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Neuroscience

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.

Abstract

Espinhas dendríticas são os locais da maioria das conexões excitatórias no cérebro, e formam o compartimento pós-sináptico das sinapses. Estas estruturas são ricas em actina e tem se mostrado altamente dinâmico. Em resposta à plasticidade Hebbian clássica, bem como sinais de neuromoduladores, espinhas dendríticas pode mudar de forma e número, que é pensado para ser crítico para o refinamento dos circuitos neurais e processamento e armazenamento de informações dentro do cérebro. Dentro de espinhas dendríticas, uma complexa rede de proteínas ligação sinais extracelulares com o cyctoskeleton actina permitindo o controle da morfologia da coluna dendríticas e número. Estudos neuropatológicos demonstraram que um número de estados de doença, que vão desde a esquizofrenia para transtornos do espectro do autismo, exibir morfologia anormal da coluna dendríticas ou números. Além disso, estudos genéticos recentes identificaram mutações em genes que codificam várias proteínas sinápticas, levando a sugestões de que estas proteínas podem contribuir para a plasticidade da coluna aberrante que, em parte, estão na base da fisiopatologia desses transtornos. A fim de estudar o potencial papel destas proteínas no controle morfologias espinha dendrítica / número, o uso de culturas de neurônios corticais oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, este sistema permite uma alta resolução de imagem das espinhas dendríticas em células fixo, assim como lapso de tempo imagens de células vivas. Em segundo lugar, este sistema in vitro permite a fácil manipulação da função da proteína pela expressão de proteínas mutantes, knockdown por construções shRNA, ou tratamentos farmacológicos. Estas técnicas permitem aos pesquisadores começam a dissecar o papel da doença proteínas associadas e prever como as mutações dessas proteínas podem funcionar in vivo.

Protocol

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O protocolo descrito aqui pode ser usado para examinar a morfologia espinha dendrítica e dinâmica de qualquer sistema primário de cultura.

