Summary
La técnica de disección ilustra la evisceración del vítreo, la retina y el cristalino del ojo del ratón, la separación por centrifugación, y la caracterización de los ensayos de proteínas.
Abstract
Mientras que la retina del ratón se ha convertido en un importante modelo genético para enfermedades hereditarias de retina, el vítreo del ratón que queda por explorar. El humor vítreo es una matriz extracelular muy acuosa que recubre la retina donde intraocular, así como las proteínas se acumulan durante la enfermedad extraocular. 1.3 interacciones anormales entre vítreo y la retina la base de varias enfermedades, tales como desprendimiento de retina, retinopatía diabética proliferativa, uveítis, y la vitreorretinopatía proliferativa. 1 , 4 El volumen relativo vítreo del ratón es significativamente menor que el vítreo humano (Figura 1), ya que la lente del ratón ocupa casi el 75% de su ojo. 5 Esto ha hecho que los estudios bioquímicos de vítreo ratón desafiante. En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para analizar y aislar el vítreo de la retina del ratón, lo que permitirá el uso de modelos de ratones transgénicos para definir más claramente el papel de esta matriz extracelular en el desarrollo de enfermedades vítreo-retiniana.
Protocol
1. La disección del segmento anterior.
- Tejido escleral por detrás del limbo se toma con una pinza 0,22 y el globo (globo ocular) se estabiliza.
- Una hoja de microcirugía se utiliza para hacer una incisión lineal en la córnea de limbo a limbo.
- Un 0,12 Colibri pinza se utiliza para captar la córnea en la incisión.
- El líquido de la cámara anterior es absorbido con una lanza Weck-Cel quirúrgica.
2. Lente de la evisceración.
- Un 0,12 Colibri pinza agarrando la córnea se utiliza para estabilizar el mundo.
- El titular de una fina aguja curva (curva o fórceps vestir) se inserta detrás de la lente hacia la parte posterior del globo. El titular de la aguja está parcialmente cerrada, y tiró hacia adelante. La presión se aplica con las pinzas en la superficie externa de la esclerótica, que empuja la lente hacia adelante a través de la incisión en la córnea, dejando intacta la pared del ojo. El humor vítreo se presenta como un gel translúcido y está parcialmente adherida a la lente.
- El tejido del cristalino, humor vítreo se coloca en un tubo de centrifugación filtrado contiene 20 microlitros de cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche) disuelto en PBS.
3. Retina evisceración.
- Seguir para estabilizar el mundo, con 0,12 fórceps Colibri captar la incisión en la córnea.
- El titular de una fina aguja curva (curva o fórceps vestir) se coloca en lo posterior para el mundo como sea posible, cerca del nervio óptico. El titular de la aguja está parcialmente cerrada, y tiró hacia adelante. La presión se aplica con las pinzas en la superficie externa de la esclerótica, que empuja la retina hacia delante a través de la incisión en la córnea. El humor vítreo se presenta como un gel transparente adheridas a la retina. La retina es visualizado como un pañuelo amarillo, vascularizado. Las tiras de tejido pigmentado puede ser desprendido con pinzas.
- El tejido de la retina-vítreo se coloca en el tubo de centrífuga de filtrado que contiene el tejido de lente vítreo.
4. Filtrada centrifugación.
- El tubo de centrífuga de filtrado se coloca en una centrífuga de mesa. Giran a 14.000 x G durante 12 minutos.
- Aspirar el eluyente de la cámara baja, que es el humor vítreo. La retina permanece en la cámara alta. Estas muestras pueden ser utilizados para los estudios de las proteínas.
5. Resultados representante
Muestras de humor vítreo fueron analizadas por SDS-PAGE (Figura 2). Las muestras también fueron utilizados para un ensayo de actividad enzimática (Figura 3).
Figura 1. Diagrama del ojo del ratón. La sección transversal esquemática del ojo humano y el ratón se muestra la relación de menor volumen vítreo en el ojo del ratón gracias a su lente más grande.
Figura 2. Unidimensional SDS-PAGE del vítreo y la retina del ratón. Los perfiles de proteínas de vítreo del ratón, el 13,6 mg / mL (carril 1), y la retina, 11,35 mg / mL (carril 2). Electroforesis en gel se realizó en 150 kV durante 45 minutos, se tiñeron con tinción de Flamingo gel fluorescente y se visualizan mediante un sistema de VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA).
Figura 3. Superóxido dismutasa (SOD) de la actividad enzimática en el ratón y el humor vítreo humano. Medición de la actividad total de SOD (SOD actividad colorimétrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc., Cambridge, MA) se llevó a cabo en el vítreo y la retina recogidos por la evisceración de los ratones DBA y albino. Esto se comparó con la actividad de SOD en el núcleo humano vítreo y la retina humana proveniente de post-mortem ojos de donantes humanos para determinar la actividad relativa. Sin diluir las muestras de núcleo vítreo aspirado manualmente usando una aguja de calibre 23, 11 y en la retina fue recogido por la floración a los ojos y cortar el tejido del complejo EPR / coroides. Aunque la prueba no distingue entre las isoformas de SOD, la actividad de la SOD vítreo es probable que refleje SOD3, ya que es la isoforma extracelular sólo 12 La actividad de la SOD retina es probable que refleje todas las isoformas de SOD tres:. Intracelular SOD1, SOD2 mitocondrial y extracelular SOD3. 12 Para los ensayos enzimáticos de alta sensibilidad, la inclusión de este ensayo de SOD, la posibilidad de contaminación cruzada de las proteínas es posible y requiere más estudio. Las barras de error representan el SEM.
Discussion
Los ratones transgénicos son un importante modelo para la investigación de enfermedades de la retina y vítreo-retiniana. 10.6 El cuerpo vítreo del ratón, sin embargo, cuenta con una proporción significativamente menor de los ojos, en comparación con el humor vítreo humanos debido a la gran lente en el ojo del ratón. 5 Esto hace que es difícil aislar y purificar el cuerpo vítreo del ratón. Comprender los cambios asociados a la proteína del vítreo en enfermedades como la retinopatía diabética proliferativa, relacionada con la edad degeneración macular, uveítis, desprendimiento de retina y le dará información sobre los mecanismos por los cuales el progreso. Este protocolo experimental visualizar proporciona un medio para obtener y purificar el cuerpo vítreo del ratón, al tiempo que maximiza el rendimiento de proteína para los análisis enzimáticos y proteómicos.
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación y Visión en la declaración de Oftalmología para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research.
Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por la lucha por la vista y de investigación para prevenir la ceguera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
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