Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

وقد حددت الدراسات التي أجريت مؤخرا العديد من الطفرات في البروتينات المرتبطة متشابك أمراض الدماغ. الابتدائية العصبونات القشرية مثقف توفر مرونة كبيرة في دراسة الآثار المترتبة على هذه البروتينات المرتبطة بمرض في العمود الفقري شجيري التشكل والحركة.

Abstract

شجيري العمود الفقري هي مواقع للغالبية من الاتصالات مثير داخل الدماغ ، وشكل المقصورة بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي. هذه الهياكل هي غنية في أكتين ولقد ثبت أن تكون ديناميكية للغاية. استجابة لدونة Hebbian الكلاسيكية فضلا عن إشارات neuromodulatory ، يمكن تغيير شكل العمود الفقري شجيري والرقم ، وهو ما يعتقد أنه سيكون حاسما لتنقيح الدوائر العصبية ومعالجة وتخزين المعلومات في الدماغ. ضمن العمود الفقري شجيري ، وهي شبكة معقدة من البروتينات خارج الخلية إشارات الارتباط مع cyctoskeleton أكتين السماح للسيطرة على التشكل شجيري العمود الفقري والعدد. وقد أثبتت الدراسات Neuropathological أن عددا من الحالات المرضية ، بدءا من الفصام لاضطرابات طيف التوحد ، وعرض غير طبيعي التشكل العمود الفقري شجيري أو أرقام. علاوة على ذلك ، وقد حددت الدراسات الجينية الأخيرة طفرات في الجينات التي تكود بروتينات عديدة متشابك ، مما أدى إلى اقتراحات بأن هذه البروتينات يمكن أن تسهم في مرونة العمود الفقري الذي الشاذة ، في جزء منه ، الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء هذه الاضطرابات. من أجل دراسة الدور المحتمل لهذه البروتينات في السيطرة morphologies العمود الفقري شجيري / العدد ، واستخدام الخلايا العصبية مثقف القشرية يوفر مزايا عدة. أولا ، وهذا النظام يسمح التصوير ذات الدقة العالية في العمود الفقري في الخلايا الجذعية الثابتة ، فضلا عن الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الحية. ثانيا ، هذا النظام في المختبر يسمح للتلاعب السهل وظيفة البروتين التعبير عن البروتينات المشوهة ، التي يبني shRNA ضربة قاضية ، أو العلاجات الدوائية. هذه التقنيات تسمح للباحثين أن تبدأ في تشريح دور الأمراض المرتبطة البروتينات والتنبؤ بكيفية حدوث طفرات من هذه البروتينات قد تعمل في الجسم الحي.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن استخدام البروتوكول الموصوفة هنا لدراسة مورفولوجية شجيري العمود الفقري وديناميكية في أي نظام مثقف الابتدائي.