1. Preparação de culturas primárias de neurônios corticais

  1. Prepare alta densidade culturas de neurônios corticais de ratos Sprague-Dawley E18 embriões e cultura em glia condicionado meio isento de soro 1-2.
  2. Euthanize um rato grávidas (E18) de acordo com procedimentos ACUC; remover rapidamente útero (com fetos na mesma) e coloque em um prato de Petri 100 milímetros no gelo.
  3. Corte útero aberto e membrana amniótica, segure feto pelo pescoço (cordão umbilical intacto) com uma pinça, use outra pinça para couro cabeludo casca de trás para frente, e cortou o crânio aberto com uma pinça de ponta afiada ao longo da linha média de trás para frente.
  4. Remova todo o cérebro com uma pinça curva (em um movimento colher) e coloque em um prato de 100 milímetros de petri contendo 10 ml Ca2 gelada + - e Mg 2 + livre HBSS.
  5. Segure-tronco do cérebro com uma pinça, hemisférios separados com outra pinça, remover hipocampo e estriado, córtex separadas e cuidadosamente descascar o tecido cortical fora de meninges.
  6. Piscina dissecados tecidos cortical, mince brevemente e transferir para um tubo de 15 ml contendo 4 ml pré-aquecido tripsina / EDTA (0,25% de tripsina, 0,53 mM EDTA; HyQ Tripsina de HyClone SH30042.01); incubar em banho-maria 37 ° C para ~ 15 min; remover tripsina / EDTA, tanto quanto possível com uma pipeta de plástico descartável, adicionar 1,5 ml de meio neuronal.
  7. Dissociar os tecidos digeridos mecanicamente por pipetagem suave com uma pipeta 5 ml (~ 10 cursos, evitar a criação de bolhas de ar), adicionar 2 ml de meio, vamos resolver por 30 segundos, em seguida, transferir 2 ml sobrenadante para um tubo de 15 ml.
  8. Repita a etapa 6 duas vezes (deve levar cerca de ~ total de 15 min).
  9. Spin-suspensão de células em 200g por 2 min.
  10. Remover o sobrenadante (com uma pipeta 5 ml - não aspirado a vácuo); soltar o pellet lançando dedos contra o fundo; ressuspender pellet celular em 5 ml de meio e filtrar através de um filtro de células 40 M em um tubo de 50 ml.
  11. Misturar 10 mL de suspensão celular e 10 ml azul de tripano; Contar células viáveis ​​(trypan exclusão azul) com uma hematocytometer.
  12. Rendimento típico: 5 x 10 6 células / cérebro; diluir a densidade desejada (por exemplo, 1,5 x 10 6 células / ml) para revestimento.
  13. Preencha placas de cultura com a mídia chapeamento (media Neurobasal suplementado com 2% B27, 0,5 mM de glutamina e 1% de penicilina: stretomycin) (volume total menos o volume de chapeamento) contendo 18 mm redondo ou lamelas 22x22 milímetros quadrados, revestidos com poli-D-lisina ( 0,2 mg / ml, Sigma) dissolvida em 0,1 M de borato tampão (3.1g / L de ácido bórico, 4.8g / L de bórax, pH 8,5, esterilizado por filtração); volume total de 12 poços da placa = 0,8 ml / poço.
  14. Neurônios placa na densidade fornecido na próxima etapa; dispersar células uniformemente pela gentil balanço / toque.
  15. Por 12 bem-placas (3,5 centímetros 2 / bem): (oi densidade 3 x 10 5 / well = 857/mm 2) (meados de densidade 1,5 x 10 5 / well = 430/mm 2), 6-lamelas (9,6 centímetros 2 / bem): (oi densidade de 9 x 10 5 / well = 624/mm 2) (meados de densidade de 4,5 x 10 5 / well = 312/mm 2).
  16. Uma hora após o plaqueamento, substituir todos os média com meio fresco (media Neurobasal suplementado com 2% B27, 0,5 mM de glutamina e 1% de penicilina: stretomycin). Porque restos celulares tendem a se estabelecer no meio do redemoinho, bem as primeiras placas para facilitar a remoção de detritos; ter cuidado para não deixar pilhas secas a qualquer momento.
  17. Alterar ½ médio duas vezes por semana depois disso (remove ~ 300-350 mL de cada bem, e acrescentar 400 mL aquecido médio alimentação fresca para cada poço).
    Opcional: No DIV 4 adicionar 200 mM D, L-amino-ácido phosphonovalerate (D, L-APV, Ascent Científica) para a alimentação médio; neurônios cultura em meio Neurobasal suplementado com 2% B27, 0,5 mM de glutamina e 1% de penicilina: stretomycin + 200 M APV.
  18. Crescer culturas primárias de neurônios corticais para os dias 24-28 in vitro (DIV), como se vê neste momento espinhas dendríticas ponto de exibir uma morfologia maduras (ou seja, formar conexões com pré-sináptica parceiros, e têm uma estrutura de cabeça-como claro) e correspondem ao início da adolescência em roedores 3-4. Neurônios cultivados em 18 lamínulas redondas mm podem ser tranfected e tratados farmacologicamente, antes de ser fixo, imunocoradas e fotografada usando um microscópio confocal e usado para a análise detalhada de morphometeric espinhas dendríticas. Células cultivadas em lamínulas 22x22 mm quadrado pode então ser usado em experimentos de lapso de tempo de imagem para investigar a dinâmica espinha dendrítica.

2. Transfecção de culturas primárias de neurônios corticais

  1. Neurônios corticais estão transfectadas 2-3 dias antes dos experimentos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Prepare "h-DMEM", equilibrando o pH da DMEM (Dulbecco Modificado Águia Médio, sem glutamina,Invitrogen 11965-092) com 10 mM HEPES estéril (4 - (2-hidroxietil)-1-ácido piperazineethanesulfonic; Mediatech Cellgro 25-060-CI, 1M, pH 7). Quente a 37 ° C.
  3. Transferência para lamínulas 600/1000 mL (18/22x22 lamínulas mm) pré-aquecido (37 ° C) meio antibiótico-livre novo (médio Neurobasal, B27, 0,5 mM de glutamina), e células incubar numa umidificado 37 ° C incubadora, complementado com 5% de CO 2 por 30 minutos.
  4. Para cada lamela, adicionar quantidade designada de DNA (uma ou plasmídeos DNA múltipla, por exemplo, pEGFP para delinear a morfologia das células e marcou-mutantes da proteína sináptica; 1-2 mg dependendo construir) para 50 ul de h-DMEM; deixar repousar por 5 minutos.
  5. Para cada lamela, adicione 4 / 6 mL (18/22x22 lamínulas mm) Lipofectamine 2000-50 mL h-DMEM; deixar repousar por 5 minutos.
  6. Homogeneizar os tubos das etapas 1,3 e 1,4, manter por pelo menos 20 minutos em um umidificado 37 ° C incubadora, suplementado com 5% de CO 2. Complexo é estável por até 6 horas de acordo com o fabricante.
  7. Adicione a mistura de 2000/DNA Lipofectamine de gotas passo 1,5 para as células. Incubar as células em uma umidificado 37 ° C incubadora, suplementado com 5% de CO2, por 4 horas.
  8. Usando o meio de alimentação a partir do passo 1.1 (300 / 600 mL), suplemento com pré-aquecido (37 ° C) 400 / 800 mL meio de alimentação fresca (18/22x22 lamínulas mm). Após 1,6 passo, lamínulas transferência para meio contendo meio de alimentação de idade e fresco.
  9. Permitir a expressão de plasmídeos para continuar por 2-3 dias.

