Summary
La technique de dissection illustre l'éviscération du vitré, la rétine et le cristallin de l'oeil de la souris, une séparation par centrifugation, et la caractérisation des dosages de protéines.
Abstract
Alors que la rétine de souris a émergé comme un modèle important génétique pour la maladie rétinienne héréditaire, le vitré de la souris reste à explorer. Le vitré est une matrice extracellulaire fortement aqueux recouvrant la rétine où intraoculaire ainsi que des protéines extra s'accumuler pendant la maladie. 1-3 interactions anormales entre vitré et la rétine sous-tendent plusieurs maladies telles que le décollement de la rétine, rétinopathie diabétique proliférative, l'uvéite et vitréorétinopathie proliférante 1. , 4 Le volume relatif du vitré de la souris est nettement plus petit que le corps vitré de l'homme (figure 1), puisque l'objectif de souris occupe près de 75% de ses yeux. 5 Cela a fait des études biochimiques du corps vitré de souris défi. Dans cet article, vidéo, nous présentons une technique de disséquer et d'isoler le corps vitré de la rétine de souris, ce qui permettra l'utilisation de modèles de souris transgéniques pour définir plus clairement le rôle de cette matrice extracellulaire dans le développement de maladies vitréo-rétinienne.
Protocol
1. Une dissection du segment antérieur.
- Tissus scléral en arrière du limbe est saisi avec une pince de 0,22 et le globe (globe oculaire) est stabilisé.
- Une lame de microchirurgie est utilisé pour faire une incision linéaire dans la cornée de limbe à limbe.
- A 0,12 Colibri pince est ensuite utilisé pour saisir la cornée à l'incision.
- Le fluide de la chambre antérieure est alors absorbée par une lance Weck-Cel chirurgicale.
2. L'éviscération Lens.
- Une pince 0,12 Colibri saisissant la cornée est utilisé pour stabiliser le monde.
- Un porte-aiguille fine courbe (ou courbes pinces à pansement) est inséré derrière la lentille vers la face postérieure de la planète. Le porte-aiguille est partiellement fermée, et tiré vers l'avant. La pression est appliquée à l'aide de la pince sur la surface externe de la sclérotique, qui pousse la lentille vers l'avant dans l'incision cornéenne, tout en laissant le mur oeil intact. Le vitré apparaît comme un gel translucide et est partiellement adhérente à la lentille.
- Le tissu lentille vitreuse est ensuite placé dans un tube de centrifugation filtrée contenant 20 microlitres de cocktail inhibiteur de protéase (Roche) dissous dans du PBS.
3. L'éviscération rétine.
- Continuer à stabiliser le globe avec une pince Colibri 0,12 saisir l'incision cornéenne.
- Un porte-aiguille fine courbe (ou courbes pinces à pansement) est placé aussi loin postérieure à la planète que possible, à proximité du nerf optique. Le porte-aiguille est partiellement fermée, et tiré vers l'avant. La pression est appliquée à l'aide de la pince sur la surface externe de la sclérotique, qui pousse vers l'avant de la rétine à travers l'incision cornéenne. Le vitré apparaît comme un gel translucide adhérente à la rétine. La rétine est visualisé comme une jaune, tissu vascularisé. Tout bandes de tissu pigmentées peuvent être décollées avec une pince.
- Le tissu rétine vitreuse est ensuite placé dans le tube à centrifuger filtrée contenant le tissu lentille vitreuse.
4. Filtrée par centrifugation.
- Le tube de centrifugeuse filtré est placé dans une centrifugeuse de paillasse. Centrifuger à 14000 g pendant 12 minutes.
- Aspirer l'éluant de la chambre inférieure, qui est le corps vitré. La rétine reste dans la chambre supérieure. Ces échantillons peuvent être utilisées pour les études des protéines.
5. Les résultats représentatifs
Échantillons vitrifiée été analysées par SDS-PAGE (figure 2). Des échantillons ont également été utilisés pour un test d'activité enzymatique (figure 3).
Figure 1. Diagramme de l'œil de la souris. Transversale schématique de l'œil humain et de la souris indique le volume vitré relativement petite dans l'oeil de la souris en raison de sa grande lentille.
Figure 2. Unidimensionnelle SDS-PAGE de la souris vitrée et la rétine. Profils protéiques du corps vitré de la souris, 13,6 mg / ml (voie 1), et de la rétine, 11,35 mg / mL (piste 2). L'électrophorèse sur gel a été réalisée à 150 kV pendant 45 minutes, colorées avec du gel Flamingo tache fluorescente et visualisées à l'aide d'un système d'imagerie VersaDoc (BioRad, Hercules, CA).
Figure 3. Enzyme superoxyde dismutase activité (SOD) chez la souris et du vitré humain. Mesure de l'activité SOD totale (SOD activité colorimétrique aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) a été réalisée sur vitré et la rétine recueillies par l'éviscération des souris DBA et albinos. Ceci a été comparé à l'activité de la SOD dans le noyau du vitré humain et rétine humaine recueillies post-mortem yeux donneur humain pour déterminer l'activité relative. Non dilué des échantillons de carottes ont été manuellement vitreuse aspiration avec une aiguille de calibre 23, 11 et de la rétine ont été recueillies par la floraison, les yeux et couper le tissu loin du complexe RPE / choroïde. Bien que l'essai ne fait pas de distinction entre les isoformes de SOD, l'activité SOD vitré est susceptible de refléter SOD3, puisque c'est la seule isoforme extracellulaire 12 L'activité de la SOD rétine est susceptible de refléter toutes les isoformes de SOD trois:. Intracellulaires SOD1, mitochondriale SOD2 et extracellulaire SOD3. 12 Pour très sensible dosages enzymatiques, y compris ce test SOD, la possibilité de contamination croisée des protéines est possible et nécessite une étude plus approfondie. Les barres d'erreur représentent SEM.
Discussion
Les souris transgéniques sont un modèle important pour étudier les maladies de la rétine et vitréo-rétinienne. 6-10 Le corps vitré de la souris, cependant, comporte une proportion significativement plus faible de l'œil en comparaison avec le corps vitré humaine en raison de la grande lentille dans l'oeil de la souris. Cela fait 5 il est difficile d'isoler et de purifier le corps vitré de la souris. Comprendre les changements associés à la protéine du vitré au cours des maladies telles que la rétinopathie diabétique proliférative, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, l'uvéite et décollement de la rétine va donner un aperçu des mécanismes par lesquels ils progressent. Ce protocole expérimental visualisés fournit un moyen d'obtenir et de purifier le corps vitré de la souris, tout en maximisant le rendement de protéines pour les analyses enzymatiques et protéomiques.
Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec l'Association pour la Recherche et de la Vision dans la déclaration d'ophtalmologie pour l'utilisation d'animaux à la recherche ophtalmique et Vision.
Acknowledgments
Le financement a été fourni par Fight for Sight et de la recherche pour prévenir la cécité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
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