1. إعداد الابتدائي الثقافات عصبون القشرية

  1. إعداد عالية الكثافة الثقافات عصبون القشرية من سبراغ داولي أجنة الفئران E18 والثقافة في المتوسط ​​المصل خالية الدبقية مكيفة 1-2.
  2. الموت ببطء one الفئران الحوامل (E18) وفقا لإجراءات لاعب ، وإزالة الرحم بسرعة (مع الأجنة في ذلك) ووضعها في صحن بيتري 100 ملم على الجليد.
  3. قطع الرحم الغشاء الذي يحيط بالجنين ومفتوحة ، وعقد الجنين قبل الرقبة (الحبل السري سليمة) ملقط مع أحد ، واستخدام آخر ملقط لفروة الرأس قشر من الخلف إلى الأمام ، وفتحة في الجمجمة مفتوحة مع ملقط حاد الحافة على طول خط الوسط من الخلف إلى الأمام.
  4. إزالة المخ بأكمله مع ملقط المنحني (في حركة غير مسبوقة) ووضع في طبق بتري 100 ملم تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة CA2 + -- 2 والمغنيسيوم HBSS + خالية.
  5. عقد جذع الدماغ مع واحد الملقط ، نصفي أخرى منفصلة مع ملقط ، إزالة الحصين والمخطط ، القشرة منفصلة وبعناية قشر النسيج القشرية الخروج من السحايا.
  6. تجمع تشريح الأنسجة القشرية ، اللحم المفروم ، ونقل لفترة وجيزة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 4 مل قبل تحسنت التربسين / EDTA (0.25 ٪ التربسين ، 0.53 ملي EDTA ؛ HyQ التربسين من HyClone SH30042.01) ؛ في احتضان 37 درجة مئوية لمدة حمام ماء ~ 15 دقيقة ، وإزالة التربسين / EDTA قدر الإمكان مع ماصة البلاستيكية ، إضافة 1.5 مل المتوسطة العصبية.
  7. فصل الأنسجة هضمها ميكانيكيا بواسطة pipetting لطيف مع ماصة 5 مل (~ 10 السكتات الدماغية ، وتجنب خلق فقاعات الهواء) ، إضافة 2 مل المتوسطة ، اسمحوا تسوية لمدة 30 ثانية ، ثم نقل طاف 2 مل في أنبوب 15 مل.
  8. كرر الخطوة 6 مرتين (وينبغي أن يستغرق حوالي 15 دقيقة اجمالي ~).
  9. تدور في تعليق خلية 200G لمدة 2 دقيقة.
  10. إزالة طاف (مع ماصة 5 مل -- لا نضح الفراغ) ؛ تخفيف بيليه قبل التقليب ضد أصابع أسفل ؛ بيليه الخلية resuspend في المتوسط ​​5 مل وتصفيتها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل.
  11. مزيج 10 ميكرولتر التعليق الخلية و 10 ميكرولتر التريبان الأزرق ؛ عدد خلايا قابلة للحياة (التريبان الأزرق الاستبعاد) مع عدادة الكريات.
  12. العائد النموذجية : 5 × 10 6 خلية / الدماغ ؛ تمييع للكثافة المرغوبة (مثل 1.5 × 10 6 خلية / مل) لطلاء.
  13. ملء صفائح الثقافة مع وسائل الاعلام الطلاء (وسائل الإعلام Neurobasal تستكمل مع 2 ٪ B27 ، و 0.5 ملم والجلوتامين البنسلين 1 ٪ : stretomycin) (ناقص حجم إجمالي حجم الطلاء) التي تحتوي على 18 جولة مم أو 22x22 ملم coverslips مربع ، مغلفة بولي - D - يسين ( 0.2 ملغ / مل ، سيجما) الذائب في 0.1 العازلة البورات M (3.1g / لتر حمض البوريك ، 4.8g / L البوراكس ، ودرجة الحموضة 8.5 ، فلتر تعقيم) ؛ الحجم الكلي لمدة 12 لوحة جيدا = 0.8 مل / أيضا.
  14. لوحة الخلايا العصبية في كثافة المنصوص عليها في الخطوة التالية ؛ تفريق الخلايا بالتساوي بواسطة هزاز لطيف / تنصت.
  15. كذلك لمدة 12 لوحات (3.5cm / 2 أيضا) : (مرحبا الكثافة 3 × 10 5 / إضافة 857/mm = 2) (منتصف الكثافة 1.5 × 10 5 / إضافة 430/mm = 2) ؛ 6 - جيدا لوحات (9.6cm / 2 أيضا) : (مرحبا الكثافة 9 × 10 5 / إضافة 624/mm = 2) (منتصف الكثافة 4.5 × 10 / 5 = جيد 312/mm 2).
  16. ساعة واحدة بعد الطلاء ، واستبدال كافة المتوسطة مع المتوسطة الطازجة (وسائل الاعلام Neurobasal تستكمل مع 2 ٪ B27 ، و 0.5 ملم والجلوتامين البنسلين 1 ٪ : stretomycin). لأن الحطام الخلية تميل إلى تسوية في وسط الدوامة ، وأيضا لوحات الأولى لتسهيل إزالة الأنقاض ، وأن يكون حريصا على عدم السماح للخلايا جافة في أي وقت.
  17. تغيير نصف المتوسط ​​مرتين كل أسبوع بعد ذلك (إزالة ~ 300-350 ميكرولتر من كل جانب ، وإضافة 400 ميكرولتر حرارة متوسطة جديدة لتغذية كل بئر).
    اختياري : في 4 DIV إضافة 200 ميكرومتر D ، L - حمض الأميني phosphonovalerate (D ، L - APV ، صعود والعلم) لتغذية المتوسط ​​؛ الخلايا العصبية الثقافة في المتوسط ​​Neurobasal تستكمل مع 2 ٪ B27 ، و 0.5 ملم والجلوتامين البنسلين 1 ٪ : stretomycin + 200 ميكرومتر APV.
  18. تنمو الخلايا العصبية الأولية الثقافات القشرية ل24-28 يوما في المختبر (DIV) ، كما في هذا الوقت العمود الفقري شجيري نقطة عرض مورفولوجيا ناضجة (أي أنها شكل اتصالات مع متشابك قبل الشركاء ، ويكون لها وجها واضحا مثل هيكل) و تقابل مرحلة المراهقة المبكرة في القوارض 3-4. يمكن tranfected الخلايا العصبية المزروعة في الجولة 18 ملم وcoverslips تعامل عقاقيري ، قبل أن يتم ثابتة ، immunostained ، والتقط باستخدام المجهر مبائر واستخدامها لتحليل مفصل للmorphometeric شجيري العمود الفقري. ويمكن عندئذ الخلايا المزروعة في coverslips 22x22 ملم مربع يمكن استخدامها في تجارب التصوير الوقت الفاصل بين العمود الفقري للتحقيق في ديناميات شجيري.

2. ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الأولية القشرية مثقف

  1. هي العصبونات القشرية transfected 2-3 أيام قبل التجارب باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. إعداد "H - DMEM" عن طريق موازنة درجة حموضة (DMEM Dulbecco ومتوسطة النسر التعديل ، ولا الجلوتامين ،Invitrogen 11965-092) مع HEPES 10 العقيمة مم (4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض ؛ MediaTech Cellgro 25-060 - CI ، 1M ، ودرجة الحموضة 7). الحارة إلى 37 درجة مئوية.
  3. نقل إلى coverslips 600/1000 ميكرولتر (coverslips ملم 18/22x22) قبل تحسنت (37 درجة مئوية) للمضادات الحيوية الجديدة خالية من المتوسط ​​(متوسطة Neurobasal ، B27 ، و 0.5 ملي الجلوتامين) ، واحتضان خلايا في ترطيب 37 حاضنة درجة مئوية ، على أن تستكمل مع CO 2 5 ٪ لمدة 30 دقيقة.
  4. لكل ساترة ، إضافة مبلغ معين من الحمض النووي (DNA البلازميدات واحدة أو متعددة ، على سبيل المثال لpEGFP مخطط خلية التشكل والموسومة ، متحولة بروتين متشابك ؛ 1-2 ميكروغرام اعتمادا على بناء) إلى 50 ميكرولتر من H - DMEM ؛ السماح للوقوف لمدة 5 دقائق.
  5. لكل ساترة ، إضافة 06/04 ميكرولتر (18/22x22 coverslips ملم) Lipofectamine 2000-50 ميكرولتر H - DMEM ؛ السماح للوقوف لمدة 5 دقائق.
  6. مزيج دقيق من أنابيب الخطوات 1.3 و 1.4 ، للحفاظ على ما لا يقل عن 20 دقيقة في 37 حاضنة ترطيب درجة مئوية ، على أن تستكمل مع 5 ٪ CO 2. مجمع مستقرة لمدة تصل إلى 6 ساعات حسب الشركة المصنعة.
  7. إضافة Lipofectamine 2000/DNA خليط من 1.5 نقطه نقطه خطوة إلى الخلايا. احتضان خلايا في ترطيب حاضنة 37 درجة مئوية ، على أن تستكمل مع CO2 5 ٪ لمدة 4 ساعات.
  8. استخدام التغذية المتوسطة من الخطوة 1.1 (300/600 ميكرولتر) ، الملحق مع حرارة ما قبل (37 درجة مئوية) 400/800 ميكرولتر المتوسطة التغذية الطازجة (coverslips 18/22x22 ملم). 1.6 الخطوة التالية ، coverslips نقل الى متوسطة تحتوي القديمة والجديدة المتوسطة التغذية.
  9. تتيح التعبير عن البلازميدات أن يستمر لمدة 2-3 أيام.