3. Tratamento primário das culturas cultivadas em neurônios corticais de 18 mm lamínulas

Neurônios cultivados em 18 lamínulas mm, previamente transfectadas, também pode ser facilmente submetidos a tratamentos farmacológicos.

  1. Prepare ACSF (líquido cefalorraquidiano artificial, em mM: NaCl 125, KCl 2,5, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 de glicose, 5 HEPES, 2,5 CaCl 2 e MgCl 2 1,25 com 200 mM D, L-APV). Quente a 37 ° C. Pré-incubar lamínulas em 900 mL ACSF quente por 30-60 minutos. Pré-tratamento com inibidores podem ser realizadas durante este tempo.
  2. Prepare agentes farmacológicos / veículo a partir de soluções de reserva a uma concentração 10X de trabalho; realizar diluições de soluções em ACSF. Adicione cuidadosamente agente / veículo para as células (volume final de 1000 mL, para uma concentração final de 1X agente / veículo), e permitir que o tratamento para continuar por tempo desejado 5.
  3. Após o tratamento (s), fixar as células e processo para immunocytohistochemistry.

4. Fixação e immunocytohistochemistry (ICC)

  1. Fix neurônios em qualquer formaldeído 4% / 4% de sacarose PBS (800 mL) por 20 minutos em temperatura ambiente, ou em formaldeído a 4% / 4% de sacarose PBS (800 mL) por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido por lavagens em PBS 2X , seguidos por 10 minutos corrigir com pré-refrigerado (-20 ° C) metanol (800 mL) a 4 ° C. Fixação de metanol obras de desnaturação e precipitação de proteínas. Este procedimento leva a um desmascaramento das proteínas na densidade pós-sináptica (PSD), bem como em áreas ricas em lipídios.
  2. Lavar as lamínulas em PBS (800 mL), 2x, por 10 minutos cada.
  3. Permeabilizar e bloquear as células simultaneamente em PBS contendo soro de cabra 2% normal e 0,1% Triton-X-100 (800 mL) por 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Adicionar anticorpos primários levantadas contra GFP, epítopo tag (por exemplo, His, myc, V5) ou proteínas endógenas, a PBS contendo 2% de soro normal de cabra na concentração apropriada. Pegue um prato de 15 cm, divida-o em quadrados, número deles, e cubra com parafilme. Adicionar cerca de 80 mL de mistura de anticorpos e bloquear a parafilme (uma gota por metro quadrado), e lamínula lugar para anticorpo / block mix com células virada para baixo. Incubadas overnight a 4 oC.
  5. Lavar as lamínulas em PBS, 3x por 15 minutos cada.
  6. Diluir Alexa anticorpos conjugados secundário (Invitrogen) em PBS contendo soro de cabra 2% normais na concentração apropriada. Incubar os anticorpos secundários da mesma maneira como no passo 3.4, em temperatura ambiente por uma hora, protegido da luz.
  7. Lavar lamínulas de mais de 3x 15 minutos em PBS.
  8. Lamínulas para montagem microscópio padrão slides usando Prolongar reagente Antifade Gold (Invitrogen).

5. Análise quantitativa da morfologia da coluna

Obtemos imagens confocal de neurônios simples e duplo-coradas (células expressando GFP e proteína endógena construir ou de interesse), utilizando um microscópio Zeiss LSM5 Pascal confocal. Para todos os experimentos com imagens escolha saudável neurônios piramidais a ser trabalhada e utilizada na análise subseqüente. Neurônios saudáveis ​​são células que não apresentam qualquer sinal de blebbing ou angústia devido ao tratamento ou de fixação e que contêm um total de jardim, caramanchão dendríticas ininterrupto.

