Summary
Diseksiyon tekniği vitreus, retina ve lens gelen fare göz, santrifüj yoluyla ayrılması ve protein deneyleri ile karakterizasyonu eviserasyon göstermektedir.
Abstract
Fare retina kalıtsal retina hastalıkları için önemli bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır, fare vitreus keşfedilmeyi beklemektedir. Vitreus hastalık sırasında göz içi yanı sıra ekstraoküler proteinler birikir retina üzerinde oldukça sulu bir ekstrasellüler matriks vitreus ve retina arasında 1-3 Anormal etkileşimleri, retina dekolmanı, proliferatif diyabetik retinopati, üveit ve proliferatif vitreoretinopati gibi çeşitli hastalıkların altında yatan 1 4 bağıl fare vitreus hacmi, fare objektif gözü yaklaşık% 75 işgal insan vitreus (Şekil 1) göre anlamlı derecede küçük. 5. Bu zorlu fare vitreus biyokimyasal çalışmalar yaptı. Bu video makalede, retina, transgenik fare modelleri bu ekstraselüler matriks vitreoretinal hastalıkların gelişiminde rolü daha net bir şekilde tanımlamak için izin fare vitreus incelemek ve izole etmek için bir teknik mevcut.
Protocol
1. Ön segment diseksiyonu.
- Limbus posterior skleral doku 0.22 forsepsle ve dünya (göz topu) stabilize ile kavradı.
- Mikrocerrahi bıçak limbustan limbus kornea doğrusal bir kesi yapmak için kullanılır.
- A 0.12 Colibri forsepsle sonra kornea kesi kavramak için kullanılır.
- Ön kamara sıvısı sonra Weck-Cel cerrahi mızrak ile emilir.
2. Lens eviserasyon.
- Kornea açgözlü bir 0.12 Colibri forsepsle dünya stabilize etmek için kullanılır.
- Dünyanın arka yönüyle doğru objektif arkasında ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps) eklenir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç göz duvarında olduğu gibi bırakarak korneal kesiden lens ileri iter sklera, dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus saydam bir jel gibi görünür ve objektif kısmen yapışık.
- Lens vitreus dokusu daha sonra PBS içinde çözünmüş proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) 20 mikrolitre içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpü içine yerleştirilir.
3. Retina eviserasyon.
- Korneal kesi açgözlü 0.12 Colibri forseps ile dünya stabilize etmek için devam edin.
- Ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps), optik sinir yakınında, mümkün olduğu kadar dünya arka yerleştirilir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç, sklera, retina korneal kesiden ileri iter dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus retina yapışık yarı saydam bir jel gibi görünür. Retinada sarı, damarlı bir doku olarak görünür. Herhangi bir pigmentli doku şeritler forseps ile soyulmuş olabilir.
- Retina-vitreus dokusu daha sonra lens vitreus dokusu içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpüne yerleştirilir.
4. Santrifüj Filtreli.
- Benchtop santrifüj süzülmüş santrifüj tüp yerleştirilir. 12 dakika 14.000 x G Spin.
- Vitreus alt odası, eluant aspire. Retinanın üst odasında kalır. Bu örnekler, protein çalışmaları için kullanılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Vitreus örnekleri, SDS-PAGE (Şekil 2) ile analiz edildi. Örnekleri de bir enzimatik aktivite assay (Şekil 3) için kullanılır.
Şekil 1. Fare göz diyagramı. Insan ve fare göz kesit şematik büyük lens nedeniyle fare göz göreceli küçük vitreus hacmi gösterir.
Şekil 2. Bir boyutlu SDS-PAGE fare vitreus ve retina. Protein fare vitreus profilleri, 13.6 mg / ml (şerit 1), ve retina, 11.35 mg / ml (2 şeritli). Jel elektroforezi Flamingo floresan jel boyası ile boyanmış, 45 dakika için 150 kV ve VersaDoc Görüntüleme sistemi (BioRad, Hercules, CA) kullanılarak görüntülendi.
Şekil 3. Fare ve insan vitreus Süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitesi. Toplam SOD aktivitesi ölçümü (SOD aktivitesi kolorimetrik aasay kiti, # AB65354 Abcam, Inc, Cambridge, MA), DBA ve albino fareler eviserasyon tarafından toplanan vitreus ve retina üzerinde yapıldı. Bu insan vitreus çekirdek ve göreceli etkinliğini belirlemek için post-mortem insan donör gözleri toplanan insan retina SOD aktivitesi ile karşılaştırıldı. Sulandırılmamış vitreus karot numuneleri elle, 23 gauge iğne, 11 ve retina göz çiçekli ve RPE / koroid kompleksi uzak doku kesim tarafından toplanan ile aspire edildi . Tahlil SOD izoformları arasında ayrım yapmaz rağmen sadece ekstraselüler izoformu olduğundan, vitreus SOD aktivitesi, SOD3 yansıtmak için büyük olasılıkla 12 retinanın SOD aktivitesi üç SOD izoformları yansıtması muhtemeldir. Intrasellüler SOD1, mitokondriyal SOD2 ve ekstrasellüler SOD3. (12), bu SOD tahlil da dahil olmak üzere son derece hassas enzimatik Testler için, proteinlerin çapraz bulaşma olasılığı mümkündür ve daha fazla çalışma gerektirir. Hata çubukları SEM temsil eder.
Discussion
Transgenik farelerde retinal ve vitreoretinal hastalığın araştırılması için önemli bir model. 6-10 fare vitreus, ancak, büyük fare göz lens nedeniyle insan vitreus ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az oranda göz oluşmaktadır. 5 Bu yapar zor fare vitreus izole etmek ve arındırmak için. Onlardır ki, ilerleme, proliferatif diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, üveit, retina dekolmanı ve gibi hastalıklar sırasında vitreus ile ilişkili protein değişiklikleri anlamak mekanizmalarına fikir verecektir. Bu görüntülenmiştir deney protokolünde, enzimatik ve proteomik analizleri için protein verimi en üst düzeye çıkarırken, fare vitreus elde etmek ve arındırmak için bir araç sağlar.
Disclosures
Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanları Kullanım için Oftalmoloji açıklamada Araştırma ve Vizyon Derneği uyarınca hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Finansman Görüş ve Körlük Önlemek için Araştırma için mücadele sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &, Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &, Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