3. علاج الخلايا العصبية الأولية القشرية مثقف نمت يوم 18 ملم coverslips

ويمكن أيضا الخلايا العصبية المزروعة في coverslips 18 مم ، transfected سابقا ، تخضع بسهولة للعلاجات الدوائية.

  1. إعداد ACSF (الاصطناعي السائل النخاعي ، في ملي : 125 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 26.2 NaHCO 3 ، 1 ص ناه 2 4 ، 11 السكر ، و 5 HEPES ، 2.5 و 1.25 CaCl 2 2 MgCl مع 200 ميكرومتر D ، L - APV). الحارة إلى 37 درجة مئوية. قبل احتضان coverslips في ACSF 900 ميكرولتر الدافئ ل 30-60 دقيقة. لا يمكن أن يؤديها قبل العلاج مع مثبطات خلال هذا الوقت.
  2. إعداد وكلاء الدوائية / مركبة من الحلول الأسهم إلى التركيز 10X العمل ؛ إجراء التخفيفات من الحلول في ACSF. إضافة بعناية وكيل / مركبة على الخلايا (المجلد الأخير من 1000 ميكرولتر ، إلى التركيز النهائي لل1X وكيل / سيارة) ، والسماح لمواصلة العلاج عن الوقت المطلوب 5.
  3. العلاج (s) التالية ، وإصلاح الخلايا وعملية immunocytohistochemistry.

4. التثبيت وimmunocytohistochemistry (ICC)

  1. إصلاح الخلايا العصبية في أي 4 ٪ الفورمالديهايد / 4 ٪ PBS السكروز (800 ميكرولتر) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، أو في الفورمالديهايد 4 ٪ / 4 ٪ PBS السكروز (800 ميكرولتر) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها يغسل 2X في برنامج تلفزيوني ، تليها 10 دقائق مع الإصلاح قبل المبردة (-20 درجة مئوية) الميثانول (800 ميكرولتر) في 4 درجات مئوية. تثبيت يعمل من خلال تغيير طبيعة الميثانول وعجل البروتينات. هذا الإجراء يؤدي إلى فضح من البروتينات في كثافة بعد متشابك (PSD) ، وكذلك في المناطق الغنية الدهن.
  2. غسل coverslips في برنامج تلفزيوني (800 ميكرولتر) ، 2X ، لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  3. Permeabilize وكتلة الخلايا في وقت واحد في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 ٪ مصل الماعز العادية و 0.1 ٪ تريتون - X - 100 (800 ميكرولتر) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت ضد GFP ، حاتمة العلامة (مثل بلده ، myc ، V5) أو البروتينات الذاتية ، التي تحتوي على برنامج تلفزيوني الماعز العادي 2 ٪ في تركيز المصل المناسب. تأخذ طبق 15 سم ، حتى تقسيمه إلى مربعات ، وعدد منهم ، وتغطي مع parafilm. إضافة نحو 80 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة وكتلة لparafilm (نقطة واحدة لكل متر مربع) ، وساترة مكان إلى الضد / كتلة الاختلاط مع الخلايا أسفل. حضنت بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  5. غسل coverslips في برنامج تلفزيوني ، 3X لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  6. تمييع اليكسا ، مترافق الأجسام المضادة الثانوية (Invitrogen) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 ٪ مصل الماعز العادية على التركيز المناسب. احتضان الأجسام المضادة الثانوية بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.4 ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، محمية من الضوء.
  7. غسل coverslips أخرى 3X 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني.
  8. coverslips جبل على الشرائح باستخدام المجهر معيار الذهب إطالة كاشف antifade (Invitrogen).

5. التحليل الكمي للmorphologies العمود الفقري

علينا الحصول على صور من الخلايا العصبية مبائر المفرد والمزدوج الملون (الخلايا والبروتين GFP معربا عن بناء أو الذاتية من الفائدة) باستخدام مجهر زايس باسكال LSM5 مبائر. لجميع تجارب التصوير اختيار الخلايا العصبية الهرمية صحية ليمكن تصوير واستخدامها في تحليل لاحق. الخلايا العصبية هي الخلايا السليمة التي لا تعرض أي إشارة استغاثة من blebbing أو بسبب العلاج أو التثبيت ، والتي تحتوي على كامل ، شجرة شجيري دون انقطاع.