  1. Adquirir imagens de neurônios utilizando objetiva de imersão em óleo 63x (Zeiss) com um NA (numabertura erical) de 1,4, como um Z-series de 3-8 imagens, em média, quatro vezes, com intervalos de 0,37 mM, 1024x1024 pixels de resolução a uma velocidade de digitalização de 2,5 segundos por seção. Culturas que devem ser comparados diretamente precisa ser trabalhada com os mesmos parâmetros de aquisição. 20/10 neurônios / condição, cada 3-5 experimentos separados, e 2 dendrites de 100 mm por neurônio deve ser analisado. Experimentos deve ser feito cego e em culturas irmã. Ajuste o ganho do detector e offset para incluir até mesmo vagamente fluorescentes espinhos finos, sem criar um halo ao redor do dendrito, de modo que a transição entre o sinal fluorescente na coluna e no fundo é nítida, permitindo a quantificação precisa. Manter os parâmetros de aquisição a mesma para todas as verificações no mesmo experimento.
  2. GFP imagens podem ser adquiridas através de um feixe de laser de argônio, emocionante a 488 nm e coletando com um filtro passa-banda de 505-530 nm. Imagens de proteínas ou proteínas endógenas overexpressed imunocoloração com um Alexa 568 anticorpo secundário (Invitrogen) podem ser obtidos utilizando um laser de HeNe emocionante em 543 nm e coletando usando um filtro passa-tempo a 560 nm. Mantenha poderes laser para um mínimo para evitar fotodegradação de amostras.
  3. Metamorph usando software (dispositivos Molecular, Inc.), bidimensional, fundo-subtraído, reconstruções de projeção máxima de Z-series imagens são utilizadas para análise morfométrica e quantificação. Para examinar as morfologias das espinhas dendríticas, o colapso da série Z-imagens, calibrar a distância necessária, e então limite para incluir todas as espinhas de uma maneira que o limite corresponde exatamente ao contorno dos espinhos (Fig. 2E, F). Espinhos somente em dendritos secundários e terciários (comprimento total de 100 mm por neurônio) devem ser medidos para reduzir a variabilidade, e as medidas de segmentos precisam ser feitas entre os pontos de ramificação. Manualmente esboço cada coluna, para que ele se tornará um perímetro fechado (Fig. 2G).
  4. Medir os parâmetros da coluna seguinte automaticamente em Metamorph: comprimento da coluna, largura da coluna, área transversal e densidade espinha dendrítica linear. Exportar os parâmetros espinha dendrítica morfométrica em Excel para a quantificação. Use Student não pareado testes t para determinar a significância estatística das diferenças entre dois grupos; one-way ANOVA pode ser usada para comparar três ou mais grupos, seguido pelo post hoc Tukey-b para comparações múltiplas. Análise estatística pode ser realizada em Excel, GraphPad ou SPSS. Analisar parcelas cumulativas usando Kolmogorov-Smirnov (KS teste) 2,5-6.

6. Quantitativo de imunofluorescência (IF)

Quantificação de imunofluorescência utilizando anticorpos específicos contra proteínas sinápticas, visualizado através de um Alexa 568 anticorpo secundário (Invitrogen), pode ser usado para examinar as mudanças no agrupamento e localização sináptica da endógenos proteínas sinápticas.

  1. Adquirir imagens usando um microscópio confocal, como descrito acima. Use uma argônio e um laser HeNe (veja acima) para a imagem manchada duplo neurônios. Apenas a imagem saudável neurônios piramidais que não apresentam quaisquer sinais de angústia.
  2. Para medições de intensidade de fluorescência, subtrair o fundo correspondente ao eixo dendríticas (Fig. 2I, quadrado amarelo) para gerar um "background-subtraído" imagem (Fig. 2J) usando Metamorph. Igualmente imagens limite para incluir grupos com intensidade pelo menos duas vezes acima do dendrito adjacentes (Fig. 2K). Regiões ao longo contorno dendrites (100 mm por neurônio), utilizando o "perímetros" utilidade (Fig. 2D) e automaticamente medir a densidade linear (comprimento number/100 dendrite mm), ea intensidade integrada (total IF intensidade) de cada cluster usando synaptic Metamorph 7-9.
  3. Para medir o conteúdo da coluna relativa de uma proteína sináptica, determine primeiro agrupamento de proteína por limiarização da imagem GFP para determinar a morfologia da coluna (Fig. 2E, F), utilizando Metamorph. Transferência das regiões de interesse que incluem apenas espinhas de imagens da proteína de interesse capturado no outro canal (Fig. 2G, H). Contar o número de aglomerados de proteínas e medir a intensidade de imunofluorescência integrado dentro espinhos para avaliar o conteúdo de proteína espinha.
  4. Exportar o IF parâmetros de proteínas sinápticas em Excel para a quantificação. Use Student não pareado testes t para determinar a significância estatística das diferenças entre dois grupos; one-way ANOVA pode ser usada para comparar três ou mais grupos, seguido pelo post hoc Tukey-b para comparações múltiplas. Análise estatística pode ser realizada em Excel, GraphPad ou SPSS.

