Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Published: July 13, 2011 doi: 10.3791/2794
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Abstract

Dendritik dikenler, beynin içinde eksitatör bağlantılarının büyük çoğunluğu siteleri, ve sinapsların post-sinaptik gözü formu. Bu yapılar aktin zengin ve son derece dinamik olduğu gösterilmiştir. Klasik Hebbian plastisite nöromodülatör sinyallerinin yanı sıra tepki olarak, dendritik dikenler şekli ve sayısı, arıtma ve nöral devrelerin beynin içinde bilgi işleme ve depolama için kritik olduğu düşünülmektedir değiştirebilirsiniz. Dendritik dikenler içinde, proteinlerin karmaşık bir ağ dendritik omurga morfolojisi ve sayısının kontrolü sağlayan aktin cyctoskeleton ekstrasellüler sinyaller bağlantı. Nöropatolojik çalışmalar, şizofreni, otizm spektrum bozuklukları arasında değişen bir dizi hastalık durumlarında, anormal dendritik omurga morfolojisi veya numaraları görüntülemek göstermiştir. Ayrıca, son genetik çalışmalar, bu proteinlerin, kısmen, bu bozuklukların patofizyolojisinde altında yatan anormal omurga plastisite katkıda bulunabilir önerileri yol sinaptik proteinleri kodlayan birçok genlerindeki mutasyonlar belirledik. Dendritik omurga morfolojileri / sayısını kontrol etmek, bu proteinlerin potansiyel rolünü araştırmak için, kültürlü kortikal nöronların kullanımı çeşitli avantajlar sunuyor. Birincisi, bu sistem sabit hücreleri dendritik dikenler yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi canlı hücreler zaman atlamalı görüntüleme için izin verir. İkincisi, in vitro sistemde bu mutant protein, shRNA yapıları tarafından demonte veya farmakolojik tedaviler ifade protein fonksiyonunun kolay manipülasyon için sağlar. Bu teknikler, araştırmacılar, hastalıkla ilişkili proteinlerin rolünü incelemek ve mutasyonlar bu proteinlerin in vivo fonksiyonu nasıl tahmin başlamak için izin verir.

Protocol

Burada açıklanan protokol herhangi bir birincil kültürlü sistemi dendritik omurga morfolojisi ve dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.