  1. الحصول على صور من الخلايا العصبية باستخدام 63x النفط الغمر الهدف (زايس) مع NA (الأسطواناتالفتحة erical) من 1.4 ، كما Z - سلسلة من الصور 3-8 ، وبلغ متوسط ​​4 مرات ، مع فترات 0.37 ميكرون ، 1024x1024 بكسل القرار في سرعة تفحص 2.5 ثانية لكل مقطع. الثقافات التي لا يمكن مقارنتها مباشرة إلى ضرورة أن يكون تصويره مع المعلمات اقتناء نفسه. وينبغي تحليل الخلايا العصبية 10-20 / الشرط ، كل 3-5 تجارب منفصلة ، و 2 من 100 ميكرون التشعبات في الخلايا العصبية. وينبغي القيام بتجارب على المكفوفين والثقافات الشقيقة. ضبط كسب كاشف وتعويض ليشمل العمود الفقري رقيقة حتى الفلورسنت بشكل خافت دون خلق هالة حول تغصن ، مثل أن الانتقال بين إشارة الفلورسنت في العمود الفقري والخلفية غير حادة ، مما يسمح الكمي الدقيق. الحفاظ على المعلمات اقتناء الشيء نفسه بالنسبة لجميع عمليات التفحص في التجربة نفسها.
  2. يمكن الحصول على صور GFP باستخدام خط ليزر الأرجون ، ومثيرة في 488 نانومتر ، وجمع مع مرشح تمرير النطاق في 505-530 نانومتر. immunostained صور overexpressed البروتينات أو البروتينات الذاتية يمكن جمعها مع 568 an اليكسا الضد الثانوية (Invitrogen) باستخدام الليزر HeNe مثيرة في 543 نانومتر ، وجمع باستخدام فلتر طويلة تمر في 560 نانومتر. إبقاء القوى الليزر إلى أدنى حد ممكن لتجنب photobleaching من العينات.
  3. MetaMorph باستخدام البرمجيات (الأجهزة الجزيئية ، وشركة) ، واثنين من الأبعاد ، الخلفية تطرح ، وتستخدم عمليات إعادة الإسقاط أقصى Z - سلسلة الصور للتحليل الكمي وmorphometric. لفحص morphologies في العمود الفقري شجيري والانهيار Z - سلسلة الصور ومعايرة المسافة المطلوبة ، ثم عتبة لتشمل جميع أشواك بطريقة عتبة يتوافق تماما مع الخطوط العريضة للأشواك (الشكل 2E ، F). ينبغي أن يقاس فقط على العمود الفقري التشعبات الثانوية والثالثية (طولها الإجمالي 100 ميكرون في الخلايا العصبية) للحد من التقلبات ، وقياسات للقطاعات تحتاج إلى إجراء بين نقاط فرع. مخطط يدويا في كل العمود الفقري بحيث يصبح محيط مغلق (الشكل 2G).
  4. قياس البارامترات التالية تلقائيا في العمود الفقري MetaMorph : طول العمود الفقري ، واتساع العمود الفقري ، ومساحة المقطع العرضي ، والعمود الفقري شجيري الكثافة الخطي. تصدير المعلمات العمود الفقري شجيري morphometric في Excel لالكمي. استخدام اختبارات الطالب ر المفردة لتحديد الدلالة الإحصائية للفروق بين مجموعتين ، واحدة في اتجاه ويمكن استخدامها للمقارنة بين ANOVA ثلاثة أو أكثر من الفئات ، تليها المخصصة آخر توكي - B للمقارنات متعددة. يمكن إجراء التحليل الإحصائي في Excel ، أو GraphPad SPSS. تحليل المؤامرات التراكمي باستخدام اختبار كولموغوروف - سميرنوف (KS اختبار) 2،5-6.

6. الكمية المناعي (IF)

الكمي للالمناعي باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات معينة متشابك ، تصور باستخدام 568 اليكسا الضد الثانوية (Invitrogen) ، يمكن أن تستخدم لدراسة التغيرات في تجميع والتوطين متشابك من البروتينات متشابك الذاتية.

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر كما هو موضح أعلاه. استخدام ليزر الأرجون وHeNE (انظر أعلاه) لمضاعفة الخلايا العصبية الملطخة الصورة. فقط صورة العصبونات الهرمية الصحية التي لا تعرض أي علامات على الضيق.
  2. لقياس كثافة مضان ، طرح الخلفية المقابلة لرمح شجيري (الشكل 2I والأصفر مربع) لإنشاء "الخلفية تطرح" الصورة (الشكل 2J) باستخدام MetaMorph. صور عتبة بالتساوي لتشمل مجموعات مع اثنين على الأقل كثافة أضعاف فوق تغصن المجاورة (الشكل 2K). المناطق على طول الخطوط العريضة التشعبات (100 ميكرون في الخلايا العصبية) باستخدام "محيط" المنفعة (الشكل 2D) وقياس تلقائيا الكثافة الخطي (number/100 طول تغصن ميكرون) ، وكثافة المتكاملة (المجموع إذا كثافة) من كل مجموعة متشابك باستخدام MetaMorph 7-9.
  3. لقياس نسبة المحتوى العمود الفقري للبروتين متشابك ، أولا تحديد تجميع البروتين GFP thresholding صورة العمود الفقري لتحديد مورفولوجيا (الشكل 2E ، F) باستخدام MetaMorph. نقل مناطق الفائدة التي تضم فقط العمود الفقري للصور من البروتين من الفائدة التي احتلتها في قناة أخرى (الشكل 2G ، H). حساب عدد كتل البروتين وقياس كثافة المناعي متكامل داخل العمود الفقري العمود الفقري لتقييم محتوى البروتين.
  4. تصدير IF المعلمات من البروتينات متشابك في Excel لالكمي. استخدام اختبارات الطالب ر المفردة لتحديد الدلالة الإحصائية للفروق بين مجموعتين ، واحدة في اتجاه ويمكن استخدامها للمقارنة بين ANOVA ثلاثة أو أكثر من الفئات ، تليها المخصصة آخر توكي - B للمقارنات متعددة. يمكن إجراء التحليل الإحصائي في Excel ، أو GraphPad SPSS.