7. Lapso de tempo de imagem

Para examinar a dinâmica espinha dendrítica, tais como alterações na motilidade ou da morfologia da coluna da coluna de espinhos individual, na presença ou ausência de doença associada proteínas sinápticas, crescer neurônios corticais primárias cultivadas em lamínulas 22x22 mm quadrado para DIV 24-28. Neurons podem ser double-transfectadas com GFP / mCherry para definir a morfologia das células, e fluorescente etiquetado mutante proteínas sinápticas como descrito acima. Para todos os experimentos com imagens, escolha saudável neurônios piramidais expressar tanto constrói; essas células podem ser submetidos a tratamento farmacológico, fotografada e utilizadas em análises posteriores.

  1. Pré-incubar neurônios cultivados em lamínulas 22x22 milímetros em 1,5 ml ACSF por 30-60 minutos em um umidificado 37 ° C incubadora, suplementado com 5% CO 2. As células podem também ser pré-tratados com drogas nesta fase também. Pre-incubation/treatment seguintes, as células de transferência para um recinto de imagem palco (Warner, RC-30HV). Manter uma temperatura de 37 ° C com uma unidade controladora (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Para examinar a motilidade coluna, pré-tratamento de células com drogas ou do veículo por até 30-60 minutos antes de transferir as células para a câmara de imagem. Isso permite que o tempo suficiente para que a droga / veículo para iniciar as vias segundo mensageiro dentro do neurônio. Adquirir imagens através de um objetivo 63X (Ziess, NA 1,4) com média de 2X em intervalos de 10 minutos. Escolha os neurônios saudáveis, com total morfologias piramidal expressando GFP / mCherry ou fluorescentes marcadas proteína. Para minimizar photodamage, reduzir a potência do laser de 0,5-1%. Comparações de veículo tratados com drogas contra células tratadas irá demonstrar alterações na motilidade espinha. Alternativamente, a motilidade da coluna pode ser avaliado antes e após o tratamento, por perfusão do fármaco / veículo (ver abaixo). Coletar Z-stacks em cada momento.
  3. Para controlar as alterações na morfologia espinha dendrítica ao longo do tempo, as lamínulas imagem para uma hora para estabelecer as alterações na morfologia de base. Neste momento, perfundir a droga / veículo para a câmara de imagens utilizando uma bomba peristáltica (Gilson, Minipuls 3), e neurônio imagem para uma hora mais. Confocal adquirir Z-stacks utilizando objetiva de 63X de petróleo (Ziess, NA 1.4), com média de 2X a cada 10 minutos. Reduzir a potência do laser para 0,5-1% para minimizar photodamage.
  4. No final de cada sessão de imagem, obter uma imagem de 20X do neurônio inteiro para verificar nível de photodamage. Qualquer neurônios exibindo sinais de socorro, devem ser omitidos da quantificação. Z-stacks de cada ponto do tempo devem ser recolhidas em projeções 2D em Metamorph. Dependendo da qualidade da imagem e nível de transfecção, um filtro de mediana-pass ou subtração de fundo pode ser aplicado em Metamorph para produzir imagens claras para análise.
  5. Para avaliar a coluna vertebral morphing e motilidade, as imagens tiradas no início, meio e fim da sessão de 100 minutos de imagens devem ser codificados por cores e sobrepostas em Metamorph. Pelo menos 100 mm de dendrite por célula precisam ser analisados. A fração de motilidade total da coluna é definida como o número total de eventos motilidade, extensão ou seja, retração, cabeça morphing ou motilidade protrusiva normalizado para o número da coluna 6,11. Este método mede a freqüência de eventos, sem considerar suas magnitudes, mas piscinas todos os tipos de eventos, e é uma estimativa geral de mobilidade geral. Um evento protrusiva é definido como o aparecimento de uma saliência, novo transitórios de uma cabeça da coluna ou eixo dendríticas. Um evento de retração é definida como o desaparecimento de uma saliência existente ou transitórios localizados em uma cabeça da coluna ou eixo dendríticas. A soma dos eventos protrusão e extensão são divididos pelo número total de espinhos na região de dendrite que é quantificado.
  6. Para avaliar as mudanças na morfologia da coluna individual na resposta ao tratamento medicamentoso, medir a área transversal das espinhas dendríticas, ou densidade espinha dendrítica linear no tempo de hora ponto -1 (uma hora antes da perfusão), imediatamente anterior ao tratamento e em cada ponto de tempo seguinte o tratamento. Normalizar cada momento para a 1 hora antes para tratamento de ponto do tempo. Para determinar que mudanças na morfologia espinha dendrítica ou densidade linear não foram devido a photodamage, analisar neurônios perfundidos com veículo. Diferenças de médias podem ser determinadas por Student não pareado ou teste t de uma amostra de teste t.