1. Primer kortikal nöron kültürlerin hazırlanması

  1. Glia-klimalı serum orta 1-2 adet Sprague-Dawley sıçan E18 embriyolar ve kültür yüksek yoğunluklu kortikal nöron kültürler hazırlayın.
  2. ACUC prosedürlere göre bir gebe sıçan (E18) Euthanize hızlı rahim kaldırmak (fetusların) ve buz üzerinde bir 100 mm Petri kabında yer.
  3. Bir forseps ile (göbek kordonu sağlam) boynundan fetus tutun arka ön kabuğu kafa derisi için başka bir forseps kullanımı ve ön arka orta hat boyunca ucu keskin bir forseps ile kafatası açık kesen, açık rahim ve amniyon membran kesin.
  4. Tüm beyin ve Mg 2 + ücretsiz HBSS kavisli bir forseps (kaşık hareket) yeri ve 10 ml buz Ca2 içeren bir 100 mm petri + ile çıkarın.
  5. Forseps, başka bir forseps ile ayrı hemisferlerin, hipokampus, striatum kaldırmak, ayrı korteks ve dikkatle meninksler kortikal doku soyulabilir beyin sapı tutun.
  6. Havuz kortikal dokularını ayrıştıran, kısaca kıyma ve 4 ml içeren 15 ml tüp transfer önceden ısıtılmış tripsin / EDTA (% 0.25 tripsin, 0.53 mM EDTA; HyClone SH30042.01 HyQ tripsin); 37 ° C su banyosunda inkübe ~~ 15 dakika, tek bir plastik pipet ile tripsin / EDTA mümkün olduğunca çıkarmak için, 1.5 ml nöronal orta eklemek.
  7. 5 ml pipet (~ 10 vuruş, hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının) nazik pipetleme mekanik sindirilir dokuların ayrıştırmaları, razı, 30 saniye sonra 15 ml'lik bir tüpü içine 2 ml süpernatant transferi, 2 ml besiyeri ekleyin.
  8. (~ 15 dakika toplam hakkında almalıdır) iki kez 6 adımı tekrarlayın.
  9. 2 dakika süreyle 200g Spin hücre süspansiyonu.
  10. Supernatant (5 ml pipet yardımıyla vakum aspirat) çıkarın; pelet 5 ml, 50 ml'lik bir tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden orta ve filtre tekrar süspansiyon hücre pelet alt karşı parmak çevirerek gevşetin.
  11. 10 ul hücre süspansiyonu ve 10 ul tripan mavisi karıştırın; bir hematocytometer canlı hücreler (tripan mavi dışlama) Kont.
  12. Tipik verim: 5 x 10 6 hücre / beyin; kaplama için istenen yoğunluğu (örneğin 1,5 x 10 6 hücre / ml) seyreltik.
  13. Poli-D-lizin ile kaplı 18 mm yuvarlak veya 22x22 mm kare lamelleri içeren (toplam hacmi eksi kaplama hacmi), (kaplama medya (stretomycin Neurobasal medya% 2 B27, 0.5 mM glutamin ve% 1 penisilin ile takviye) ile kültür plakaları doldurun 0.2 mg / ml, Sigma) 0.1 M Borat tampon (3.1g / L Borik asit, 4.8g / L boraks, pH 8.5, filtre steril) içinde çözünmüş toplam hacmi 12 plaka = 0.8 ml /.
  14. Sonraki adımda sağlanan yoğunlukta Plaka nöronlar; sallanan / dokunarak nazik hücrelerin eşit olarak dağıtmak.
  15. 6-kuyucuğu (hi-yoğunluğu 3 x 10 = 857/mm 5 kuyu / 2) (orta yoğunluklu 1.5 x 10 5 kuyu / = 430/mm 2): 12-iyi plakalar (3.5cm 2 / iyi) (9.6cm 2 / iyi): (yüksek yoğunluklu 9 x 10 5 kuyu / = 624/mm 2) (orta yoğunluklu 4.5 x 10 = 312/mm 5 kuyu / 2).
  16. Bir saat sonra kaplama, taze orta (: stretomycin% 2 B27, 0.5 mM glutamin ve% 1 penisilin ile desteklenmiş Neurobasal medya) ile tüm orta yerine. Herhangi bir zamanda hücrelerin kuruması için dikkatli olun; hücre artıkları, enkaz kaldırma kolaylaştırmak için ilk önce iyi girdap plakalar ortasında çökmemesi için.
  17. Değişim ½ orta bundan sonra her hafta iki kez (her iyi ~ 300-350 ul kaldırmak ve 400 ul iyi ısınmış taze besleme orta ekleyin).
    İsteğe Bağlı: 4 SAYI 200 mcM D, L-amino-phosphonovalerate orta besleme asit (D, L-APV, Ascent Bilimsel) ekleyin;% 2 B27, 0.5 mM glutamin ve% 1 penisilin ile desteklenmiş Neurobasal orta kültür nöronlar: stretomycin + 200 mcM APV.
  18. Bu sefer noktası dendritik dikenler, in vitro (DIV) 24-28 gün boyunca büyümeye kortikal nöronların primer kültürlerinde (yani pre-sinaptik ortakları ile bağlantı formu ve net bir kafa gibi bir yapıya sahip) olgun bir morfoloji ekran ve 3-4 kemirgenler erken ergenlik karşılık gelir. 18 mm yuvarlak lamelleri yetişen Nöronlar, sabit ile immunohistokimyasal ve konfokal mikroskop kullanarak görüntülü ve dendritik dikenler ayrıntılı morphometeric analizi için kullanılan önce farmakolojik tranfected ve tedavi edilebilir. 22x22 mm kare lamelleri yetiştirilen hücreler, dendritik omurga dinamiğini incelemek için zaman atlamalı görüntüleme deneylerinde kullanılabilir.

2. Primer kültür kortikal nöronlar, Transfeksiyon

  1. Kortikal nöronların Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5 kullanarak deneyler 2-3 gün önce transfekte.
  2. DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta pH dengeleme "h-DMEM" hazırlayın; glutamin,10 mM steril Hepes Invitrogen 11.965-092) (4 - (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit; Mediatech Cellgro 25-060-CI, 1M, pH: 7). 37 ° C sıcak
  3. 600/1000 ul (18/22x22 mm lamelleri) önceden ısıtılmış (37 ° C) nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör yeni antibiyotik-orta (Neurobasal orta, B27, 0.5 mM glutamin) ve inkübe hücreleri tamamlanan lamelleri transfer 30 dakika için% 5 CO 2.
  4. H-DMEM 50 ul her lamel için DNA miktarı (1-2 mg inşa üzerinde bağlı bir veya birden fazla DNA plazmid, örneğin, hücre morfolojisi ve etiketlenmiş mutant sinaptik protein anahat pEGFP); 5 için bekletilmesi dakika.
  5. Her lamel, 4 / 6 ul (18/22x22 mm lamelleri) Lipofectamine 2000 50 ul h-DMEM ekleyip, 5 dakika bekletilmesi.
  6. % 5 CO 2 ile desteklenmiş bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör, en az 20 dakika süreyle iyice tutmak, 1.3 ve 1.4 adımları tüpler karıştırın. Karmaşık Üreticiye göre 6 saate kadar stabildir.
  7. Adım 1.5 damla damla hücreleri Lipofectamine 2000/DNA karışımı ekleyin. 4 saat süreyle% 5 CO2 ile desteklenmiş bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör, hücre inkübe edin.
  8. Adım 1.1 (300/600 ul), önceden ısıtılmış ile ek beslenme, orta (37 ° C) 400/800 ul taze besleme orta (18/22x22 mm lamelleri). Aşağıdaki adım 1.6, eski ve taze besleme orta içeren ortama transfer lamelleri.
  9. Plazmid ifade 2-3 gün devam etmek için izin verin.

3. Tedavi primer kültür kortikal nöronların 18 mm lamelleri üzerinde yetiştirilen

18 mm daha önce transfekte lamelleri, yetişen Nöronlar da kolayca farmakolojik tedavilere tabi tutulabilir.