7. الوقت الفاصل بين التصوير

لدراسة ديناميات شجيري العمود الفقري ، مثل التغيرات في العمود الفقري أو حركية العمود الفقري في التشكل في العمود الفقري على حدة ، ولا وجود أو عدم وجود مرض البروتينات المرتبطة متشابك ، وتنمو الخلايا العصبية في القشرة الأولية مثقف coverslips 22x22 ملم مربع لDIV 24-28. Neurيمكن أن تكون إضافات المزدوج مع transfected GFP / mCherry التشكل لتعريف الخلية ، والموسومة fluorescently البروتينات متشابك متحولة كما هو موضح أعلاه. لجميع التجارب والتصوير ، واختيار الخلايا العصبية الهرمية صحية معربا عن كلا يبني ، ويمكن أن تخضع هذه الخلايا للعلاج الدوائي ، وتصوير تستخدم في التحليلات اللاحقة.

  1. قبل احتضان الخلايا العصبية المزروعة في coverslips 22x22 ملم في 1.5 مل ACSF 30-60 دقيقة في ترطيب حاضنة 37 درجة مئوية ، على أن تستكمل مع 5 ٪ CO 2. ويمكن أيضا أن تكون الخلايا ما قبل المعالجة بالأدوية في هذه المرحلة كذلك. pre-incubation/treatment التالية ، وخلايا نقل إلى غرفة التصوير المرحلة المغلقة (وارنر ، RC - 30HV). المحافظة على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع وحدة تحكم (وارنر ، TC - 344B) 2،5-6،10.
  2. دراسة حركية العمود الفقري ، وقبل معالجة الخلايا مع المخدرات أو مركبة لمدة 30-60 حتى قبل نقل الخلايا إلى غرفة التصوير. يسمح هذا الوقت الكافي للدواء / مركبة لبدء مسارات الرسول الثانية خلال الخلايا العصبية. الحصول على الصور من خلال الهدف 63X (Ziess ، NA 1.4) 2X مع المتوسط ​​في 10 دقائق. اختيار الخلايا العصبية السليمة مع morphologies الهرمي العام معربا عن GFP / أو بروتين فلوري mCherry الموسومة. لتقليل photodamage ، وخفض قوة الليزر إلى 0.5-1 ٪. وسوف يعامل مقارنات مركبة مقابل المخدرات معاملة الخلايا تظهر التغييرات في حركية العمود الفقري. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم حركية العمود الفقري قبل العلاج وبعده ، عن طريق رذاذ من المخدرات / المركبات (أنظر أدناه). جمع Z - المداخن في كل نقطة زمنية.
  3. لتعقب التغييرات في مورفولوجية شجيري العمود الفقري مع مرور الوقت ، coverslips صورة لمدة 1 ساعة لتأسيس تغييرات أساسية في التشكل. في هذا الوقت ، يروي العقار / السيارة إلى غرفة التصوير باستخدام مضخة تمعجية (جيلسون ، Minipuls 3) ، والخلايا العصبية صورة لساعة أخرى. اكتساب مبائر Z - مداخن باستخدام النفط الهدف 63X (Ziess ، NA 1.4) ، مع 2X المتوسط ​​كل 10 دقائق. تقليل قوة الليزر إلى 0.5-1 ٪ للحد من photodamage.
  4. في نهاية كل دورة والتصوير ، والحصول على صورة من الخلايا العصبية 20X بأكمله إلى مستوى التأكد من photodamage. وينبغي حذف أي الخلايا العصبية واظهار علامات استغاثة من الكمي. وينبغي أن انهارت Z - أكوام من كل نقطة في الوقت إلى توقعات 2D في Metamorph. يمكن تطبيقها تبعا لجودة الصورة ومستوى ترنسفكأيشن ، مرشح الوسط تجاوز الطرح أو الخلفية في Metamorph لإنتاج صور واضحة للتحليل.
  5. لتقييم العمود الفقري وتتحول الحركية ، يجب أن الصور التي التقطت في بداية ومنتصف ونهاية الدورة 100 دقيقة التصوير تكون مرمزة ومضافين في MetaMorph. لا يقل عن 100 ميكرون من تغصن لكل خلية تحتاج إلى تحليلها. يتم تعريف حركية العمود الفقري وكسر مجموع العدد الإجمالي للأحداث حركية ، والإرشاد ، أي تراجع ، أو حركية رئيس تتحول تبارزي تطبيع لعدد 6،11 العمود الفقري. هذا الأسلوب التدابير وتيرة الأحداث ، دون النظر في أحجامها ، وهي تجمعات جميع أنواع المناسبات ، ويتم تقدير عام في القدرة على الحركة بشكل عام. يتم تعريف الحدث كما تبارزي ظهور نتوء جديد عابر من رأس رمح أو العمود الفقري شجيري. يتم تعريف الحدث كما تراجع عن اختفاء نتوء القائمة أو عابرة يقع على رأس رمح أو العمود الفقري شجيري. يتم تقسيم مجموع الأحداث تبارز والإرشاد من قبل عدد من العمود الفقري في منطقة تغصن أن كميا.
  6. لتقييم التغيرات في العمود الفقري مورفولوجيا الفردية في الاستجابة للعلاج بالعقاقير ، وقياس مساحة المقطع العرضي في العمود الفقري شجيري أو شجيري الكثافة الخطي العمود الفقري في نقطة زمنية -1 ساعة (1 ساعة قبل التروية) ، التي سبقت مباشرة العلاج وعند كل مرة التالية نقطة العلاج. تطبيع كل نقطة من الوقت للساعة 1 قبل إلى نقطة زمنية العلاج. لتحديد أن التغييرات في مورفولوجية العمود الفقري شجيري أو الكثافة الخطي لم تكن بسبب photodamage وتحليل الخلايا العصبية perfused مع السيارة. ويمكن تحديد الاختلافات في وسائل عن طريق اختبارات الطالب ر المفردة أو واحد عينة الاختبار ر.

8. النهج البديلة ومفاتيح للنجاح

  1. وقد وصفت لنا استنبات الخلايا العصبية في القشرة وجود D ، L - APV ، مثبط مستقبلات NMDA ، من DIV 4 حتى النضج (DIV24 - 28). تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن الخلايا العصبية في زراعة القشرية وجود D ، L - APV لديه مصلحة الحفاظ على الصحة الجيدة للثقافات قشري الخلايا العصبية على المدى الطويل ، فإن وجود D ، L - APV قد تؤثر على التنمية المشبك. ومثل هذا البديل هو ثقافة الخلايا العصبية في غياب D ، L - APV 2،5. عندما زرع الخلايا العصبية في غياب D ، ينبغي إيلاء الاهتمام L - APV إضافية إلى الصحة العامة للثقافات ، كما أن هناك فرصة لزيادة موت الخلايا بسبب الإفراط + CA2 السمسة عبر أكثر نشاطا تنشيط مستقبلات NMDA.
  2. ويمكن استخدام الخلايا العصبية الثقافات وصفها في هذا البروتوكول إلى النظر في الآليات ذات الصلة لتنظيم شجيري العمود الفقري التشكل والحركة من dendritiج أشواك عرض على التشكل ناضجة (أي أنها شكل اتصالات مع متشابك قبل الشركاء ، ويكون لها وجها واضحا مثل هيكل) 2،4،5. بدلا من ذلك ، واستخدام الثقافات في وقت سابق نقطة ، على سبيل المثال قد DIV11 - 16 ، يكون أكثر ملاءمة لمعالجة المسائل ذات الصلة لتشكيل العمود الفقري شجيري ، أو لائحة في العمود الفقري شجيري خلال التنمية في وقت مبكر.
  3. بديل لاستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، هو استخدام واسع المجال البرنامج الموسع للتمنيع ومضان على الحصول على صور من العصبونات القشرية معاملة المثقفين. في تركيبة مع خوارزميات deconvolution المناسبة ، يمكن إجراء تحليل مفصل للmorphometric العمود الفقري في الخلايا الحية أو الثابتة. وعلاوة على ذلك ، فمن الممكن لاستخدام برامج بديلة ، مثل ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) أو Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . أتش تي أم أل ) التي هي البرمجيات الحرة ، لتحليل مورفولوجيا شجيري العمود الفقري.
  4. عند دراسة حركية العمود الفقري شجيري / تحوير استخدام الوقت الفاصل بين التصوير ، ينبغي الإشارة إلى أن استخدام فترات أقصر وقت مضي ، 5-10 دقائق على سبيل المثال ، قد يقدم تحليلا أكثر تفصيلا من العمود الفقري شجيري turnover2 ، 5. استخدام فترات زمنية أقصر قد تحدد أيضا أشكالا أكثر سرعة في العمود الفقري تتحول أنه لن يتم الكشف عن استخدام فترات زمنية أطول.
  5. استخدام الخلايا العصبية القشرية مثقف لديه عدد من العيوب والاهتمامات التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. أولا ، وهو قلق من استخدام الخلايا العصبية القشرية المثقف هو أنه قد يكون هناك تقلب بين الثقافات التي يمكن أن تؤثر على المعلمات مثل كثافة العمود الفقري شجيري. على هذا النحو ، فمن الضروري أن يتم التقيد بها بدقة في النقاط التالية لضمان أقل قدر من التباين. أولا ، يجب أن تبقى معلمات زراعة والكواشف متسقة قدر الإمكان ، بالإضافة إلى ممارسات زراعة جيدة ، وهذا سوف يقلل كثيرا من مستوى التباين بين الثقافات. وثانيا ، من الضروري أن يتم تنفيذ جميع التجارب في نفس الوقت نقطة ، وعلى الثقافات الشقيقة. وينبغي أن يكون بالإضافة الوقت النقطة التي تجرى التجارب التي يتم اختيارها بعناية للسماح للمجرب على طرح الأسئلة المناسبة (انظر النقطة 2 أعلاه). وأخيرا ، فإنه من الأهمية بمكان أن تستخدم ضوابط ملائمة في جميع التجارب ، بحيث يتم فحص ظروف المعاملة دائما النسبية لهذه الضوابط الداخلية. سيؤدي هذا إلى إزالة أي قلق من التباين بين الثقافات.
  6. استخدام الخلايا العصبية القشرية المثقف هو أداة قوية لتمكين الباحثين من دراسة نقدية للآليات التي تعتبر ضرورية لتنظيم التشكل العمود الفقري شجيري والحركة. ومع ذلك ، فمن المهم أن نلاحظ أن هذه الثقافات لا ألخص an في حالة الجسم الحي ، ولا يمكن أن المكونات مثل تنظيم الطبقة القشرية وتأثير أنواع الخلايا الأخرى ، مثل خلايا الدبقية ، على تشكيل المشبك ينبغي معالجتها في النظام المذكور أعلاه. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لتحديد آليات حاسمة يحتمل الكامنة وراء تنظيم التشكل العمود الفقري شجيري والحركة.

9. ممثل النتائج

وقد صممت هذه المقايسات المذكورة أعلاه لتحقيق تغييرات في عدد شجيري العمود الفقري ، والتشكل والحركة استجابة للعلاجات الدوائية و / أو التلاعب الجيني وظيفة البروتين في المختبر. في المختبر ، وقد استخدمت هذه التقنيات ونحن لتوصيف دور البروتينات التي تنظم متشابك الهيكل الخلوي أكتين في العمود الفقري الجذعية ، وبالتالي تغيير هيكلها 2،9. علاوة على ذلك ، فقد استخدمنا هذا الاختبار لتحديد كيفية neuroactive المركبات ، مثل neuromodulators قد يدفع تغييرات في عدد شجيري العمود الفقري ، والتشكل أو الشكل ، وإما وحدها 4،6،10 ، أو في وجود المحفزات التي تعتمد على النشاط 5.

لتقدير دقة قياساتنا من المعلمات أو 1D 2D ، قمنا بقياس أقطار ومناطق المجهرية اللاتكس فلوري (ديوك العلمية) من الأبعاد المعروفة (0.2 ، 0.52 ، 1.0 ميكرومتر) التي تقام في نفس الظروف الخلايا العصبية طوال فترة الدراسة. ظروف التصوير باستخدام نفس العمود الفقري للمقاييس (63X NA = 1.4 النفط الغمر الهدف ، LSM 5 باسكال) تصوير نحن المجهرية ، وتحديد ثم أقطار ومناطق في Metamorph ، وبالمثل مع القياسات العمود الفقري لدينا. ثم قارنا القياسات الفعلية مع أبعاد معروفة من المجهرية.

الرسم البياني في الشكل 1 (Fig.1) يدل على أننا يمكن أن تقيس بدقة مجالات المجهرية من 0.52 ميكرون و1.0 (0.21 ميكرون المناطق = 2 و 2 على التوالي 0،78 ميكرون) (الانحراف المعياري قياس ~ 15 ٪ ، مصنعين تحديد الانحراف المعياري ~ 9 ٪). حتى بالنسبة للالمجهرية 0.2 ميكرومتر كانت قياساتنا قريبة الى حد ما للأبعاد الحقيقية (ولكن مع SD كبير). وهذا يتفق مع resol الجانبي محسوب ution مجهر لدينا مبائر باستخدام هذا الهدف خاصة ، و 0.3 ميكرومتر (باستخدام المعادلة Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. هذا هو أفضل بكثير من هذا القرار المحوري ، والذي يعرف أن الفقراء لالمجاهر مبائر و 2 الفوتون. بالإضافة إلى ذلك ، نحن مصممون تجريبيا الجانبي انتشار نقطة (س / ص المحور) وظيفة (PSF) بقياس الفلورية الخضراء المجهرية قطرها 200 نانومتر (ديوك والعلم) لتكون ~ 0.5 ميكرون. تم تنفيذ هذا التقدير مع فتح ثقب الدبوس ، وبالتالي يمكن أن يفترض أنه عندما يتم إغلاق الثقب ، أن قوات الأمن الفلسطينية لن يكون في الواقع أصغر. ومع ذلك ، وهذا يدل مرة أخرى على أننا قادرون على قياس دقيق مناطق أكبر من 0.196 ميكرون 2 (قطرها = 0.5 ميكرومتر). يعطى مؤشرا على PSF الجانبي الفعلي في (سفوبودا وآخرون) 13 ك "ميكرون يست اقل بكثير من 0.4 ، والذي من شأنه أن يؤدي في منطقة من 0.16 ميكرون 2". هذه المقارنات والاعتبارات النظرية تشير إلى أننا يمكن أن تقيس بدقة مجالات كائنات مماثلة في الحجم إلى العمود الفقري ، لأن أبعاد أشواك قسنا كانت أكبر من هذا الحد القرار (> 0.25 ميكرون 2). لمثل هذه الظروف ، "تقنيات morphometric الكلاسيكية هي الكمية" (13) ، مشيرا الى ان نتمكن من قياس موثوق مناطق العمود الفقري ، وقارن بين العمود الفقري بدقة morphologies في ظروف معاملة مختلفة.

من أجل قياس دقيق مورفولوجيا شجيري العمود الفقري ، ونحن transfected DIV 23 العصبونات القشرية مع بناء EGFP ل 2 يوما. ترنسفكأيشن التالية ، يمكن أن تخضع للعلاج الخلايا ، ويتم إصلاحها ومعالجتها للمحكمة الجنائية الدولية ، حيث تم تعزيز GFP إشارة للسماح للتوزيع حتى عبر تغصن (أو الخلايا العصبية). تصوير ويبين الشكل 2 صورة ممثل عصبون القشرية transfected مع GFP ، وذلك باستخدام المجهر مبائر مع الهدف 63X (NA 1.4) (الشكل 2A). وهذا يسمح للصور عالية الدقة التفصيلية في العمود الفقري شجيري (الشكل 2B). يتم إجراء تحليلات مفصلة morphometric في العمود الفقري شجيري في المختبر باستخدام برنامج Metamorph. هذا البرنامج يسمح لنا ليس فقط لقياس مورفولوجية شجيري العمود الفقري ، ولكن أيضا لدراسة توطين البروتينات الذاتية. وتقدم نظرة عامة للكيفية التي نؤدي هذا التحليل في الشكل 2 (الشكل 2C - G).

تأثير تتسم بكثير من المحفزات التي تعتمد على النشاط هو زيادة في حجم العمود الفقري شجيري 2. ويبين الشكل 3 ممثل الوقت الفاصل بين التصوير من العمود الفقري شجيري من 24 DIV EGFP القشرية معربا عن الخلايا العصبية ، تصوير لمدة 30 دقيقة قبل وبعد التحفيز التي تعتمد على النشاط. هذه التجربة مرور الوقت يؤكد أن هذا النشاط يعتمد على محفزات تزيد حجم العمود الفقري شجيري (الشكل 3A ، B). القاعدية لدراسة حركية العمود الفقري ، وتم الحصول على الصور في الوقت نقطة 0 ، 50 و 100 دقيقة ، وقيست ملحقات العمود الفقري ، والتراجع عنها ، ورئيس حركية تبارزي تتحول بصورة منفصلة ومجتمعة حركية الإجمالي. الرقم 3C - D يؤكد أنه حتى في ظل الظروف القاعدية ، العمود الفقري شجيري من العصبونات القشرية عرض بعض مستوى القدرة على الحركة.