8. Abordagens alternativas e as chaves para o sucesso

  1. Nós descrevemos neurônios corticais cultura na presença de D, L-APV, um inibidor do receptor NMDA, de DIV 4 até o vencimento (DIV24-28). Deve-se notar que, enquanto os neurônios corticais cultura na presença de D, L-APV tem a vantagem de manter a boa saúde da cortical neuronal culturas de longo prazo, a presença de D, L-APV podem influenciar o desenvolvimento sinapse. Como tal é uma alternativa para os neurônios da cultura na ausência de D, L-APV 2,5. Quando os neurônios de cultura na ausência de D, L-APV atenção extra deve ser dada para a saúde global de culturas, pois há uma chance de aumentar a morte celular por excesso de Ca2 + através de citotoxicidade sobre-ativo ativação do receptor NMDA.
  2. As culturas neuronais descritos neste protocolo pode ser usado para examinar os mecanismos que são relevantes para a regulação da morfologia e motilidade espinha dendrítica de dendritic espinhas exibindo uma morfologia maduras (ou seja, formar conexões com pré-sináptica parceiros, e têm uma estrutura de cabeça-como claro) 2,4,5. Alternativamente, o uso de culturas em um momento anterior ponto, por exemplo, DIV11-16, pode ser mais adequada para tratar de questões relevantes para a formação de espinha dendrítica ou regulamento das espinhas dendríticas durante o desenvolvimento inicial.
  3. Uma alternativa para o uso de microscopia confocal, é a utilização de campo amplo epi-fluorescência para adquirir imagens de tratados de cultura de neurônios corticais. Em combinação com algoritmos de deconvolução apropriado, análise morfométrica detalhada das espinhas pode ser feito em células fixas ou ao vivo. Além disso, é possível a utilização de software alternativos, como o ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) ou Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ), que são software livre, para a análise da morfologia da coluna dendríticas.
  4. Ao examinar a motilidade espinha dendrítica / morphing usando lapso de tempo de imagem, deve-se notar que o uso de mais curto lapso de tempo de intervalo, por exemplo, 5-10 minutos, pode fornecer uma análise muito mais detalhada da espinha dendritic turnover2, 5. Uso de intervalos de tempo mais curto pode também identificar formas mais rápida da coluna morphing que não seria detectada usando intervalos de tempo mais longo.
  5. O uso de culturas de neurônios corticais tem uma série de desvantagens e as preocupações que precisam ser levados em consideração. Em primeiro lugar, uma preocupação de utilizar cultivadas neurônios corticais é que pode haver variação entre as culturas que podem ter impacto parâmetros como a densidade espinha dendrítica. Como tal, é essencial que os seguintes pontos são cuidadosamente cumpridos garantir a menor quantidade de variabilidade. Em primeiro lugar, os parâmetros de cultura e os reagentes devem ser mantidos o mais consistente possível, além de práticas de cultura boa, o que irá reduzir significativamente o nível de variabilidade entre as culturas. Em segundo lugar, é essencial que todas as experiências sejam realizadas ao mesmo tempo-ponto, e em culturas irmã. Além disso, o tempo-ponto no qual são realizados experimentos devem ser cuidadosamente escolhidos para permitir que o experimentador fazer as perguntas adequadas (ver ponto 2 acima). Finalmente, é fundamental que os controles apropriados são usados ​​em todos os experimentos, para que as condições de tratamento são sempre examinados em relação a esses controles internos. Isto irá remover qualquer preocupação de variabilidade entre as culturas.
  6. O uso de culturas de neurônios corticais é uma ferramenta poderosa para permitir aos pesquisadores examinar criticamente os mecanismos que são essenciais para a regulação da morfologia e motilidade espinha dendrítica. No entanto, é importante notar que essas culturas não recapitular uma situação in vivo, e componentes como a organização da camada cortical eo efeito de outros tipos de células, como células gliais, na formação de sinapses não podem ser resolvidos no sistema descrito acima. No entanto, tal sistema pode ser usado para identificar os mecanismos potencialmente cruciais subjacentes à regulação da morfologia e motilidade espinha dendrítica.

9. Resultados representante

Os ensaios acima descritos são projetados para investigar as mudanças na espinha dendritic número, morfologia e motilidade em resposta aos tratamentos farmacológicos e / ou manipulações genéticas da função da proteína in vitro. Em nosso laboratório, nós utilizamos estas técnicas para caracterizar o papel das proteínas sinápticas que regulam o citoesqueleto de actina em espinhas dendríticas, alterando sua estrutura 2,9. Além disso, temos utilizado neste ensaio para determinar como compostos neuroactive, como neuromoduladores podem conduzir mudanças na morfologia dendrítica número da coluna, ou na forma, quer isoladamente 4,6,10, ou na presença de atividade dependente de estímulos 5.