  1. ACSF (: 125 NaCl, 2.5 KCl, 26.2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glikoz, 5 Hepes, 2.5 CaCl 2 ve 200 mcM 1.25 MgCl 2 D, L-APV mM yapay beyin omurilik sıvısı) hazırlayın. 37 ° C sıcak 30-60 dakika için 900 ul sıcak ACSF öncesi inkübe lamelleri. Inhibitörleri ile tedavi öncesi, bu süre içinde yapılabilir.
  2. 10X bir çalışma konsantrasyonu stok çözümleri farmakolojik ajanların / araç hazırlayın; ACSF çözümler dilüsyonları gerçekleştirmek. Hücreleri (1X acente / aracın nihai konsantrasyonu 1000 ul son hacim) dikkatlice acente / araç ekleyin ve tedavi için istenilen zaman 5 taşımak için izin verir.
  3. Aşağıdaki tedavi (ler), immunocytohistochemistry hücre ve süreç düzeltin.

4. Fiksasyon ve immunocytohistochemistry (ICC)

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde 2X yıkar,% 4 oda sıcaklığında 20 dakika için% 4 formaldehit / sakaroz PBS (800 ul) ya da nöronların Fix veya% 4 formaldehit / 4% sakaroz PBS (800 ul) 10 dakika önceden soğutulmuş (-20 ° C), metanol (800 ul) ile düzeltmek, 4 ° C Metanol fiksasyon proteinler denatüre ve presipite çalışır. Bu prosedür, bir post-sinaptik yoğunluğu (PSD) proteinler deşifre edilmesi, yanı sıra lipid zengin bölgelerde yol açar.
  2. PBS (800 ul), 2x, her biri için 10 dakika lamelleri yıkayın.
  3. Permeabilize ve PBS oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 2 normal keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 (800 ul) içeren hücreler aynı anda blok.
  4. GFP, epitopu tag karşı ortaya primer antikorlar (Onun, myc, V5 gibi) veya endojen proteinler, PBS uygun konsantrasyonda serum% 2 normal keçi içeren ekleyin. 15 cm çanak alın kareler içine bölmek, sayı ve parafilm ile kapak. Hücreleri aşağı bakacak şekilde antikor / blok karışımı 80 parafilm antikor ve blok karışımı ul (kare başına bir damla), yer ve lamel hakkında ekleyin. 4 ° C'de bir gece inkübe edildi.
  5. Her biri için 15 dakika 3x lamelleri, PBS içinde yıkayın.
  6. Uygun konsantrasyonda% 2 normal keçi serumu içeren PBS Alexa-konjuge sekonder antikorlar (Invitrogen) sulandırınız. Oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 1 saat, adım 3.4 'de aynı şekilde ikincil antikorlar inkübe edin.
  7. Yıkama PBS daha 3x 15 dakika lamelleri.
  8. Standart mikroskop üzerine monte lamelleri Altın antifade reaktifi (Invitrogen) uzatmak kullanarak slaytlar.

5. Omurga morfolojileri kantitatif analizi

Biz Zeiss LSM5 Pascal konfokal mikroskop kullanılarak, tek ve çift lekeli nöronlar (hücreler, GFP ve ilgi yapı veya endojen protein ifade) konfokal görüntüler elde. Tüm görüntüleme deneyleri sonraki analizinde kullanılacak olan ve görüntülü sağlıklı piramidal nöronlar seçin. Sağlıklı nöronlar blebbing herhangi bir işaret veya tedavi veya fiksasyon nedeniyle sıkıntı gösterilecek ve tam, kesintisiz dendritik mili içeren hücrelerdir.

  1. NA ile 63x yağ immersiyon objektif (Zeiss) kullanarak görüntüler elde nöronların (num1.4 erical diyafram), 3-8 görüntüleri Z-serisi olarak, bölüm başına 2.5 saniye tarama hızı, 1024x1024 piksel çözünürlük ile 0.37 mikron aralıklarla, ortalama 4 kez. Doğrudan karşılaştırılabilir Kültürler aynı satın alma parametreleri ile görüntülü gerekir. 3-5 ayrı deneyler ve nöron ortalama 100 mikron arasında 2 dendritler 10-20 nöronlar / durum, her analiz edilmelidir. Deneyler kör ve kardeş kültürleri üzerinde yapılmalıdır. Dedektörü kazanç ayarlayın ve omurga floresan sinyal ve arka plan arasındaki geçişin kesin kantifikasyon izin, keskin olduğunu dendrit etrafında halo yaratmadan bile loş floresan ince dikenleri ofset. Aynı deneyi içinde tüm taramalar için satın parametreleri aynı tutun.
  2. 488 nm'de heyecan verici bir argon lazer çizgi, ve 505-530 nm dalga boyunda bir band geçiren filtre ile toplama GFP görüntüler elde edilebilir. Aşırı eksprese proteinler ya da endojen proteinler Görüntüler Alexa 568 ikincil antikor (Invitrogen), 543 nm heyecan verici bir HeNe lazer kullanılarak toplanan ve 560 nm dalga boyunda uzun geçişli bir filtre kullanılarak toplama olabilir ile boyanmış. Numunelerin photobleaching önlemek için lazer güçler minimumda tutun.
  3. MetaMorph yazılımı (Moleküler Devices, Inc), iki boyutlu, arka plan çıkarılır, Z-serisi görüntülerin maksimum projeksiyon rekonstrüksiyonlar morfometrik analizi ve ölçümü için kullanılır. Dendritik dikenler morfolojileri incelemek için, çöküşü Z-serisi görüntüleri, eşik dikenler anahat (Şekil 2E, F) tam olarak karşılık geldiği bir şekilde tüm dikenleri eşik sonra gerekli olan mesafeyi kalibre ve. Sadece ikincil ve üçüncül dendritler (nöron ortalama 100 mikron toplam uzunluğu) dikenler değişkenliği azaltmak için ölçülen ve şube nokta arasındaki segment ölçüm yapılması gereken olmalıdır. (Şekil 2G) kapalı bir çevre olacak, böylece omurga el her anahat.
  4. MetaMorph aşağıdaki omurga parametreler otomatik olarak ölçün: omurga uzunluğu, omurga genişliği, kesit alanı, ve dendritik omurga lineer yoğunluk. Dendritik omurga morfometrik parametrelerin ölçümü için Excel içine ihracat. Iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirlemek için Öğrenci eşleştirilmemiş t testleri, tek yönlü ANOVA, Tukey-b post hoc çoklu karşılaştırmalar için, üç ya da daha fazla grupları karşılaştırmak için kullanılan olabilir. İstatistiksel analizler, Excel, GraphPad veya SPSS yapılabilir. Kolmogorov-Smirnov testi (KS testi) 2,5-6 kümülatif araziler kullanılarak analiz edin.

6. Kantitatif immünofloresan (IF)

Immünofloresan kullanarak belirli sinaptik proteinlere karşı antikorlar Kantitasyonu, kümeleme ve endojen sinaptik proteinlerin sinaptik lokalizasyon değişiklikleri incelemek için kullanılır, Alexa 568 ikincil antikor (Invitrogen) kullanılarak görüntülendi.

  1. Yukarıda açıklandığı gibi bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntüler elde. Argon ve HeNe lazer görüntü çift lekeli nöron (bkz. yukarıda) kullanın. Sadece görüntü sağlıklı, piramidal sıkıntı herhangi bir belirti göstermez nöronlar.
  2. Floresan yoğunluğu ölçümleri için, dendritik mili (Şekil 2I, sarı kare) karşılık gelen MetaMorph kullanarak bir "arka plan çıkarılır" görüntü (Şekil 2J) oluşturmak için arka plan çıkarmak. Aynı şekilde eşik görüntüleri kümelerin yoğunluğu bitişik dendrit (Şekil 2K) üzerinde en az iki kat ile. Dendritler (nöron ortalama 100 mikron) MetaMorph kullanarak "çevredeki" aracı (Şekil 2B) ve lineer yoğunluk (number/100 mikron dendrit uzunluğu) otomatik olarak ölçen ve her bir sinaptik küme entegre yoğunluğu (şiddeti IF toplam) ile birlikte Anahat bölgeleri 7-9.
  3. Göreceli omurga sinaptik bir protein içeriğini ölçmek için, ilk MetaMorph kullanarak omurga morfolojisi (Şekil 2E, F) belirlemek için GFP görüntü eşikleme protein kümeleme belirlemek. Sadece diğer kanal (Şekil 2G, H) yakalanan ilgi protein görüntüleri için dikenler ilgi bölgelerinde aktarın. Protein kümelerinin sayısını ve omurga protein içeriği değerlendirmek için dikenler içinde immünofloresan entegre yoğunluğu ölçümü.
  4. İhracat IF parametrelerin ölçümü için Excel içine sinaptik proteinlerin. Iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirlemek için Öğrenci eşleştirilmemiş t testleri, tek yönlü ANOVA, Tukey-b post hoc çoklu karşılaştırmalar için, üç ya da daha fazla grupları karşılaştırmak için kullanılan olabilir . İstatistiksel analizler, Excel, GraphPad veya SPSS yapılabilir.

7. Zaman atlamalı görüntüleme

Incelemek 24-28 DIV 22x22 mm kare lamelleri kültüre birincil kortikal nöronların dendritik omurga, omurga motilite veya bireysel dikenler omurga morfoloji değişiklikleri, hastalıkla ilişkili sinaptik proteinlerin varlığı ya da yokluğu gibi dinamikler, büyümeye. NeurEklentiler, GFP / mCherry ile hücre morfolojisi tanımlamak için çift transfekte ve yukarıda açıklandığı gibi, floresan mutant sinaptik proteinleri etiketli olabilir. Tüm görüntüleme deneyler için, hem de yapıları ifade sağlıklı piramidal nöronlar seçin; bu hücreler, farmakolojik tedavi tabi görüntülü ve daha sonraki analizlerde kullanılan olabilir.

  1. Nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör 30-60 dakika için 1.5 ml ACSF 22x22 mm lamelleri yetişen Öncesi inkübe nöronlar,% 5 CO 2 ile desteklenmiştir. Hücreler aynı zamanda önceden de bu aşamada ilaçlar ile tedavi edilebilir. Aşağıdaki pre-incubation/treatment, kapalı bir görüntüleme sahne odası (Warner, RC-30HV) transfer hücreleri. 37 sıcaklığını korumak bir kontrol ünitesi ile ° C (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Omurganın hareketliliğini, hücreleri görüntüleme odasına aktarmadan önce 30-60 dakika kadar ilaç veya araç ile ön tedavi hücreleri incelemek için. Bu nöron içinde ikinci haberci yollar başlatmak için ilaç / araç için yeterli zaman sağlar. 2X ortalama 10 dakikalık aralıklarla bir 63X objektif (Ziess, NA 1.4) üzerinden görüntüler elde. GFP / mCherry veya proteinin floresan etiketli ifade piramidal genel morfolojileri ile sağlıklı nöronlar seçin. Fotohasar en aza indirmek için,% 0.5-1 lazer gücü azaltır. Araç-ilaç ile tedavi edilen hücrelerin karşı tedavi Karşılaştırmalar omurga motilite değişiklikleri göstermektedir. Alternatif olarak, ilaç / araç perfüzyon (aşağıya bakın), omurga motilitesi, tedavi öncesi ve sonrası değerlendirilmelidir. Z-yığınlar her zaman bir noktada toplayın.
  3. Morfoloji açısından temel değişiklikler kurmak için zaman içinde değişiklikler dendritik omurga morfolojisi, 1 saat süreyle görüntü lamelleri izlemek için. Şu anda, bir saat daha bir peristaltik pompa (3 Minipuls Gilson,) ve görüntü nöron kullanarak görüntüleme odasına uyuşturucu / araç serpmek. 2X ortalama her 10 dakikada bir 63X petrol hedefi (Ziess NA 1.4) kullanarak konfokal Z-yığınlarının edinin. Fotohasar en aza indirmek için% 0.5-1 lazer gücünü azaltın.
  4. Her görüntüleme oturumun sonunda fotohasar tespit seviyesi, tüm nöron bir görüntü 20X edinin. Sıkıntı belirtisi gösteren herhangi bir nöron kantifikasyon göz ardı edilmelidir. Z-her zaman-nokta yığınları Metamorph 2D projeksiyonları içine çökmüş olmalıdır. Transfeksiyon görüntü kalitesi ve seviye bağlı olarak, medyan-pass filtre veya arka plan çıkarma, analiz için net görüntüler üretmek için Metamorph uygulanabilir.
  5. Omurga geçişin ve motilite değerlendirmek için, 100 dakikalık görüntü oturumun başında, ortasında ve sonunda çekilen görüntüler, renk kodlu MetaMorph içinde üst üste olmalıdır. Dendrit, hücre başına en az 100 mikron analiz edilmesi gerekir. Toplam omurga motilite fraksiyonu motilite olaylar, yani uzantısı, retraksiyon, baş veya omurga sayısı 6,11 normalize çıkıntılı motilite geçişin toplam sayısı olarak tanımlanır. Havuzları her türlü etkinlik ve genel motilite genel bir tahmindir; Bu yöntem, onların büyüklükleri dikkate almadan, olayların frekans ölçer. Çıkıntılı bir olay, yeni bir omurga baş veya dendritik mili, geçici çıkıntısı görünümü olarak tanımlanır. Bir geri çekme olayı bir omurga baş veya dendritik mili üzerinde bulunan mevcut veya geçici bir çıkıntı ortadan kaybolması olarak tanımlanır. Protrüzyon ve uzatma olayların toplamı dikenler sayısal dendrit, bölgede toplam sayısına göre ayrılır.
  6. Ilaç tedavisine yanıt bireysel omurga morfoloji değişiklikleri değerlendirmek için, tedaviden hemen önceki ve her zaman nokta şu, dendritik dikenler kesit alanı, ya da bir zaman noktasında -1 saat (1 saat önce perfüzyon) dendritik omurga lineer yoğunluk ölçümü tedavi. 1 saat önceki tedavi süresi noktası her zaman noktası Normale. Dendritik omurga morfolojisi veya doğrusal yoğunluk değişiklikleri nedeniyle fotohasar olmadığını belirlemek için, araç ile perfüze nöronlar analiz edin. Anlamına gelir farklılıklar Öğrenci eşleştirilmemiş t testi veya tek örnek t testi ile tespit edilebilir.

8. Alternatif yaklaşımlar ve başarının anahtarları

  1. Vadeye kadar SAYI 4 (DIV24 28), L-APV, NMDA reseptör inhibitörü, kültür varlığı D kortikal nöronların tanımlanmıştır. D varlığında kültür kortikal nöronlar ise, L-APV uzun vadeli kortikal nöronal kültürlerin varlığı, D iyi sağlığı korumak yararı vardır, L-APV sinaps gelişimini etkileyebileceğini dikkate alınmalıdır. Böyle bir alternatif, D, L-APV 2,5 yokluğunda kültür nöronlar . Kültür nöronlar D yokluğunda, L-APV ekstra dikkat aşırı Ca2 nedeniyle hücre ölümü bir artış şans + sitotoksisite NMDA reseptör aktivasyonu ile aşırı aktif olarak, genel sağlık kültürlerin ödenecek gerekir.
  2. Bu protokol açıklanan nöronal kültürlerin dendritik omurga morfoloji ve motilite dendriti, düzenleyen ilgili mekanizmaları incelemek için kullanılabilirc olgun bir morfoloji (yani pre-sinaptik ortakları ile bağlantıları formu ve net bir kafa gibi bir yapıya sahip) 2,4,5 gösteren dikenler. Alternatif olarak, daha önceki bir zaman noktası kültürlerin kullanımı, örneğin DIV11-16, gelişimin erken dönemlerinde dendritik omurga oluşumu veya dendritik dikenler düzenlenmesi ile ilgili soruları yanıtlamak için daha uygun olabilir.
  3. Konfokal mikroskopi kullanımına alternatif bir tedavi kültürlü kortikal nöronların görüntüler elde etmek için geniş bir alan epi-floresans kullanmaktır. Uygun deconvolution algoritmaları ile kombinasyon halinde, dikenler ayrıntılı morfometrik analiz sabit veya canlı hücrelerde olabilir. Ayrıca, ImageJ (gibi alternatif bir yazılım kullanmanız mümkün http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) veya Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns html ) dendritik omurga morfolojisi analizi için, özgür yazılım.
  4. Dendritik omurga motilite inceleyerek / zaman atlamalı görüntüleme kullanarak geçişin, kısa sürede hızlandırılmış aralıklarla kullanımı, örneğin 5-10 dakika, dendritik omurga turnover2, 5 çok daha detaylı bir analiz sağlayabilir dikkat edilmelidir. Daha kısa zaman aralıklarında da daha uzun zaman aralıkları kullanılarak tespit edilemez olacağını geçişin omurga daha hızlı tespit edebilir kullanın.
  5. Kültürlü kortikal nöronların dezavantajları ve kaygılarını dikkate alınması gereken bir dizi vardır. Öncelikle, kültürlü kortikal nöronların kullanarak bir endişe dendritik omurga yoğunluğu gibi parametrelerin etkisi kültürler arasında değişkenlik olabileceğini. Bunun gibi, aşağıdaki noktaları dikkatle değişkenlik az miktarda sağlamak için uyulması esastır. Birincisi, kültür parametreleri ve reaktifler iyi kültür uygulamalarına ek olarak, mümkün olduğunca tutarlı muhafaza edilmelidir, bu kültürler arasındaki değişkenlik düzeyi büyük ölçüde azaltacaktır. İkincisi, zaman noktası aynı zamanda yapılan tüm deneyler ve kardeş kültürleri üzerinde olması şarttır. Buna ek olarak (bkz. yukarıdaki noktası 2) deneyi ilgili soru sormak için izin deneyler yapılmaktadır zaman noktası dikkatle seçilmelidir. Son olarak, uygun kontroller tedavi koşulları her zaman bu iç kontrollere göre incelendiğinde, böylece tüm deneylerde kullanılan olduğu kritik öneme sahiptir. Bu kültürler arasında değişkenlik herhangi bir endişe kaldıracaktır.
  6. Kültürlü kortikal nöronların araştırmacılar, eleştirel dendritik omurga morfoloji ve motilite düzenlenmesi için gerekli mekanizmaları incelemek sağlayan güçlü bir araçtır. Ancak, bu kültürlerin in vivo durumun bir özetlemek değil yapmak olduğunu görebilmek önemlidir, ve kortikal tabaka organizasyon ve sinaps oluşumu glial hücreler, gibi diğer hücre türleri, etkisi gibi bileşenleri yukarıda açıklanan sistem ele olması değil. Bununla birlikte, böyle bir sistemin dendritik omurga morfoloji ve motilite düzenlenmesi altta yatan potansiyel olarak önemli mekanizmaları tanımlamak için kullanılır.

9 - Temsilcisi Sonuçlar

Yukarıda açıklanan testleri, farmakolojik tedavi ve / veya in vitro protein fonksiyonunun genetik manipülasyonlar yanıt dendritik omurga morfoloji, sayı ve motilite değişiklikleri araştırmak amacıyla tasarlanmıştır. Laboratuvarda, biz, böylece yapı 2,9 değiştirerek dendritik dikenler aktin hücre iskeletinin düzenleyen sinaptik proteinlerin rolü karakterize etmek için bu teknikler kullanmış olması. Ayrıca, bu nöromodülatör olarak nöroaktif bileşikleri, dendritik omurga morfoloji, sayı veya şekil değişiklikleri, tek başına 4,6,10 veya aktivite-bağımlı uyaranlara 5 varlığı nasıl sürücü belirlemek için bu testte kullanılan var.

1D veya 2D parametrelerin ölçümleri doğruluğunu tahmin etmek için, biz, çalışma boyunca nöronların aynı koşullarda monte bilinen boyutları floresan lateks mikroküreler (Duke Bilimsel) (0.2, 0.52, 1.0 mikron) çapları ve alanları ölçülür. Omurga ölçümleri (63X NA = 1.4 yağ daldırma amacı, EKK 5 Pascal) için de aynı görüntüleme koşulları kullanarak mikroküreler görüntülü ve sonra omurga ölçümleri ile benzer Metamorph kendi çap ve alanları belirlenir. Daha sonra mikrosferler bilinen boyutları ile gerçek ölçümler karşılaştırıldı.

Şekil 1 (Şekil 1) 'de grafik 0.52 mikroküreler alanları ve 1,0 mikron doğru ölçmek olduğunu göstermektedir (alanlar = 0.21 mm 2 ve 0.78 mikron sırasıyla 2) (ölçülen standart sapma ~% 15; standart sapma tespit üreticileri ~ % 9). Hatta 0,2 mikron mikroküreler ölçümleri oldukça büyük SD (ancak) gerçek boyutları yakın. Bu hesaplanan yanal resol ile tutarlı Bu özel amaç kullanarak konfokal mikroskop ution, 0.3 mikron (denklemi kullanarak Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Bu konfokal ve 2-foton mikroskoplar için kötü olduğu bilinmektedir eksenel çözünürlük, daha önemli ölçüde daha iyidir. Buna ek olarak, deneysel, çapı 200 nm yeşil floresan mikrosferleri (Duke Bilimsel) ~ 0,5 mikron olmak ölçerek lateral (x / y ekseni) noktası yayıldı fonksiyonu (PSF) belirlenmiştir. Bu tahmin, iğne deliği açık yapıldı ve böylece iğne deliği kapalı olduğunda, PSF aslında küçük olacaktır ki kabul edilebilir. Bununla birlikte, bu yine 0,196 mikron 2 (çapı = 0.5 mm) daha büyük alanları ölçmek için doğru olduğunu gösterir. Gerçek lateral PSF bir göstergesi verilir (Svoboda ve ark.) 13 "0.16 mikron 2 bir alanda yol açacağı çok daha az değil daha 0.4 mikron,". Bu karşılaştırmalar ve teorik konular ölçülen dikenler boyutları bu çözünürlük sınırı (> 0.25 mikron 2) daha büyük olduğu için biz doğru boyutu dikene benzer nesnelerin alanları ölçmek olduğunu göstermektedir. Bu koşullar, güvenilir omurga alanları ölçmek ve doğru omurga morfolojileri farklı tedavi koşulları karşılaştırmak olduğunu belirten, 13 "klasik morfometrik teknikleri nicel".

Dendritik omurga morfolojisi doğru bir şekilde ölçmek için, 2 gün boyunca bir EGFP inşa DIV 23 kortikal nöronların transfekte var. Transfeksiyon ardından, hücreler muameleye tabi olabilir ve ICC, GFP sinyal bile (ya da nöron) dendrit çapında dağıtımı için izin için geliştirilmiş sabit ve işlenir. Şekil 2 GFP ile transfekte bir kortikal nöron temsil eden bir görüntü gösterir, 63X objektif (NA 1.4) (Şekil 2A) konfokal mikroskop kullanarak görüntülü. Bu dendritik dikenler (Şekil 2B) detaylı, yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar. Dendritik dikenler detaylı morfometrik analizler Metamorph programı kullanarak laboratuvarda yapılmaktadır. Bu program bize dendritik omurga morfolojisi ölçmek için sadece izin verir, fakat aynı zamanda endojen proteinlerin yerelleştirme incelemek için. Şekil 2 (Şekil 2C-G) bu analizi yapmak nasıl bir bakış sağlanmaktadır.

Aktivite-bağımlı uyaranlara iyi karakterize bir etkisi dendritik omurga boyutu 2 bir artışa işaret ediyor . Şekil 3, 30 dakika önce ve sonra bir aktivite-bağımlı uyaran görüntülü bir DIV 24 kortikal nöron ifade EGFP bir dendritik omurga, temsilcisi time-lapse görüntüleme gösterir. Bu zaman atlamalı deney aktivite bağımlı uyaranlara (Şekil 3A, B) dendritik omurga boyutunu artırmak onaylar. Bazal omurga motilite incelemek için, görüntüleri zaman noktalarında 0, 50 ve 100 dakika satın alındı ​​ve omurga uzantıları, retraksiyonlar geçişin çıkıntılı motilite ve kafa ayrı ayrı ölçülür ve toplam motilite olarak birleştirilmiştir. Şekil 3C-D bazal koşullar altında bile, kortikal nöronların dendritik dikenler motilite bazı seviye göstergesi olduğunu doğrulamaktadır.

Şekil 1
Şekil 1. Karşılaştırma floresan mikrosferleri Hata çubukları, ölçülen ve gerçek alanlarda ölçülen alanların standart sapmasını temsil eder. Görüntüler mikroküreler 0.2 mikron, 0.52 mikron ve 1 mikron. Ölçek çubuğu = 5 mm.

Şekil 2
Şekil 2. Omurga morfolojisi ve IF Niceleme. SAYI 25 EGFP transfekte piramidal EGFP ifade kültürlü kortikal nöron, kortikal nöronların bulunan tipik dendritik omurga morfolojisi B. Yüksek büyütmelerde C. EGFP ve endojen protein (GluR1) bindirme D. Çöken Z-serisi A. Image hücre dendrit; mili ve dikenler arasında bölünme elle izlenir E. Farklı superthreshold bölgelerde sonra Metamorph tarafından özetlenen ve sayısal belirlenen F. El-takip omurga uzunluk, genişlik ve kesit alanı belirlemek için kullanılan nöron G. Bölgeler. Metamorph tarafından dikene H. Omurga özetliyor omurga-spesifik sinyal ölçmek için kırmızı kanallı görüntü (endojen protein) transfer edilecektir. IK Z-serisi projeksiyon görüntüleri, IF reseptör veya sinaptik protein küme ölçmek için. I. Dendritik mil arka plan EĞER (sarı kare) J. Bu görüntü eşiklenir bir "arka plan çıkarılır" görüntü oluşturmak için çıkarılır ve program otomatik olarak küme alan, doğrusal yoğunluğu ve toplam gri değeri (yoğunluğu IF) K. önlemler H. Ölçek bar, A = 15 mm eşiklenir görüntü, B = 1 mm.

g "alt =" Şekil 3 "/>
Şekil 3. Aktivite bağımlı değişiklikler, omurga morfolojisi ve bazal dendritik dikenler motilite. A. Zaman atlamalı görüntüleme aktivite bağımlı bir uyarının yanı sıra öncesi ve sonrası bir temsilcisi dendritik omurga . Aktivite bağımlı uyaranlara Mg2 + ve APV olmadan ACSF Mg2 + ve APV içeren ASCF deneysel medya anahtarlama, ancak -30 dakikalık bir zaman noktasında (30 normalize dendritik omurga alan 10 mikron glisin B. Niceleme (boyut) içeren tarafından indüklenen perfüzyon öncesi dakika). dendritik omurga motilite 0, 50 ve 100 dakika zaman noktalarında C. Temsilcisi görüntüler. Aşağıdaki resimlere ayrı ayrı her bir zaman noktasında ise 0 (kırmızı) kaplaması, 50 (yeşil) ve 100 dakikalık zaman noktaları (mavi), En İyi İmajlar gösterir. Asterisk omurga uzantısı gösterir beyaz ok omurga retraksiyon gösterir; yeşil ok başının çıkıntılı motilite gösterir; açık sarı bir ok başı omurganın baş geçişin gösterir D. dendritik omurga motilite parametreleri sayısal ve toplam motilite EGFP aşağıdaki görüntüleme ifade E. kortikal nöronların 20X görüntü. hücre sağlığını belirlemek için oturum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu teknikler, neuropathologies için katkıda bulunabilir post-sinaptik mekanizmalarının etkilerini anlamak üzerine odaklı dendritik omurga morfolojisi, sabit veya canlı birincil kortikal nöronların lineer yoğunluk ve motilite ayrıntılı kantitatif analiz için yukarıda anlatılan. Benzer bir yaklaşım, hipokampal piramidal, Purkinje, ya da orta dikenli bir nöronlar da dahil olmak üzere herhangi bir dikenli bir nöron omurga morfolojisi ve motilitesi, ölçmek için kullanılabilir.

Burada açıklanan protokol sinaptik proteinlerin ve / veya dendritik dikenler farmakolojik tedavilerin etkileri temel özelliklerini bakmak için adapte edilebilir. Ayrıca, glutamat reseptörleri iskele proteinler arasında değişen endojen sinaptik proteinlerin lokalizasyon değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, sinaptik proteinlerin ya da farmakolojik tedavi dendritik omurga hareketliliği üzerindeki etkilerinin ölçülmesi de sabit dikenler ayrıntılı morfometrik analiz sağlar, ancak. Bu zaman atlamalı görüntüleme teknikleri ile veya aynı anda dendritik omurga morfolojisi inceleyerek olmadan, aynı zamanda proteinlerin ticareti incelemek için modifiye edilebilir.

Dendritik omurga morfoloji ve motilite detaylı analizi mutant sinaptik proteinlerin potansiyel etkilerini araştırmak için önemli bir araçtır ve bu hastalıkla ilişkili sinaptik proteinlerin nasıl mutasyonlar sinaps yapısı ve fonksiyonu etkileyebilir, böylece bir dizi bozuklukları patofizyolojisinde katkıda beyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu çalışmanın Üretim MetaMorph (Moleküler Devices, Inc.) Tarafından desteklenmiştir.

Acknowledgments

Kelly Jones Biz dikkatli bir düzenleme için teşekkür ederim. Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (DPS);; Bu çalışma NIH hibe R01MH 071.316, Alzheimer Derneği, Şizofreni ve Depresyon (NARSAD) Araştırma Ulusal İttifak, ve Otizm Araştırma Ulusal İttifak (naar) (PP) tarafından desteklenen edildi Amerikan Kalp Derneği predoctoral Bursu (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).

Tags

Nörobilim Sayı 53 eksitatör sinaps nörolojik bilimler beyin korteksi kortikal nöronlar primer kültür konfokal mikroskobi zaman atlamalı görüntüleme yeniden yapılanma.
Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M.,… More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter