Summary
تقنية يوضح تشريح استئصاله من الجسم الزجاجي والشبكية ، وعدسة العين من الماوس ، والفصل عن طريق الطرد المركزي ، وتوصيف المقايسات مع البروتين.
Abstract
في حين برز الماوس الشبكية كنموذج وراثي لمرض الشبكية الهامة الموروثة ، والزجاجي الماوس لا يزال يتعين استكشافها. والزجاجي هو مصفوفة مائي كبير خارج الخلية التي تغمر فيها العين الشبكية وكذلك البروتينات خارج المقلة تتراكم أثناء المرض. التفاعلات بين الشاذ 1-3 الزجاجي والشبكية تكمن وراء العديد من الأمراض مثل انفصال الشبكية ، اعتلال الشبكية السكري التكاثري ، التهاب القزحية ، وvitreoretinopathy التكاثري. 1 (4) ، والماوس الزجاجي النسبية حجم أصغر بكثير من الزجاجي الإنسان (الشكل 1) ، منذ ما يقرب من عدسة الماوس تحتل 75 ٪ من العين في 5 وهذا جعل من الدراسات البيوكيميائية الزجاجي الماوس الصعبة. في هذه المقالة الفيديو ، نقدم تقنية لتشريح وعزل الماوس الزجاجي من شبكية العين ، مما سيتيح استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا بشكل أكثر وضوحا لتحديد دور هذه المصفوفة خارج الخلية في تطور أمراض الشبكية.
Protocol
1. الجزء الأمامي للتشريح.
- واستوعب الأنسجة الصلبة الخلفي لحوف مع forcep 0،22 والعالم (كرة العين) واستقرت.
- ويستخدم شفرة المجهرية لإجراء شق طولي في القرنية من حوف الى حوف.
- ثم يتم استخدام A 0.12 COLIBRI forcep لفهم في شق القرنية.
- ثم يتم امتصاص السائل الغرفة الأمامية مع الرمح ويك - سيل الجراحية.
2. عدسة نزع الأحشاء.
- ويستخدم 0.12 COLIBRI forcep استيعاب القرنية لتحقيق الاستقرار في العالم.
- يتم إدخال الإبرة غرامة صاحب المنحني (أو منحنية ملقط خلع الملابس) وراء العدسة باتجاه الجانب الخلفي من الكرة الأرضية. مغلق جزئيا حامل الإبرة ، وانسحبت إلى الأمام. يتم تطبيق الضغط باستخدام ملقط على السطح الخارجي للالصلبة ، والذي يدفع إلى الأمام من خلال عدسة شق القرنية بينما يترك جدار العين سليمة. ويظهر على شكل زجاجي شفاف والجل هو ملتصق جزئيا إلى العدسة.
- ثم يتم وضع عدسة النسيج الزجاجي الطرد المركزي في أنبوب تصفية تحتوي على 20 microliters من الكوكتيل مثبط البروتياز (روش) الذائب في برنامج تلفزيوني.
3. نزع الأحشاء الشبكية.
- الاستمرار في تحقيق الاستقرار في العالم مع 0،12 ملقط COLIBRI استيعاب شق القرنية.
- يتم وضع غرامة حامل إبرة مقوسة (منحنية أو ملقط خلع الملابس) والخلفي بكثير من العالم ممكن ، بالقرب من العصب البصري. مغلق جزئيا حامل الإبرة ، وانسحبت إلى الأمام. يتم تطبيق الضغط باستخدام ملقط على السطح الخارجي للالصلبة ، والتي يدفع الشبكية إلى الأمام من خلال شق القرنية. ويظهر على شكل زجاجي شفاف هلام ملتصق على شبكية العين. شبكية العين هي بمثابة تصور الأنسجة الصفراء أوعية دموية. يمكن مقشر أي شرائط من النسيج المصطبغة بعيدا بالملقط.
- ثم يتم وضع نسيج الشبكية ، في الأنبوب الزجاجي الطرد المركزي تصفيته الأنسجة التي تحتوي على عدسة الزجاجي.
4. تصفية الطرد المركزي.
- يتم وضع أنبوب الطرد المركزي التي تمت تصفيتها في جهاز للطرد المركزي الفوق. تدور G 14000 س لمدة 12 دقيقة.
- نضح في eluant من مجلس النواب ، والذي هو الزجاجي. شبكية العين يبقى في الغرفة العليا. ويمكن استخدام هذه العينات لدراسات البروتين.
5. ممثل النتائج
وقد تم تحليل عينات الزجاجي بواسطة SDS - PAGE (الشكل 2). كما استخدمت عينات لفحص النشاط الأنزيمي (الشكل 3).
الشكل 1. ماوس مخطط العين. مستعرضة التخطيطي للعين البشرية والفأر يظهر حجم أصغر نسبيا الزجاجي في العين بسبب العدسة الماوس الأكبر.
الشكل 2. أحد الأبعاد SDS - PAGE من الماوس الزجاجي والشبكية. ملامح من البروتين الزجاجي الماوس ، 13.6 ملغ / مل (حارة 1) ، وشبكية العين ، 11.35 ملغ / مل (حارة 2). تم تنفيذ الكهربائي للهلام في 150 كيلو فولت لمدة 45 دقيقة ، وصمة عار ملطخة فلامنغو هلام الفلورسنت وتصور باستخدام نظام التصوير VersaDoc (BioRad ، هرقل ، كاليفورنيا).
الشكل 3. نشاط انزيم ديسموتاز الفائق (الاحمق) في الماوس والزجاجي الإنسان. وقد أجريت قياس النشاط SOD الإجمالي (SOD النشاط اللونية aasay عدة ، # AB65354 ، Abcam ، المؤتمر الوطني العراقي ، كامبريدج ، MA) في الجسم الزجاجي والشبكية التي جمعتها سلب من الفئران البيضاء وديسيبل. وتمت مقارنة هذا النشاط في الهيئة العامة للسدود الإنسان الأساسية الزجاجي والشبكية البشرية التي جمعت من تشريح العين البشرية المانحة لتحديد نشاط نسبي. وقد يستنشق يدويا مخفف عينات الزجاجي باستخدام إبرة عيار 23 و 11 و تم جمعها من قبل شبكية العين المزهرة العين وقطع النسيج بعيدا عن التعقيد RPE / المشيمية. على الرغم من أن الفحص لا يميز بين الأشكال الإسوية الهيئة العامة للسدود ، ونشاط الهيئة العامة للسدود الزجاجي ومن المرجح أن تعكس SOD3 ، لأنه هو الوحيد خارج الخلية شكل الإسوي 12 SOD شبكية العين والنشاط من المرجح أن تعكس جميع الأشكال الإسوية الهيئة العامة للسدود الثلاثة : SOD1 داخل الخلايا ، SOD2 الميتوكوندريا ، وخارج الخلية SOD3 12 للحصول على المقايسات الأنزيمية حساسة للغاية ، بما في ذلك هذا الاختبار الهيئة العامة للسدود ، وإمكانية التلوث المتبادل من البروتينات غير ممكن ، ويتطلب مزيدا من الدراسة. أشرطة الخطأ تمثل SEM.
Discussion
الفئران المعدلة وراثيا تشكل نموذجا هاما للتحقيق في مرض شبكية العين والشبكية. 60-10 الجسم الزجاجي الماوس ، ولكن ، وتضم نسبة أصغر بكثير من العين بالمقارنة مع الزجاجي الإنسان نظرا لعدسة العين الكبيرة في الماوس. وهذا يجعل من 5 من الصعب عزل وتنقية الجسم الزجاجي الماوس. وفهم التغيرات المرتبطة بروتين الجسم الزجاجي خلال أمراض مثل اعتلال الشبكية السكري التكاثري ، المرتبطة بالعمر الضمور البقعي ، التهاب القزحية ، وانفصال الشبكية تعطي نظرة ثاقبة الآليات التي من خلالها التقدم. تصور هذا البروتوكول التجريبي يوفر وسيلة للحصول على وتنقية الجسم الزجاجي الماوس ، مع تعظيم العائد لتحليل البروتين الأنزيمي والبروتين.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للرابطة للبحوث والرؤية في بيان العيون لاستخدام الحيوانات في البحوث البصريات والرؤية.
Acknowledgments
وقدم التمويل من جانب النضال من أجل البصر والبحوث للوقاية من العمى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &, Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &, Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