Para estimar a exatidão de nossas medições de parâmetros 1D e 2D, medimos os diâmetros e áreas de microesferas de látex fluorescentes (Duke Científica) de dimensões conhecidas (0,2, 0,52, 1,0 mm) montado em mesmas condições que os neurônios durante o estudo. Usando as condições de imagem mesmo que para medições de coluna (63X NA = 1,4 objetivo óleo de imersão, LSM 5 Pascal) que imaged as microesferas, e em seguida determinou seus diâmetros e áreas em Metamorph, da mesma forma com as medições nossa coluna. Nós, então, comparada as medidas reais com as dimensões conhecidas das microesferas.

O gráfico da figura 1 (Fig.1) mostra que podemos medir com precisão as áreas de microesferas de 0,52 e 1,0 mM (áreas = 0,21 mM e 0,78 mM 2 2, respectivamente) (desvio padrão medido ~ 15%; fabricantes determinado desvio padrão ~ 9%). Mesmo para os 0,2 m microesferas nossas medições foram bastante próximos para as dimensões reais (porém com grandes SD). Isto é consistente com a resol calculada laterais ution do nosso microscópio confocal utilizando este objectivo particular, 0,3 mM (usando a equação Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Este é significativamente melhor do que a resolução axial, que é conhecido por ser pobre para microscópios confocal e 2-fótons. Além disso, determinados experimentalmente a lateral (x / y axis) função de propagação do ponto (PSF), medindo verde fluorescente microesferas de 200 nm de diâmetro (Duke Científica) ser ~ 0,5 micron. Esta estimativa foi realizada com a aberta pinhole, e assim pode-se supor que, quando a pinhole é fechada, que o PSF seria de fato menor. No entanto, este novo indica que somos capazes de medir com precisão as áreas maiores que 0,196 M 2 (diâmetro = 0,5 mm). Uma indicação do PSF reais lateral é dada em (Svoboda et al.) 13 como "não muito menos do que 0,4 mM, o que resultaria em uma área de 0,16 mM 2". Estas comparações e considerações teóricas indicam que podemos medir com precisão as áreas de objetos similares em tamanho para as espinhas, uma vez que as dimensões dos espinhos medimos foram maiores que esse limite de resolução (> 0,25 mM 2). Para tais condições, "clássico técnicas morfométricas são quantitativos" 13, o que indica que nós podemos confiantemente medir áreas espinha, e precisa comparar as morfologias coluna em condições de tratamento diferente.

, A fim de medir com precisão a morfologia espinha dendrítica, temos transfectadas DIV 23 neurônios corticais com uma construção EGFP durante 2 dias. Após a transfecção, as células podem ser submetidos a tratamento, e são fixados e processados ​​para ICC, onde o sinal GFP é reforçada para permitir uma distribuição uniforme em todo o dendrito (ou neurônio). A Figura 2 mostra uma imagem representativa de um neurônio cortical transfectadas com GFP, fotografada usando um microscópio confocal com um objetivo 63X (NA 1.4) (Fig. 2A). Isto permite detalhadas imagens de alta resolução das espinhas dendríticas (Fig. 2B). Detalhadas análises morfométricas das espinhas dendríticas são realizados em nosso laboratório utilizando o programa Metamorph. Este programa permite-nos não apenas para medir a morfologia espinha dendrítica, mas também para examinar a localização de proteínas endógenas. Uma visão geral de como realizar esta análise é fornecido na Figura 2 (Fig. 2C-G).

Um efeito bem caracterizado de atividade dependente de estímulos é um aumento no tamanho da coluna dendríticas 2. A Figura 3 mostra imagens de lapso de tempo representativo de uma espinha dendrítica de um neurônio DIV EGFP 24 cortical expressar, fotografada por 30 minutos antes e depois de um estímulo a atividade-dependente. Este experimento de lapso de tempo confirma que a atividade-dependente estímulos aumentar o tamanho da espinha dendrítica (Fig. 3A, B). Para examinar a motilidade coluna basal, imagens foram adquiridas em momentos 0, 50 e 100 minutos, e extensões de coluna, retrações, motilidade protrusiva e cabeça morphing foram medidos separadamente e combinados como motilidade total. Figura 3C-D confirma que, mesmo em condições basais, espinhas dendríticas dos neurônios corticais mostrar algum nível de motilidade.

Figura 1
Fig. 1. Comparação das áreas medidos e real de microesferas fluorescentes bares. Erro representam o desvio padrão das áreas medido. Imagens de microesferas de 0,2 mm, 0,52 mm e 1 mícron. Barra de escala = 5 mm.

Figura 2
Fig. 2. Quantificação da morfologia da coluna e IF. A. Imagem do DIV 25 EGFP-expressando neurônio cortical cultivado. Ampliações B. Alto da morfologia da coluna típico dendríticas encontradas em neurônios corticais. C. EGFP e proteína endógena (GluR1) overlay. D. Collapsed Z-série de uma piramidal EGFP-transfectadas dendrito da célula, a divisão entre o eixo e as espinhas é rastreada manualmente E. distintas, as regiões superthreshold são então descritas e quantificadas por Metamorph F. Hand-rastreada neurônios usados ​​para determinar o comprimento da coluna, largura e área transversal G. Regiões determinado... por Metamorph que correspondem às espinhas. contornos Spine H. serão transferidos para a imagem do canal vermelho (proteína endógena) para quantificar a coluna específica de sinal. IK. Quantificar receptor ou cluster de proteínas sinápticas IF, projeção de imagens Z-series são usados. I. fundo eixo dendríticas IF (quadrado amarelo) é subtraída para gerar um "background-subtraído" da imagem. J. Esta imagem é então thresholded eo programa mede automaticamente área de cluster, densidade linear, e valor de cinza total (IF intensidade) K. imagem limiarizada de bares Escala H., A = 15 mm, B = 1 mícron.

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Fig. 3. Dependente de atividade alterações na morfologia da coluna, e motilidade basal das espinhas dendríticas. A. imagem lapso de tempo de uma coluna representante dendríticas antes e após a adição de um estímulo a atividade-dependente. Dependente de atividade estímulos eram induzidas pela mudança da mídia experimental de ASCF contendo Mg2 + e APV a ACSF sem Mg2 + e APV, mas contendo 10 mM de glicina B. Quantificação da área de espinha dendrítica (tamanho), normalizada a -30 ponto de tempo minuto (30 minutos antes da perfusão). Imagens representativas C. de 0, 50 e 100 pontos no tempo minuto de motilidade espinha dendrítica. Imagens de cima mostra sobreposição de 0 (vermelho), 50 (verde) e 100 (azul) pontos de tempo minuto, enquanto as imagens abaixo são cada tempo separadamente. Asterisco indica extensão da coluna; seta branca denota retração coluna; cabeça de seta verde indica motilidade protrusiva; cabeça de seta aberta amarelo denota cabeça espinha morphing D. Quantificação dos parâmetros de motilidade dendríticas coluna e motilidade total E. imagem 20X de neurônios corticais expressando EGFP imagem seguinte.. sessão para determinar a saúde das células.

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Discussion

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As técnicas descritas acima para a análise quantitativa detalhada da morfologia da coluna dendríticas, densidade linear e mobilidade em qualquer fixo ou ao vivo neurônios corticais primárias estão focadas na compreensão dos efeitos da pós-sinápticos mecanismos que podem contribuir para neuropatologias. Uma abordagem semelhante pode ser usado para quantificar a morfologia da coluna ou motilidade em qualquer neurônio spiny, incluindo piramidais do hipocampo, Purkinje, ou neurônios espinhosos médios.

O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para examinar as propriedades fundamentais de proteínas sinápticas e / ou os efeitos de tratamentos farmacológicos em espinhas dendríticas. Além disso, ele pode ser usado para avaliar as mudanças na localização de proteínas sinápticas endógena variando de proteínas de andaime de glutamato receptores. Além disso, permite não só a análise detalhada morfométrica de espinhos fixo, mas também a medição dos efeitos das proteínas sinápticas ou tratamento farmacológico na motilidade espinha dendrítica. Estas técnicas de lapso de tempo de imagem também pode ser modificada para examinar o tráfico de proteínas, com ou sem, simultaneamente, examinando morfologia espinha dendrítica.

Análise detalhada da morfologia e motilidade espinha dendrítica é uma ferramenta essencial para investigar os efeitos potenciais de mutantes proteínas sinápticas e como as mutações nessas proteínas doença associada sináptica pode afetar a estrutura e função da sinapse, contribuindo assim para a fisiopatologia de uma série de distúrbios do o cérebro.

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Disclosures

Produção deste trabalho foi suportado pelo Metamorph (dispositivos Molecular, Inc.).

Acknowledgments

Agradecemos a Kelly Jones para edição cuidadosa. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01MH 071316, Associação de Alzheimer, a Aliança Nacional de Pesquisa em Esquizofrenia e Depressão (NARSAD), ea Aliança Nacional para a Pesquisa do Autismo (Naar) (PP); American Heart Fellowship Associação de Pós-Doutorado (DPS); americano coração Fellowship Association Predoctoral (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

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References

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Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS
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Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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