الشكل 1
التين. 1. المقارنة بين المناطق والفعلي للقياس الفلورسنت القضبان المجهرية خطأ. تمثل الانحراف المعياري للقياس المجالات. صور المجهرية من 0.2 ميكرون ، 0.52 ميكرون وميكرون 1. مقياس شريط = 5 ميكرون.

الشكل 2
التين. 2. الكمي للعمود الفقري ومورفولوجيا IF. 25 ألف صورة ، معربا عن DIV EGFP سلسلة - Z قشري الخلايا العصبية مثقف ، تكبير باء العليا نموذجية مورفولوجيا العمود الفقري شجيري العثور على الخلايا العصبية القشرية. جيم EGFP الذاتية والبروتين (GluR1) تراكب. دال منهارة من الهرمية EGFP - transfected تغصن الخلية ؛ هو تتبع التقسيم بين رمح والعمود الفقري يدويا E. متميزة ، ثم ترد superthreshold المناطق التي Metamorph وكميا F. يدوية تعود الخلايا العصبية المستخدمة لتحديد طول العمود الفقري ، واتساع مساحة المناطق مستعرضة G. العزم... بواسطة Metamorph التي تتوافق مع العمود الفقري ، وسيتم نقل العمود الفقري H. الخطوط العريضة لصورة القناة الحمراء (بروتين الذاتية) العمود الفقري لتحديد إشارة محددة. ايك. لتحديد مستقبلات البروتين أو كتلة IF متشابك ، وتستخدم الصور إسقاط Z - السلسلة. وطرح أولا الخلفية رمح شجيرى IF (المربع الأصفر) لإنشاء "الخلفية تطرح" صورة. J. هو thresholded ثم هذه الصورة والبرنامج تلقائيا التدابير منطقة الكتلة والكثافة الخطي ، وإجمالي قيمة الرمادي (IF كثافة) ك. صورة Thresholded من الحانات مقياس H. ، A = 15 ميكرون ، B = 1 ميكرون.

ز "بديل =" الشكل 3 "/>
التين. 3. النشاط تعتمد على التغييرات في مورفولوجية العمود الفقري ، والحركة القاعدية في العمود الفقري شجيري. ألف الوقت الفاصل بين التصوير من العمود الفقري شجيري a ممثل قبل وبعد إضافة حافزا التي تعتمد على النشاط. وقد حثت النشاط التي تعتمد على مؤثرات عن طريق التحول من وسائل الإعلام التجريبية التي تحتوي على ASCF Mg2 + و APV لACSF دون Mg2 APV و + ، ولكن تحتوي على 10 ميكرومتر الكمي باء جليكاين منطقة العمود الفقري شجيري (حجم) ، لتطبيع نقطة -30 الوقت دقيقة (30 دقائق قبل التروية). صور الممثل جيم من النقاط 0 ، 50 و 100 دقيقة من الوقت حركية العمود الفقري شجيري. يظهر تراكب الصور أعلى من 0 (الحمراء) ، 50 (الخضراء) و 100 (الأزرق) نقاط زمنية دقيقة ، في حين أن الصور الموجودة في الأسفل كل نقطة على حدة الوقت. النجمة يدل على تمديد العمود الفقري ؛ السهم الأبيض يدل على تراجع العمود الفقري ؛ رئيس السهم الأخضر يدل على حركية تبارزي ؛ فتح رأس السهم الأصفر يدل على رأس العمود الفقري تتحول دال الكمي لشجيري المعلمات حركية العمود الفقري وحركية مجموع E. 20X صورة العصبونات القشرية معربا عن EGFP التصوير التالية. دورة لتحديد صحة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وصف تقنيات أعلاه لتحليل كمي مفصل لمورفولوجيا شجيري العمود الفقري ، والكثافة الخطي والحركة في أي من الخلايا العصبية ثابتة أو العيش القشرية الأولية وتركز على فهم آثار ما بعد متشابك الآليات التي قد تسهم في neuropathologies. ويمكن استخدام نهج مماثل لتحديد مورفولوجيا العمود الفقري أو في أي الخلايا العصبية الحركية شائك ، بما في ذلك هرمي الحصين ، بركينيي ، أو الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة.

ويمكن تكييف البروتوكول الموصوفة هنا لإلقاء نظرة على الخصائص الأساسية للبروتينات متشابك و / أو من آثار العلاجات الدوائية على العمود الفقري شجيري. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدامه لتقييم التغيرات في توطين البروتينات متشابك الذاتية بدءا من البروتينات سقالة لمستقبلات الغلوتامات. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح ليس فقط تحليل مفصل للأشواك morphometric ثابت ، ولكن أيضا من قياس آثار البروتينات متشابك أو المعالجة الدوائية على حركية العمود الفقري شجيري. ويمكن أيضا هذه المرة الفاصل بين تقنيات التصوير يمكن تعديلها لدراسة الاتجار البروتينات ، مع أو من دون دراسة مورفولوجية واحد شجيري العمود الفقري.

تحليل مفصل للعمود الفقري شجيري التشكل والحركة هي أداة ضرورية للتحقق من الآثار المحتملة للبروتينات متحولة متشابك ، وكيف الطفرات في هذه البروتينات المرتبطة بمرض متشابك قد تؤثر على بنية المشبك وظيفة ، مما يسهم في الفيزيولوجيا المرضية لعدد من اضطرابات الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأيد إنتاج هذا العمل من قبل MetaMorph (الأجهزة الجزيئية ، وشركة).

Acknowledgments

نشكر كيلي جونز للتحرير الدقيق. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01MH 071316 ، جمعية الزهايمر ، والتحالف الوطني لأبحاث الفصام والاكتئاب (NARSAD) ، والتحالف الوطني لأبحاث مرض التوحد (NAAR) (PP) ؛ الأمريكية زمالة جمعية القلب ما بعد الدكتوراه (DPS) ؛ الأمريكية زمالة جمعية القلب Predoctoral (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter