. Alternativt kan ryggraden motilitet bedömas före och efter behandling, genom perfusion av drog / fordon (se nedan). Samla Z-stackar vid varje tidpunkt.
  3. Att följa förändringar i dendritiska ryggraden morfologi över tid, bild täckglas i 1 timme för att fastställa baslinjen förändringar i morfologi. Vid denna tid, BEGJUTA drog / fordon i avbildning kammaren med hjälp av en peristaltiska pumpar (Gilson, Minipuls 3) och bild neuron för ytterligare en timme. Förvärva konfokala Z-staplar med en 63x olja mål (Ziess, NA 1,4), med 2X genomsnitt var 10 minut. Minska lasereffekt till 0,5-1% för att minimera fotoskador.
  4. Vid slutet av varje avbildning session, få en 20X bild av hela neuron för att fastställa graden av fotoskador. Alla nervceller visa tecken på stress bör utelämnas från kvantifiering. Z-stackar av varje gång-punkt bör kollapsade i 2D-projektioner i metamorfa. Beroende på bildkvalitet och nivå transfektion, en median-pass filtret eller bakgrund subtraktion kan tillämpas i metamorfa att skapa tydliga bilder för analys.
  5. Att utvärdera ryggraden morphing och motiliteten, bör bilder tagna i början, mitten och slutet av 100 minuter avbildning sessionen färgkodade och överdrog i metamorfa. Minst 100 ìm av Dendrite per cell behöver analyseras. Den totala ryggraden motilitet bråkdel definieras som det totala antalet motilitet händelser, dvs förlängning, dementi, chef morphing eller UTSTÅENDE motilitet normaliseras till ryggrad numret 6,11. Denna metod mäter frekvensen av händelser, utan tanke på deras magnituder, det pooler alla typer av evenemang, och är en allmän uppskattning av total rörlighet. En UTSTÅENDE händelse definieras som uppkomsten av en ny, transient deformation från en ryggrad huvudet eller dendritiska axeln. En dementi händelse definieras som försvinnandet av en befintlig eller övergående utstick ligger på en ryggrad huvudet eller dendritiska axeln. Summan av utskjutning och utbyggnad händelser dividerat med det totala antalet taggar i regionen Dendrite som kvantifieras.
  6. För att bedöma förändringar i enskilda ryggraden morfologi som svar på läkemedelsbehandling, mäta tvärsnittsarean av Dendritutskotten eller dendritiska ryggraden linjär densitet vid tidpunkt -1 timme (1 timme före perfusion), omedelbart före behandling och vid varje tidpunkt efter behandling. Normalisera varje tidpunkt till 1 timme före till behandling tidpunkt. Att fastställa att förändringar i dendritiska ryggraden morfologi eller linjära tätheten inte berodde på fotoskador, analysera nervceller perfusion med fordon. Skillnader i medel kan bestämmas genom Students oparade t test eller one-sample t-test.

8. Alternativa metoder och nycklar till framgång

  1. Vi har beskrivit odling kortikala neuroner i närvaro av D, L-APV, en NMDA-receptorn hämmare, från DIV 4 till förfall (DIV24-28). Det bör noteras att medan odling kortikala neuroner i närvaro av D, har L-APV gagn för att upprätthålla god hälsa av kortikal neuronala kulturer långsiktiga närvaro av D, kan L-APV inflytande synaps utveckling. Som ett sådant alternativ är att kulturen nervceller i avsaknad av D, L-APV 2,5. Vid odling nervceller i brist på D, bör L-APV extra uppmärksamhet ägnas den övergripande hälsa kulturer, eftersom det finns en ökad chans att celldöd på grund av alltför Ca2 + cytotoxicitet via överaktiva NMDA-receptorn aktivering.
  2. Den neuronala kulturer som beskrivs i detta protokoll kan användas för att undersöka mekanismer som är relevanta för regleringen av dendritiska ryggraden morfologi och motilitet i dendritic ryggar visar en mogen morfologi (dvs de bildar anslutningar med presynaptisk partners och har ett klart huvud-liknande struktur) 2,4,5. Alternativt kan användning av kulturer vid ett tidigare tillfälle-punkt kan t.ex. DIV11-16, vara mer lämpligt att behandla frågor som är relevanta för dendritiska ryggrad bildning, eller reglering av Dendritutskotten under tidig utveckling.
  3. Ett alternativ till användningen av konfokalmikroskopi, är att använda breda fält epi-fluorescens att förvärva bilder av behandlade odlade kortikala neuroner. I kombination med lämpliga deconvolution algoritmer, kan detaljerad morfometriska analys av taggar göras i fast eller levande celler. Dessutom är det möjligt att använda alternativa programvaror, såsom ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) eller Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ) som är gratis programvara för analys av dendritiska ryggraden morfologi.
  4. Vid granskningen av dendritiska ryggrad motilitet / morphing med tidsförlopp avbildning, bör det noteras att användningen av kortare time-lapse intervaller, t.ex. 5-10 minuter, kan ge en mycket mer detaljerad analys av dendritiska ryggraden turnover2, 5. Användning av kortare tidsintervall kan också identifiera snabbare former av ryggraden morphing som inte kan upptäckas med längre tidsintervall.
  5. Användningen av odlade kortikala neuron har ett antal nackdelar och problem som måste beaktas. För det första är en oro för att använda odlade kortikala neuroner att det kan finnas variationer mellan olika kulturer som kan påverka parametrar som dendritiska ryggraden densitet. Som sådan är det viktigt att följande punkter noggrant följs för att säkerställa minsta variation. För det första bör odling parametrar och reagenser vara så konsekvent som möjligt utöver god odling praxis, vilket kommer att kraftigt minska graden av variation mellan olika kulturer. För det andra är det viktigt att alla experiment utförs vid samma tid-punkt, och syster kulturer. Utöver den tid-punkt där experimenten utförs bör noggrant valt att låta försöksledaren att ställa de rätta frågorna (se punkt 2 ovan). Slutligen är det viktigt att lämpliga kontroller används i alla experiment, så att behandlingen villkor alltid undersöks i förhållande till dessa interna kontroller. Detta tar bort all oro för variation mellan olika kulturer.
  6. Användningen av odlade kortikala neuroner är ett kraftfullt verktyg att göra det möjligt för forskare att kritiskt granska de mekanismer som är nödvändiga för reglering av dendritiska ryggraden morfologi och motilitet. Det är dock viktigt att notera att dessa kulturer inte rekapitulera en in vivo-situationen, och komponenter som kortikallagret organisation och effekten av andra celltyper, såsom gliaceller, på synaps bildning inte kan behandlas i det ovan beskrivna systemet. Icke desto mindre kan ett sådant system användas för att identifiera potentiellt avgörande mekanismerna bakom regleringen av dendritiska ryggraden morfologi och motilitet.

9. Representativa resultat

De analyser som beskrivs ovan är utformade för att undersöka förändringar i dendritiska ryggraden morfologi, antal och rörlighet som svar på farmakologisk behandling och / eller genetiska manipulationer av proteiners funktion in vitro. I vårt labb har vi använt dessa tekniker för att karakterisera roll synaptiska proteiner som reglerar aktin cytoskelettet i Dendritutskotten och därmed ändra deras struktur 2,9. Dessutom har vi använt denna analys för att avgöra hur neuroactive föreningar, såsom neuromodulators kan köra förändringar i dendritiska spine morfologi, antal eller form, antingen ensamt 4,6,10, eller i närvaro av aktivitet beroende stimuli 5.

För att uppskatta noggrannheten i våra mätningar av 1D eller 2D parametrar, mätte vi diametrar och områden av fluorescerande latex mikrosfärer (Duke vetenskapliga) över kända dimensionerna (0,2, 0,52, 1,0 mikrometer) monteras på samma villkor som de nervceller under hela studien. Genom att använda samma avbildning villkor som för ryggraden mätningar (63x NA = 1,4 olje-nedsänkning mål LSM 5 Pascal) vi avbildas mikrosfärer, och sedan bestäms deras diametrar och områden i metamorfa på samma sätt med vår ryggrad mätningar. Vi jämförde sedan de faktiska mätningar med kända dimensioner mikrosfärer.

Diagrammet i figur 1 (Fig. 1) visar att vi exakt kunde mäta områdena mikrosfärer av 0,52 och 1,0 ìm (områden = 0,21 ìm 2 och 0,78 ìm 2 respektive) (mätt standardavvikelse ~ 15%, tillverkare bestämmas standardavvikelse ~ 9%). Även för 0,2 ìm mikrosfärer våra mätningar var ganska nära den faktiska mått (dock med stora SD). Detta överensstämmer med den beräknade laterala resol ution av våra konfokalmikroskop med detta mål, 0,3 ìm (med hjälp av ekvationen Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Detta är betydligt bättre än den axiella upplösningen, som är känt för att vara dålig för konfokala och 2-photon mikroskop. Dessutom bestäms vi experimentellt i sidled (x / y-axeln) funktion punkt spridning (PSF) genom att mäta grönt fluorescerande mikrosfärer av 200 nm diameter (Duke vetenskapliga) att ~ 0,5 mm. Denna beräkning utfördes med hål öppna, och därmed det kan antas att när hål är stängd, att polyesterstapelfibrer faktiskt skulle vara mindre. Ändå tyder detta på en gång att vi har möjlighet att noggrant mäta områden större än 0,196 ìm 2 (diameter = 0,5 mikrometer). En indikation på den verkliga laterala polyesterstapelfibrer ges i (Svoboda et al.) 13 som "inte är mycket mindre än 0,4 ìm, vilket skulle resultera i ett område med 0,16 ìm 2". Dessa jämförelser och teoretiska överväganden indikerar att vi exakt kan mäta delar av objekt liknar storleken på taggar, eftersom måtten på taggar vi mätte var större än denna resolution gräns (> 0,25 ìm 2). För sådana förhållanden, "klassisk morfometriska tekniker är kvantitativ" 13, vilket indikerar att vi säkert kan mäta ryggraden områden, och kunna jämföra ryggraden morfologier i olika behandling förhållanden.

För att exakt mäta dendritiska ryggraden morfologi, vi har transfekterade DIV 23 kortikala neuron med en EGFP bygga för 2 dagar. Efter transfektion, kan cellerna bli föremål för behandling, och är fast och behandlas för ICC, där GFP signalen är förstärkt för att möjliggöra jämn fördelning över dendrite (eller neuron). Figur 2 visar en representativ bild av en kortikala neuron transfererats med GFP, avbildas med en konfokalmikroskop med ett 63x objektiv (NA 1,4) (Fig. 2A). Detta möjliggör för detaljerade högupplösta bilder av Dendritutskotten (Fig. 2B). Detaljerad morfometriska analyser av Dendritutskotten utförs i vårt laboratorium med hjälp av metamorfa programmet. Det här programmet ger oss möjlighet att inte bara mäta dendritiska ryggraden morfologi, men även att undersöka lokalisering av kroppsegna proteiner. En översikt över hur vi utför denna analys görs i figur 2 (Fig. 2C-G).

En väl karakteriserade effekt av aktivitet beroende stimuli är en ökning av dendritiska ryggraden storlek 2. Figur 3 visar representativa tidsförlopp avbildning av en dendritiska ryggen av en DIV 24 kortikala neuron uttrycker EGFP, avbildas i 30 minuter före och efter en aktivitet beroende av stimulans. Detta tidsförlopp experiment bekräftar att verksamheten är beroende av stimuli ökar dendritiska ryggraden storlek (Fig. 3A, B). För att undersöka basala ryggraden motilitet, var bilder förvärvades vid tidpunkterna 0, 50 och 100 minuter, och ryggrad förlängningar, retractions, UTSTÅENDE motilitet och huvud morphing mättes separat och kombineras efter total rörlighet. Figur 3C-D bekräftar att även under basala förhållanden, Dendritutskotten av kortikala neuroner visa en viss grad av rörlighet.

Figur 1
Fig.. 1. Jämförelse mellan uppmätta och faktiska delar av fluorescerande mikrosfärer. Felstaplar representerar standardavvikelse mäts områden. Bilder av mikrosfärer av 0,2 ìm, 0,52 ìm och 1 mikrometer. Skalningsfält = 5 ìm.

Figur 2
Fig.. 2. Kvantifiering av ryggraden morfologi och IF. A. Bild av DIV 25 EGFP-uttryckande odlade kortikala neuron. B. hög förstoring av typiska dendritiska ryggraden morfologi finns på kortikala neuroner.. C. EGFP och kroppsegna proteiner (GluR1) overlay D. Komprimerade Z-serie av en EGFP-transfekterade pyramidal cellen Dendrite, är uppdelningen mellan axel och ryggar spåras manuellt E. Distinkt, superthreshold regioner Därefter beskrivs av metamorfa och kvantifieras F. hand spåras nervceller används för att bestämma ryggrad längd, bredd och tvärsnittsarea G. fastställda Regionkommittén... av metamorfa som motsvarar ryggar. H. Spine konturer kommer att överföras till den röda kanalen bilden (endogena protein) för att kvantifiera ryggraden-specifik signal. IK. För att kvantifiera receptorn eller synaptic protein kluster IF, projektion bilder av Z-serien används. I. Dendritiska axel bakgrund IF (gul fyrkant) subtraheras för att generera en "bakgrund-korrigerad" bild. Denna bild är då thresholded J. och programmet automatiskt mäter kluster område, linjära tätheten, och totalt grått värde (IF intensitet) K. Thresholded bild från H. Skala barer, A = 15 ìm, B = 1 mm.

g "alt =" Bild 3 "/>
Fig.. 3. Aktivitet-beroende förändringar i ryggraden morfologi och basala motilitet i Dendritutskotten. A. Time-lapse avbildning av en representant dendritiska ryggrad före och efter tillsats av en aktivitet beroende stimulans. Aktivitet beroende stimuli skulle framkallas genom att byta den experimentella media från ASCF innehåller Mg 2 + och APV att ACSF utan Mg 2 + och APV, men innehåller 10 mikrometer glycin B. Kvantifiering av dendritiska ryggraden område (storlek), normaliserad till -30 minuter tidpunkt (30 minuter före perfusion). C. representant bilder av 0, 50 och 100 minuter tidpunkter dendritiska ryggraden motilitet. Populäraste bilderna visar överlagring av 0 (röd), 50 (grön) och 100 (blå) minut tidpunkter, medan Bilderna nedan är varje tidpunkt separat. Asterisk betecknar ryggraden förlängning, vita pilen betecknar ryggraden retraktion, grön pil huvudet betecknar UTSTÅENDE motilitet, öppna gula pilen huvudet betecknar ryggraden huvudet morphing D. Kvantifiering av dendritiska parametrar ryggraden motilitet och total motilitet E. 20X bild av kortikala neuroner uttrycka EGFP efter avbildning.. möte för att bestämma hälsa cell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De tekniker som beskrivs ovan för en detaljerad kvantitativ analys av dendritiska ryggraden morfologi, linjär densitet och motilitet i antingen fast eller bor primära kortikala neuroner är fokuserade på att förstå effekterna av postsynaptiska mekanismer som kan bidra till neuropathologies. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för att kvantifiera ryggraden morfologi eller motilitet i någon taggig neuron, inklusive hippocampus pyramidal, Purkinje, eller medium nervceller taggiga.

Protokollet som beskrivs här kan anpassas för att titta på de grundläggande egenskaperna hos synaptiska proteiner och / eller effekterna av farmakologisk behandling på Dendritutskotten. Dessutom kan den användas för att bedöma vilka förändringar i lokalisering av endogena synaptiska proteiner från schavotten proteiner till glutamat receptorer. Dessutom kan det inte bara detaljerade morfometriska analyser av fasta ryggar, men även mätning av effekterna av synaptiska proteiner eller farmakologisk behandling på dendritiska ryggraden motilitet. Dessa tidsförlopp avbildningstekniker kan också ändras för att undersöka handel med proteiner, med eller utan samtidigt undersöka dendritiska ryggraden morfologi.

Detaljerad analys av dendritiska ryggraden morfologi och motilitet är ett viktigt verktyg för att undersöka potentiella effekterna av mutant synaptiska proteiner, och hur mutationer i dessa sjukdomar förknippade synaptiska proteiner kan påverka synaps struktur och funktion, vilket bidrar till patofysiologin vid flera sjukdomar i hjärnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Produktionen av detta arbete fick stöd av metamorfa (Molecular Devices, Inc.).

Acknowledgments

Vi tackar Kelly Jones för noggrann redigering. Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01MH 071.316, Alzheimers Association, National Alliance för forskning om schizofreni och depression (NARSAD) och National Alliance for Autism Research (naar) (PP), American Heart Association postdoktorsstipendium (DPS), amerikansk Heart Association Predoctoral Fellowship (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
Analys av Dendritiska Spine Morfologi i odlade CNS Neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter