Summary
Den dissektion Tekniken illustrerar urtagning av glaskroppen, näthinnan och linsen från musen ögat, separation genom centrifugering, och karakterisering av protein-analyser.
Abstract
Medan musen näthinnan har vuxit fram som en viktig genetisk modell för ärftlig näthinnesjukdom förblir musen glaskroppen på att utforskas. Glaskroppen är en mycket vatten extracellulärmatrix överliggande näthinnan där intraokulära samt extraocular proteiner ackumuleras under sjukdomen. 1-3 Onormala interaktioner mellan glaskroppen och näthinnan ligger till grund för flera sjukdomar såsom näthinneavlossning, proliferativ diabetisk retinopati, uveit och proliferativa vitreoretinopathy. 1 , 4 Den relativa musen glaskroppen volym är betydligt mindre än den mänskliga glaskroppen (figur 1), eftersom musen linsen upptar nästan 75% av sitt öga. 5 Detta har gjort biokemiska studier av mus glaskroppen utmanande. I denna video artikeln presenterar vi en teknik för att dissekera och isolera musen glaskroppen från näthinnan, vilket kommer att tillåta användning av transgena musmodeller för att tydligare definiera vilken roll denna extracellulära matrix i utvecklingen av vitreoretinala sjukdomar.
Protocol
1. Främre segmentet dissekering.
- Skleral vävnad posteriort om limbus är fattade med 0,22 forcep och världen (ögat bollen) har stabiliserats.
- En mikrokirurgisk blad används för att göra en linjär snitt i hornhinnan från limbus till limbus.
- En 0,12 Colibri forcep används sedan för att ta tag i hornhinnan på snittet.
- Den främre kammaren vätskan tas sedan upp med en Weck-Cel kirurgiska spjut.
2. Lens urtagning.
- En 0,12 Colibri forcep greppa hornhinnan används för att stabilisera världen.
- En fin böjd nål (eller böjda dressing pincett) förs in bakom linsen mot den bakre delen av världen. Nålen hållaren är delvis stängd, och dras framåt. Trycket appliceras med hjälp av pincetten på utsidan av sklera, som driver objektivet framåt i hornhinnan snittet medan ögat vägg intakt. Glaskroppen visas som en genomskinlig gel och är delvis anhängare till linsen.
- Linsen-glaskroppen vävnad placeras sedan i en filtrerad centrifugering rör som innehåller 20 mikroliter av proteashämmare cocktail (Roche) upplöst i PBS.
3. Retina urtagning.
- Fortsätt att stabilisera världen med 0,12 Colibri pincett greppa hornhinnan snittet.
- En fin böjd nål (eller böjda dressing pincett) är placerad så långt posteriort om världen som möjligt, nära synnerven. Nålen hållaren är delvis stängd, och dras framåt. Trycket appliceras med hjälp av pincetten på utsidan av sklera, som tänjer på näthinnan framåt i hornhinnan snittet. Glaskroppen visas som en genomskinlig gel anhängare till näthinnan. Näthinnan är visualiseras som en gul, vaskulariserad vävnad. Varje band av pigmenterad vävnad kan skäras bort med pincett.
- Näthinnan, glaskroppen vävnad placeras sedan i den filtrerade centrifugrör som innehåller linsen, glaskroppen vävnad.
4. Filtrerad centrifugering.
- Den filtrerade centrifugrör är placerad i en bänk centrifug. Snurra på 14.000 x G i 12 minuter.
- Aspirera eluant från den nedre kammaren, som är glaskroppen. Näthinnan finns kvar i den övre kammaren. Dessa prover kan användas för protein studier.
5. Representativa resultat
Glaskropp prover analyserades av SDS-PAGE (figur 2). Prover har också använts för en enzymatisk aktivitet analys (Figur 3).
Figur 1. Mouse öga diagram. Tvärsnittsarea schematisk av det mänskliga och mus ögat visar den relativa mindre glaskroppen volym i musen ögat på grund av dess större lins.
Figur 2. Endimensionell SDS-PAGE av mus glaskroppen och näthinnan. Protein profiler musen glaskroppen, 13,6 mg / ml (bana 1) och näthinnan, 11,35 mg / ml (bana 2). Gelelektrofores utfördes på 150 kV i 45 minuter, färgade med Flamingo fluorescerande gel fläcken och visualiseras med hjälp av en VersaDoc Imaging-system (BioRad, Hercules, CA).
Figur 3. Superoxiddismutas (SOD) enzymaktiviteten hos mus och människa glaskroppen. Mätning av den totala SOD aktivitet (SOD aktivitet kolorimetriska aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) utfördes på glaskroppen och näthinnan som samlas in av urtagning från DBA och albino möss. Detta jämfördes med SOD aktiviteten i human glaskroppen kärna och mänskliga näthinnan som samlas in från obduktioner mänskliga givare ögon för att bestämma relativ aktivitet. Outspädd glaskropp borrkärnor var manuellt sugs med hjälp av en 23-gauge kanyl, 11 och näthinnan samlades in av blommande ögat och skära av vävnad från RPE / koroidea komplex. Även om analysen inte skiljer på SOD isoformer är glaskroppen SOD verksamhet som skulle kunna spegla SOD3, eftersom det är den enda extracellulära isoformen 12 Näthinnan SOD aktiviteten sannolikt spegla alla tre SOD isoformer:. Intracellulär SOD1, mitokondrie SOD2 och extracellulära SOD3. 12 För mycket känslig enzymatiska analyser, inklusive denna SOD analys, är möjligheten att korskontaminering av proteiner och kräver ytterligare studier. Felstaplar representerar SEM.
Discussion
Transgena möss är en viktig modell för att undersöka näthinnan och vitreoretinala sjukdom. 6-10 Musen glaskroppen kroppen, men utgör en betydligt mindre andel av ögat i jämförelse med den mänskliga glaskroppen grund av den stora linsen i musen ögat. 5 Det gör det svårt att isolera och rena musen glaskroppen. Förstå protein förändringar i samband med glaskroppen vid sjukdomar som proliferativ diabetesretinopati, åldersrelaterad makuladegeneration, uveit och näthinneavlossning kommer att ge insikt i de mekanismer genom vilka de framsteg. Detta visualiseras försöksprotokoll ger en möjlighet att få och rena kroppen musen glaskroppen, samtidigt maximera protein avkastningen för enzymatiska och proteomik analyser.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med Föreningen för forskning och Vision i oftalmologi uttalande för användning av djur i ögondroppar och Vision Research.
Acknowledgments
Finansieringen kom från Fight for Sight och forskning för att förebygga blindhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &, Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &, Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
