Summary
Deze hele mount
Abstract
Whole mount in situ hybridisatie is een zeer informatieve benadering voor het definiëren van genexpressie patronen in embryo's. De in situ hybridisatie procedures lang zijn en technisch veeleisend met meerdere belangrijke stappen die gezamenlijk bijdragen aan de kwaliteit van het eindresultaat. Dit protocol beschrijft in detail een aantal belangrijke kwaliteitscontrole stappen voor het optimaliseren van sonde etikettering en prestaties algemeen., Ons protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de kritische stappen die nodig zijn om reproduceerbaar te verkrijgen resultaten van hoge kwaliteit. Eerst beschrijven we de generatie van digoxigenine (DIG) gemerkte RNA probes via in vitro transcriptie van DNA templates gegenereerd door PCR. We beschrijven drie kritische kwaliteitscontrole assays om de hoeveelheid, integriteit en specifieke activiteit van het DIG gemerkte probes bepalen. Deze stappen zijn belangrijk voor het genereren van een probe voldoende gevoeligheid voor endogene mRNA te detecteren in een geheel muizenembryo.Daarnaast beschrijven we methoden voor de fixatie en opslag van E8.5-E11.5 dagen oude muizenembryo's in situ hybridisatie. Vervolgens beschrijven we Methoden voor beperkte proteinase K digestie van het gerehydrateerde embryo gevolgd door de gegevens van de hybridisatieomstandigheden, post-hybridisatie wassingen en RNase behandeling van niet-specifieke probe hybridisatie verwijderen. Een AP-geconjugeerd antilichaam wordt gebruikt om de gelabelde probe visualiseren en het expressiepatroon van de endogene transcript onthullen. Representatieve resultaten worden getoond van succesvolle experimenten en typische suboptimale experimenten.
Protocol
1. Riboprobe generatie via in vitro transcriptie
- Voorbereiding PCR producten in vitro transcriptie templates.
- Designing PCR primers met faag transcriptie promoter sequenties in hun 5 uiteinden.
Opmerking: De promotersequentie toegevoegd aan 5'-uiteinde van de sense-streng PCR primer wordt gebruikt voor het transcriberen van de sense probe en de promotersequentie toegevoegd aan 5'-uiteinde van de antisense PCR primer wordt gebruikt voor het synthetiseren van de anti-sense probe 1-3. We hebben geen enkel verschil waargenomen in transcriptie efficiëntie tussen templates die alleen de kern promoter sequenties vs templates die de kern promoter plus additionele 5 'sequenties bevatten bevatten. Deze methode is gebruikt met de T3, T7 en SP6 faag promoters.
Sequenties die sterk geconserveerd onder genfamilie leden of mate repetitieve sequenties worden vermeden omdat zij leiden tot niet-specifieke hybridisatie en thereby verhoging achtergrondkleuring. Probes met een hoog GC-gehalte zal hebben beperkte digoxigenine-rUTP oprichting en DNA-template sequenties met runs van T residuen zal de integratie van graven-UTP als gevolg van sterische interferentie tussen de digoxigenine moleculen te beperken. De sonde lengte kan variëren van 300bp tot 1kb. Maar zolang de bovenstaande criteria is voldaan, gewoonlijk langere probes hogere specifieke activiteiten. - De template voor de PCR kan een plasmide kloon genomische kloon of genomisch DNA. Typisch kopen wij volledige lengte EST klonen (bijv. van ATCC of Open Biosystems) te gebruiken als PCR-templates. Amplificeren template DNA met de standaard PCR procedures een PCR-product met de promoter sequenties produceren. Om genoeg sonde sjablonen om meerdere sonde synthese reacties die we doorgaans ingesteld 8 x 50 pl PCR's te ondersteunen. De reacties worden samengevoegd voor de volgende stap. In het algemeen enkele grote volume PCRs of meer kleine reacties (zoals 50 pl reacties we) aopnieuw voldoende om genoeg template enkele probe synthesereacties genereren.
- Om verontreinigende eiwitten te verwijderen, vooral sporen van RNase in plasmidepreparaten, verteren elk 100 ui PCR reactie met 1 pi van 20mg/ml proteïnase K bij 55 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Alle reagentia en andere voorwerpen die na deze Proteinase K digestie moet RNase vrij en die specifiek voor RNA werk.
- Tijdens de Proteinase K digestie uitvoeren van een monster van de PCR reactie op een gel om de integriteit van het PCR product controleren. We maken gebruik van acrylamide mini gels voor kleinere PCR-producten (minder dan 600 tot 700 bp) en agarose gels besluiten tot grotere PCR producten (> 600 tot 700 bp) voor kwaliteitscontrole analyse op te lossen. Als er meerdere banden op de gel, raden optimaliseren van de PCR reactie, totdat je een PCR product van de juiste grootte.
- Grondig uitpakken Proteinase K gedigereerd PCR reactie met een gelijk volume fenol / chloroform (1:1) mixture, gevolgd door een extractie met een gelijk volume chloroform. Meng bij elke stap door vortexen de buis ten minste 30 seconden. Deze stappen moeten worden uitgevoerd in een chemische dampkap.
- Precipiteren de gezuiverde PCR product door 0,1 volume 3 M natriumacetaat en 2 volumes 100% ethanol. In reactie -20 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
- Draai gedurende 5 minuten bij 13.000 rpm in een microcentrifuge, verwijder supernatant en wassen met 70% ethanol. Laat de DNA-pellet volledig drogen.
- Resuspendeer DNA in een geschikte volume (bv. 50 pl) van 1xTE. Meet de DNA concentratie met een fluorometer.
- Bepaal de nucleotide sequentie van de template elke PCR prep gebruik van primers die overeenkomen met de faag promoter sequenties en een interne sequentie in de probe. Dit is een kritieke kwaliteitscontrole stap die ervoor zorgt dat de probe template is van de correcte sequentie.
- Het DNA is bereid als een matrijs dienen voor in vitro transcription. Sla de template DNA bij 4 ° C.
- Designing PCR primers met faag transcriptie promoter sequenties in hun 5 uiteinden.
- in vitro transcriptie met het PCR product als een matrijs.
- Stel de transcriptiereactie een RNA in een eindvolume van 50 pl. De transcriptiereactie omvat 500 - 1000 ng template DNA, 5 pl 10X Transcription Buffer (met 100 mM DTT), 10 ul 2,5 mM dig-NTP mix, 3μl (50 ~ 90 eenheden) RNA polymerase, 1 pi Alpha-32 P CTP (up tot 6 maanden oud) en de rest van het volume wordt door toevoeging diethylpyrocarbonaat behandeld water. De 2.5mm dig-NTP mix bestaat gewoonlijk uit een 40μl werkvoorraad met 10 ul 10 mM CTP, 10 ui 10 mM GTP, 10 ui 10 mM ATP, 10 mM UTP 6.5μl, 3.5μl 10 mM digoxigenine-11 UTP. Het monteren van de transcriptiereactie, of alle van de reactiecomponenten (behalve het enzym) worden opgewarmd tot kamertemperatuur. Eerste mix het DNA en het water, voeg dan de reactiebuffer, meng en voeg vervolgens de andere componentenanders spermidine in de transcriptie buffer precipiteren DNA. Incubeer 2 uur bij de aanbevolen temperatuur voor de gebruikte RNA polymerase.
Opmerking: de α-32P toegevoegd aan het reactiemengsel, zodat u om het aandeel van het uitgangsmateriaal nucleotide pool die is ingebouwd in de RNA probe bepalen. Dit is een belangrijke maat voor de efficiëntie van de reactie. Alle van de volgende stappen te volgen procedures voor de behandeling 32 blz.
Een alternatieve methode voor het meten van de hoeveelheid gesynthetiseerd RNA probe is het gebruik van een klein volume spectrofotometer. Dit vermijdt het gebruik van 32 P etikettering (zie toelichting in stap 1.3.1) - Tijdens de laatste paar minuten van incubatie, de voorbereiding van de Quick Spin Column (Roche) volgens de instructies van de fabrikant.
- Na incubatie voeg 1 pi van RNase vrij DNase I en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Verdun tot 100 pl met 50 ul reactie Dilution buffer (20 mM TrispH 7,5, 1% SDS, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl (RNase vrij, maak een 50ml voorraad en bewaar bij kamertemperatuur)). 1 pi nemen (meestal in 4μl van 1x TE) voor scintillatietelling van het totale uitgangsmateriaal telt en gelanalyse.
- Breng de rest van de reactie op het midden van de kolom bed en centrifugeren op 1100 x g gedurende 4 minuten in een klinische centrifuge tafelblad. Nadat de spin een RNA probe in de verzamelbuis.
- Voeg 2 volumes 100% ethanol in de geëlueerde reactie. Meng grondig en bewaar op ijs gedurende 5 minuten (of -20 ° C of 30 min).
- Draai de buis in een microcentrifuge bij maximale rpm gedurende 5 minuten om de pellet RNA probe.
- Volledig verwijderen van de supernatant met een pipet en laat de pellet drogen. Laat niet de pellet te droog, want het zal heel moeilijk zijn om het op te lossen.
- Los de RNA probe met 50 ul - 100 ul 1xTE of DEPC-H 2 O. Neem een 1 pi monster bepalen van het percentage inbouw en voor analyse denatijdens acrylamide gel. Pas probe concentratie 100 ng / ul volgens de geschatte opbrengst.
- Probes die verstreken drie kwaliteitscontroles kunnen vervolgens worden opgeslagen in -20 ° C gedurende 6 tot 12 maanden. We meestal uitlaat de sonde voorraad binnen 12 maanden. Het is zeer waarschijnlijk dat probes kunnen worden bewaard zeer langdurig bij-20C.
- Stel de transcriptiereactie een RNA in een eindvolume van 50 pl. De transcriptiereactie omvat 500 - 1000 ng template DNA, 5 pl 10X Transcription Buffer (met 100 mM DTT), 10 ul 2,5 mM dig-NTP mix, 3μl (50 ~ 90 eenheden) RNA polymerase, 1 pi Alpha-32 P CTP (up tot 6 maanden oud) en de rest van het volume wordt door toevoeging diethylpyrocarbonaat behandeld water. De 2.5mm dig-NTP mix bestaat gewoonlijk uit een 40μl werkvoorraad met 10 ul 10 mM CTP, 10 ui 10 mM GTP, 10 ui 10 mM ATP, 10 mM UTP 6.5μl, 3.5μl 10 mM digoxigenine-11 UTP. Het monteren van de transcriptiereactie, of alle van de reactiecomponenten (behalve het enzym) worden opgewarmd tot kamertemperatuur. Eerste mix het DNA en het water, voeg dan de reactiebuffer, meng en voeg vervolgens de andere componentenanders spermidine in de transcriptie buffer precipiteren DNA. Incubeer 2 uur bij de aanbevolen temperatuur voor de gebruikte RNA polymerase.
- Kwaliteitsbeoordeling van de riboprobe - meetsonde opbrengst.
- Om de sonde opbrengst te schatten, verdelen de graven hersteld na de spin kolom door de tellingen in de reactie voor de spin kolom (gemeten met de monsters die in de sonde synthese-protocol). Voor deze reactie, 100% opname = 33 ug. Een succesvolle reactie geeft meestal 15-50% opbrengst. Probes met minder dan 15% opname (<5 ug opbrengst) mogen niet worden gebruikt.
Opmerking: Een alternatieve methode voor het meten probe opbrengst is om een kleine volume spectrofotometer of fluorometerrechtstreeks meten van de hoeveelheid RNA aanwezig na centrifugeren kolomchromatografie. Deze alternatieve benadering wordt het gebruik van 32P labeling trace. We hebben gemeten riboprobe concentratie met behulp van een BioTek Epoch Microplate spectrofotometer. Een vergelijking van de waarden verkregen uit de spectrofotometer de ramingen van riboprobe massa van het 32P incorporatie bleek dat beide methoden vergelijkbare resultaten met een dergelijke kleine volume (2 pi) monster van het uiteindelijke preparaat probe geven.
Bijna altijd een zeer geringe of geen rendement door RNase verontreiniging afkomstig van het plasmide preparaat gebruikt als matrijs voor de PCR. Zorg om plasmide-DNA en PCR product behandelen met proteinase K zoals beschreven in stap 1.1.3.
- Om de sonde opbrengst te schatten, verdelen de graven hersteld na de spin kolom door de tellingen in de reactie voor de spin kolom (gemeten met de monsters die in de sonde synthese-protocol). Voor deze reactie, 100% opname = 33 ug. Een succesvolle reactie geeft meestal 15-50% opbrengst. Probes met minder dan 15% opname (<5 ug opbrengst) mogen niet worden gebruikt.
- Kwaliteitsbeoordeling van de riboprobe - het meten van specifieke activiteit.
- In de mate van digoxigenine meten - UTP oprichting uitvoeren van een spot test. Dit is een crufinanciële kwaliteitscontrole.
Stel de probe concentratie 100 ng / ul. Spot 1 pl seriële verdunningen (10 -2 tot 10 -5) van de sonde op een 82 mm diameter van Hybond-N + (GE Healthcare) of andere gelijkwaardige nylon filter. Voeg een ongelabelde DNA als een negatieve controle. Crosslink de vochtige filter direct in een UV-crosslinker bij 125mJoules of volgens de instructies van de fabrikant voor de nylon filter die u gebruikt.
Alle volgende stappen (1.4.2 - 1.4.6) wordt uitgevoerd in een petrischaal op een schommelende platform bij kamertemperatuur. Je hoeft niet te maken over RNase maken na het spotten van de sonde verdunningen op het filter - Blokkeren filter gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in 10 ml 1% blokkerend reagens (Roche) in 1X TN (10X buffer TN = 1 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl)
- Wash 1 X 15 min in 10 ml 1X TN-buffer.
- Incuberen met anti digoxigenine Fab fragment op 1/5000 verdunning in 1X TN buffer gedurende 30 minuten. </ Li>
- Was 2 X 15 min in 10 ml 1X TN buffer.
- De kleur reactie wordt uitgevoerd met BM paarse ondergrond (moet ongeveer 5 ml in de schotel). Kleur moet zichtbaar zijn op de plek van de 10 -4 verdunning in 30 minuten. Op dat moment stopt de kleurreactie door wassen 2 keer gedurende 5 minuten met 5X TE. Als het signaal niet zichtbaar in de spot die overeenkomt met de 10 -4 verdunning wordt de probe moet worden weggegooid.
Opmerking: In onze ervaring, onvoldoende specifieke activiteit is alleen te vinden met korte sondes. Vergroting van de probe template (tot 1kb) met inachtneming van het andere ontwerpcriteria in dit protocol is bedoeld om de specifieke activiteit van de probe. Met geringe specifieke activiteit leidt tot lage of niet-detecteerbare niveaus van het signaal.
- In de mate van digoxigenine meten - UTP oprichting uitvoeren van een spot test. Dit is een crufinanciële kwaliteitscontrole.
- Test de integriteit van de probe door middel van elektroforese door een 5% denaturerende acrylamidegel.
Dit is een belangrijke kwaliteitscontrole assay.Dit protocol wordt aangenomen dat de probe is gemerkt met 32P bij de synthesereactie (zie stap 1.2.1). We maken gebruik van denaturerende acrylamide gels tot zeer hoge resolutie te bieden, waardoor we gemakkelijk te detecteren afgebroken of onvolledig sondes. Typisch een 5% denaturerende minigel (acrylamide 7,5 g ureum, 1,9 ml 40% acrylamide, 1,9 ml 2% bis-acrylamide (of een 20:1 acrylamide: bis-acrylamide oplossingen), 1,5 ml 10X MOPS gel buffer (0,2 M morpholinopropanesulfonic zuur, pH7.0, 50 mM natriumacetaat 5 mM EDTA) en H2O tot een eindvolume van 15 ml) werkt zeer goed voor het oplossen probes in de grootte varieert in dit protocol.
Opmerking: Als alternatief, TBE-ureum prefab gels kunnen worden gekocht bij verschillende leveranciers. Volg de instructies van de fabrikant voor het uitvoeren van prefab gels.- Meng het monster met een gelijk volume van Gel Loading Buffer (Ambion) en meng goed.
- Verwarm tot 95 ° C gedurende 5 minuten om een secundaire structuur te denatureren.
- Immediately afkoelen op ijs voordat u op de gel opnieuw gloeien te voorkomen.
- Voer de voor en na de kolom monsters samen bij 200 tot blauwe kleurstof loopt tot het einde van de gel. De gel wordt uitgevoerd in 1X MOPS gel buffer.
- Wikkel de gel in plasticfolie en bloot aan X-ray film of fosforbeeldvormer scherm om radioactief gemerkt RNA te detecteren. Als 32P labeling niet gebruikt u vlekken op de gel met een conventionele fluorescerende kleurstof aan de RNA detecteren
- Een succesvolle probe synthese resulteert in een RNA probes die migreert als een sterke band vlakbij de bovenkant van de gel.
2. Verzamelen en opslaan van muis embryo
- Muizenembryo's worden verzameld in ijskoude PBST (PBS + 0,1% Tween 20, (diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld)) en op ijs gehouden tijdens de dissectie.
- De embryo's worden verwerkt in 4 ml schroef bedekte glazen flesjes. Meerdere embryo's worden gefixeerd in een injectieflacon. Maar liefst 10 tot 15 E9.5of 5 E10.5 embryo's kunnen worden vastgesteld in een flacon. Als gevolg van de toenemende omvang van het embryo, moet E11.5 embryo's worden hemisected met een scheermesje voorafgaand aan de fixatie om te helpen bij sonde toegang tijdens de hybridisatie. Tot 3 hemisected E11.5 embryo's kunnen worden geplaatst in een flesje.
- Om de effectiviteit van de stappen in dit protocol maximaliseren en om beschadiging van de embryo's embryo fixatie en alle wassingen uitgevoerd in monsterflesjes met oplossingen gevuld tot het lagere niveau van de flacon hals verminderen zodat slechts een kleine luchtbel blijft, tenzij gespecificeerd. Voor alle wasstappen flacons zijn vastgesteld op hun kant op een tuimelschakelaar platform.
- Oplossing voor 6 uur tot overnacht bij 4 ° C op een schommelende tafel met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBST. Flacons moeten horizontaal worden geplaatst en wiegde op een tuimelschakelaar platform bij 4 ° C.
- Na fixatie worden embryo tweemaal gedurende 5 minuten elk in PBST op ijs en vervolgens gedehydrateerd door een stapsgewijze methanol / PBST series (25% methanol in PBST, 50% methanol in PBST en 75% methanol in PBST) in 100% methanol door vervanging oplossingen in de flacon met glazen Pasteur pipetten. Embryo's kunnen worden opgeslagen bij-20C in 100% methanol gedurende 8 maanden en misschien langer.
3. Hybridisatie van de digoxigenine gelabelde probe geheel mouse embryo
- Prik harten en hoofden van E10.5 en ouder embryo's met een microdissectie mes, terwijl de embryo's zijn nog steeds in methanol (als dit niet werd gedaan tijdens de dissectie). Deze eenvoudige stap kan de wasoplossingen om in de hersenen blaasjes en de hartkamers en daarbij flinke vermindering achtergrondkleuring.
- Hydrateren de embryo door opeenvolgende wasbeurten in een methanol / PBST series (75% methanol in PBST, 50% methanol in PBST en 25% methanol in PBST) gedurende 5-10 minuten bij elke concentratie methanol. Was tweemaal gedurende 5 minuten elk wassen in PBST 100%.
- Incubeer in 4:1 PBST: 30% H 2 O 21 uur op ijs. Daarna wassen met telkens 3 veranderingen 5 min in 1X PBST.
- Verwijder de laatste PBST gewassen en vervangen door 1 ml 10 ug / ml proteinase K in PBST. Tijdens de proteinase K digestie plaats de buizen verticaal in een rek in een 25 ° C waterbad.
Opmerking: Oplossingen van proteinase K activiteiten na verloop van tijd als gevolg van zelf-vergisting. Om maximale en constante activiteit zorgen voor de proteinase K oplossing moet worden vers gemaakt onmiddellijk voor elk gebruik. Voor elk gebruik een kleine hoeveelheid van een 1mg/ml stock vervolgens verdund. De incubatietijd moet worden bepaald voor elke partij proteinase K poeder en voor elk embryo leeftijd. Bijvoorbeeld voor E9.5 embryo goed is gewoonlijk 10-15 min bij 25 ° C terwijl E10.5 is meestal 20-30 min bij 25 ° C. De proteinase K incubatietijd moet ook nauwkeurig worden gemeten tijdens experimenten mogelijk te maken zinvolle vergelijkingen tussen de flesjes en tussen experimenten. De temperatuur moet zorgvuldig worden gehandhaafd tijdens het verteringsproces te verhogenreproduceerbaarheid. Verschillen zo klein als 1 ° C kan veranderen de hoeveelheid vertering tussen experimenten. Het wordt sterk aanbevolen dat de proteinase K vertering worden gedaan in een broedstoof of een waterbad voor nauwkeurige temperatuurregeling. Deze stap is essentieel voor het toestaan van de probe aan het weefsel waardoor het programma sterk signaal dringen. Echter over-digestie beschadigen embryo's en ze geleidelijk desintegreren in de loop van de resterende stappen. - Stop de Proteinase K digestie door tweemaal wassen gedurende 5 minuten elk wassen bij kamertemperatuur met vers 2 mg / ml glycine in PBST. Vervolgens tweemaal gewassen gedurende 5 minuten in PBST.
- Bevestig de embryo gedigereerd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA / PBST, 0,2% gluteraldehyde (Polysciences). Niet over-of underfix. Was 3 maal gedurende 5 minuten elk in PBST.
- Op dit punt moet embryo worden onderverdeeld in groepen voor hybridisatie. Verwijder de PBST. Voeg 1 ml hybridisatiebuffer (50% ultrapure formamide (Invitrogen), 5x SSC, pH 5, 1% SDS, 50 ug / ml heparine (Acros), 50 ug / ml Torula RNA (Sigma)) die is verwarmd tot 65 ° C (zonder sonde). Laat embryo's om zich te vestigen, en verwijder vervolgens al het hybrization buffer en te vervangen door 1 ml verse warme hybridisatiebuffer zonder sonde.
- Prehybridize gedurende 1 uur bij 65 ° C in een schuddend waterbad of in een oven op een schommelende platform (bijvoorbeeld Boekle Shake 'n' Bake Oven, zie tabel 1). Als u incubeer de injectieflacons in een waterbad er zeker van zijn water komt tot aan, maar niet over, de toppen van de injectieflacons. De hybridisatietemperatuur kan worden verhoogd tot 70 ° C. Hybridisatie temperaturen boven 65 ° C hebben signaalintensiteit of achtergrond geen afbreuk meeste probes we hebben getest. De embryo's worden doorzichtig, plakkerig, en breekbaar in formamide buffers (bijvoorbeeld hybridisatie buffer) wees voorzichtig wanneer u ze hanteert.
- Vervang de prehybridisatiebuffer met 0,4 ml hybridisatiebuffer met een probeconcentratie van 0,25-1 ug / ml. Gebruik 0,5 ug / ml probe voor embryo tot ongeveer E8.5. Voor oudere embryo's moeten probes worden getitreerd 1 tot 0,1 pg / ml om de optimale concentratie voor een goede signaal met lage achtergrond (meestal 0.25-0.5 ug / ml of zo) te bepalen. Merk op dat grotere hybridisatie volumes nodig zijn voor de grotere embryo. Hybridiseren gedurende de nacht bij 65 ° C.
- Als de embryo's zijn dan behandeld met proteinase K. ze zullen verschijnen uiterst transparant. Zij kunnen ook vasthouden aan de zijkanten van de houder of uiteenvallen. Embryo's die op deze manier worden weergegeven moet worden weggegooid op dit punt in het protocol. Verwerking ze verder niet zal resulteren in interpreteerbare gegevens.
- Vervang de hybridisatiebuffer met verwarmde oplossing I (50% formamide, 5x SSC pH 5, 1% SDS) bij 70 ° C. Was twee keer gedurende 30 minuten elke wasbeurt voor E8.5 embryo's, drie keer 30 minuten per wasbeurt voor E9.5 en ouder.
- Was eenmaal met voorverwarmde 50% Oplossing I: 50% Solution II (0,5M NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7,5, 0,1% Tween 20) bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- Was driemaal gedurende 5 minuten per wassing met Solution II bij kamertemperatuur.
- Vervangen buffer met Oplossing II met RNase A 100 ug / ml, RNase T1 100 eenheden / ml. Incubeer op een rocker in de warme kamer bij 37 ° C tweemaal 30 minuten per wasbeurt. RNase Het was essentieel voor het verminderen achtergrond aspecifiek resultaat van probes gehybridiseerd.
- Wassen in Oplossing III (50% formamide, 2x SSC pH5) bij 65 ° C tweemaal telkens 30 minuten was voor E8.5, 3 keer 30 minuten per was voor E9.5 en ouder.
- Was 3 maal gedurende 5 minuten per wassing met 1X TBST (100 ml 10X TBS bevat 8g NaCl, 0,2 g KCl, 12,5 ml 2M Tris HCl pH 7,6 in water. Om 1X TBST de 10X TBS verdund in een geschikt volume water en voeg Tween 20 tot 0,1% eindconcentratie)
- Tenzij worden alle wassingen uitgevoerd in de proefbuisjes met oplossingen gevuld tot het lagere niveau van deinjectieflacon hals. Voor alle wasstappen, zijn flesjes vastgelegd op hun kant op een rocker-platform.
4. Antilichaamdetectie de digoxigenine gelabelde probe
- Embryo's zijn vooraf geblokkeerd in 0,5 ml 1X TBST + 10% warmte behandeld schapen serum. Vervolgens verticaal rots de vaatjes bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) gedurende ten minste 2,5 uur.
- Vervang de blokkerende oplossing met vers 1X TBST + 10% serum met een 1:2000 - 1:5000 verdunning van alkalische fosfatase geconjugeerd schaap anti-digoxigenine Fab fragmenten (afgetrokken door incubatie met embryo acetonpoeder, zie hieronder). Gebruik hogere verdunningen voor E9.5 en oudere embryo tot 1:5000 aan achtergrond minimaliseren. Incubeer verticaal op wip bij 4 ° C gedurende de nacht.
Opmerking: we hebben gevonden dat incubatie van de anti-digoxigenine Fab fragmenten met een embryo acetonpoeder achtergrond niveaus kleuring in dit protocol vermindert. Ter voorbereiding van de embryo aceton poeder te homogeniseren gepoolde E12.5-14.5 muis embryos in een minimaal volume van PBS. Voeg 4 volumes ijskoude aceton en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Verwijder supernatant door centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Was de pellet met ijskoude aceton en spin opnieuw. Verspreid de pellet uit en vermalen tot poeder op een vel filtreerpapier en laat het aan de lucht drogen. Het poeder kan vervolgens worden opgeslagen in een luchtdichte buis bij 4 ° C jaren.
Voor het antilichaam aftrekken, moet het antilichaam vooraf geadsorbeerd aan het embryo acetonpoeder niet-specifieke binding te verminderen tijdens of vóór pre-blokkering. Incubeer antilichaam bij 1/100 met een kleine hoeveelheid embryo poeder (de hoeveelheid is niet kritisch) in 1xTBST/10% serum gedurende ten minste 1 uur bij 4 ° C met schudden. Verwijderen poeder door spinnen in een microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Afgetrokken antilichaam kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden. - Was driemaal telkens 5 minuten met 1X TBST en vervolgens 5-6 keer gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur overmaat antilichaam te verwijderen. Als pgenoemd, doen een uitgebreide 's nachts was bij 4 ° C om de achtergrond te verminderen. De overnacht wash kan drastisch verminderen achtergrondniveaus waardoor de signaal-ruisverhouding.
- Was tweemaal 20 minuten per wasbeurt met verse alkalische fosfatase buffer (100 mM Tris, pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20. Toevoegen 0.5mg/ml levamisole, een endogene AP-inhibitor voor E9.5 en ouder embryo's).
- Vervang de laatste wassing met BM Purple AP substraat (Roche) voorverwarmd tot kamertemperatuur.
- Laat de kleurreactie te incuberen bij kamertemperatuur en periodiek letten signaal via een ontleedmicroscoop. Voor uitgebreide kleurreacties (enkele uren 's nachts) de flacons moeten worden afgeschermd van licht. Signaal voor overvloedige mRNA zichtbaar moeten zijn binnen 15 minuten. Reacties dienen te worden gestopt wanneer u tevreden bent met het signaal, of als de achtergrond begint een probleem te zijn. Als de oplossing zelf begint te draaien donker is kun je uitbreiden van de color reactie door vervanging van de substraatoplossing.
- Stop reactie door tweemaal wassen 5 minuten per wasbeurt in 1X PBST/5mM EDTA.
- Overdracht naar 4% paraformaldehyde / PBST opnieuw oplossen van enkele uren tot een nacht. Of embryo's kunnen worden opgeslagen in 4% paraformaldehyde/1X PBST jaren of kan direct worden verwerkt voor het snijden. Deze laatste fixatie stap is cruciaal voor het langdurig bewaren van de kleuringspatroon.
5. Paraffine inbedding en snijden van gebrandschilderd embryo's
- Voordat de embryo's worden vastgesteld na de kleurreactie (stap 4.8) foto's van de hele berg glas embryo's worden genomen wanneer de kleuring niveau is op de gewenste intensiteit. Na het vastleggen van de expressiepatronen in het gehele embryo ze geïncubeerd in de BM paarse substraat nacht tot 24 uur bij kamertemperatuur totdat het gehele embryo wordt donkerblauw. Deze stap is dat de kleuring zal voldoende donker wordt weergegeven in the weefselcoupes. Let op de blauwe kleur van het embryo wordt veroorzaakt door de afzetting van een dunne laag van pigment over de embryo oppervlak. Dit achtergrondkleuring niet detecteerbaar in het weefsel van belang na snijden.
- Was de gekleurde embryo's met PBS driemaal het teveel substraat neerslaat en overnacht vast in 4% PFA bij 4 ° C.
- Wassen met PBS driemaal, en daarna drogen de embryo's in 100% methanol (zoals beschreven in 2.4).
- Vervang de laatste methanol met xyleen. Wassen in xyleen 2 tot 3 keer gedurende 2 minuten elk wassen tot de embryo duidelijk. Niet meer wassen in xyleen omdat zal het weefsel zeer bros nadat het is ingesloten, waardoor het zeer moeilijk intact secties herstellen. Visueel controleren elke xyleen incubatie om er zeker van embryo's alleen maar om het punt dat duidelijk en heel voorzichtig zijn om niet toe dat de xyleen incubatie uit te breiden voorbij dit punt.
- Transfer embryo (E10.5 en ouder) In Biopsie Sure-Tek cassettes (Fisherbrand) en incubeer de hele cassette in was (Fisherbrand) gedurende 15 ~ 30 min bij 65 ° C. Wijzig in de frisse was voor nog eens 15 ~ 30min en dan weer te veranderen. Kleinere embryo's / weefsel trunks vereisen kortere wax incubatietijd. E9.5 embryo's kunnen worden geplaatst in het weefsel vormen voor inbedding wax veranderingen. In die gevallen kunt u verwijderen de was uit de mal in plaats van de overdracht van de embryo's.
- Na drie wax veranderingen, overdracht embryo's in het weefsel inbedding mallen (Polysciences) en insluiten met verse wax. Plaats zorgvuldig de embryo's voor de gewenste vlak van snijden. Laat de wax afkoelen tot stollen.
- Sectie de wax blokken in 8 ~ 14μm plakjes met behulp van standaard microtoom (bijv. Leica RM2155). Verzamel secties op objectglaasjes (Fisherbrand).
- Laat de dia's plat en droog op een slidewarmer. De objectglaasjes kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maanden.
- Gedroogde delen zijn ontwast door twee 5 min xylene wast en gerehydrateerd naar water door seriële methanol / water wassen (100% methanol 2 min, 100% methanol 2 min, 90% methanol / water 2min, 70% methanol / water 2min, gedeïoniseerd water 5 min).
- Vlekken op de secties met nucleaire snel rood (Sigma) kleuroplossing gedurende 1 minuut. De nucleaire kleuring snelle oplossing genereren verdun een geconcentreerde voorraad nucleair snel rood (0,1% kernechtrood rood in 5% aluminiumsulfaat in water, opgelost met warmte en filtreer door Whatman filtreerpapier) 1:5 in een waterige oplossing van 5 % aluminiumsulfaat. Na het kleuren was de dia's met stromend water tot het water helder is. De nucleaire snelle rode fungeert als een tegenkleuring en onthult de totale weefsel structuur in de secties. De kleur contrasteert goed met de paars-blauwe kleuring dat de lokalisatie van de RNA-probe markeert. Kernechtrood rood is een verzadigende kleurstof en de kleurintensiteit wordt geregeld door de concentratie van de kleuroplossing. Als de intensiteit van de kleuring kernechtroodonvoldoende is wanneer u deze kleuroplossing kunt u deze stap met een meer geconcentreerde nucleaire snelle rode oplossing te herhalen.
- Bereid de slides voor montage dekglaasjes door wassen in elk van de oplossingen in de volgende reeks: 90% methanol / water, gevolgd door 2 wassingen in 100% methanol gevolgd door 2 wassingen in xylenen. Incubeer de schuif 2 minuten in alle wassingen.
- Monteer de dia's met Cytoseal 60 montage medium (Richard-Allan Scientific). Houd er rekening mee dat waterige montage media ontbinding van de nucleaire snelle rode vlek.
Let op: we hebben ook gebruik gemaakt van een plastic inbedding hars (Immuno-Bed, Polysciences Inc) om delen van gebrandschilderd embryo's te genereren met uitstekende resultaten 4.
6. Representatieve resultaten:
Figuur 1 illustreert representatieve resultaten verkregen met dit protocol. Figuur 1A toont de expressie patroon van Gata3 in E10.5 muis embryo's. Dit paneel geeft een goed resultaat met een hoge signaal-achtergrond verhouding. Figuur 1C daarentegen toont een mislukte in situ hybridisatie voor Gata3 mRNA dat een gedeeltelijk afgebroken RNA probe gebruikt. Een lage specifieke activiteit probe resulteert in vergelijkbare resultaten met laag contrast achtergrond signaal. Een vergelijking van panelen A en C het belang illustreert van het uitvoeren van zorgvuldige kwaliteitscontrole van de sonde kwaliteit om resultaten van hoge kwaliteit te garanderen. Het verkregen resultaat met de Foxg1 probe (Figuur 1B) toont ook een goed resultaat specifieke kleuring in het telencephalon met lage achtergrond in andere delen van de hersenen. De hersenen en het hart zijn voorkomende locaties kleuring van de ondergrond veroorzaakt door sonde vangen. Aanprikken van de hersenen en het hart met een pincet kunnen wassen oplossingen in het embryo en minimaliseert achtergrondkleuring (zie stap 3.1). Figuur 1D illustreert de typische lichtblauwe achtergrond gevonden wanneer de hersenen wordt niet doorboord. Dit toont een optimaal resultaat verkregen met een probe Pax1. Pax1 niet uitgedrukt in een deel van de hersenen en alle kleuring waargenomen in de hersenen van deze embryo is door niet-specifieke achtergrond.
Figuur 1. Representatieve resultaten van voorbeelden van succesvolle (A, B) en suboptimale (C, D) resultaten. A. E10.5 embryo gehybridiseerd met probe Gata3. B. E11.5 embryo gehybridiseerd met probe Foxg1. C. E10. 5 embryo gehybridiseerd met Gata3 probe die is gedeeltelijk afgebroken, met een zeer zwak signaal, maar hoge achtergrond door het hele embryo. D. E10.5 embryo gehybridiseerd met Pax1 sonde zonder aanprikken van de kop, met achtergrondkleuring in de ventrikels (pijlpunten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden die in dit protocol zijn op basis van een aantal verschillende bronnen en geoptimaliseerd voor ganse berg E8.5-E11.5 dagen oude muis embryo's. Methoden voor het ganse berg in situ hybridisatie van gewervelde embryo's verscheen voor het eerst in de vroege jaren 1990 2,5-12. Dit protocol werd aangepast hoofdzakelijk van methoden ontwikkeld voor Xenopus embryo 7,8 en muis 2,11. In ons protocol veel nadruk wordt gelegd op zorgvuldige kwaliteitsbeoordeling van de sonde. Aandacht voor het genereren van een hoge kwaliteit en hoge specifieke activiteit RNA probe zoals bepaald door de eerste stappen in dit protocol, vergroot de kwaliteit van de gegevens en sla aanzienlijke hoeveelheden tijd en moeite in de lange termijn. Het protocol omvat ook het gebruik van PCR gegenereerde DNA templates voor faag RNA polymerase transcriptie. Deze aanpak is een snelle en zeer schaalbaar. Het kan de generatie van een groot aantal RNA probes for grootschalige in situ hybridisatie schermen 13-15.
Verschillende stappen in dit protocol moeten worden overwogen wanneer de achtergrond is hoog, maar signaal is laag. Een overweging is de probe. We hebben nog nooit een hoge achtergrond met RNA-probes die het ontwerp criteria van dit protocol is voldaan en dat had doorgegeven alle drie de kwaliteitscontroles (opbrengst, specifieke activiteit en sonde lengte). Een andere factor die invloed kunnen hebben achtergrondniveaus is het vermogen van de probe te dringen in de embryonale weefsels. Zorg moet worden genomen tijdens de dissectie om volledig te verwijderen van de extra-embryonale membranen die het embryo te dekken. Bovendien de proteinase K digestie stap is essentieel voor embryo ouder dan E9.5. Langere proteinase K digestie tijde de lagere achtergrond en sterker signaal kan echter buitensporig digestietijden leiden tot meer weefselschade en kan leiden tot de desintegratie van de embryo tijdens de procedure. Optimization van de destructieperiode voor elke partij van proteinase K nodig om de beste resultaten. Een stap die kan worden geoptimaliseerd voor hoge signaal verkrijgen background verhoudingen is het RNase incubatie (stap 3.14). Ons protocol maakt gebruik van een mengsel van RNase A en RNase T1. Beide enzymen verteren enkelstrengs RNA maar elk enzym heeft een andere specificiteit base. De combinatie van de twee enzymen leidt tot uitgebreide digestie van enkelstrengs RNA te klein oligoribonucleotiden. Hierdoor zijn de meeste van de niet-specifieke probe gehybridiseerd verwijderd worden door de post-hybridisatie wassen resulteert in een sterke afname van achtergrondkleuring. Gebruik van RNase A of T1 alleen resulteert in verhoogde achtergrond en moet worden vermeden. We hebben ook gevonden dat de kwaliteit van de uiteindelijke kleurreactie wordt verbeterd door verse buffer AP, die onmiddellijk voor gebruik.
Onze protocol kan worden aangepast voor oudere embryo's of volwassen weefsel met extra verwerking. Zo hebben we ookgebruikte dit protocol uit te voeren in situ hybridisaties op dik (100 urn) vibratome delen van volwassen muizenhersenen (data niet getoond). We hebben ook gebruik gemaakt van deze protocol om genexpressie te bestuderen in oudere embryo's. In sommige gevallen hebben deze protocol genexpressie zichtbaar op het oppervlak van E13.5 en E14.5 embryo, zoals Gad1 expressie in de follikels van de vibrissae 4. In andere gevallen hebben we gebruik gemaakt van een scheermesje of scalpel om E12.5-E14.5 embryo's gesneden om sonde toegang tot specifieke weefsels te bieden binnen het embryo. Embryo fragmenten deze wijze bereid kunnen via dit protocol met enige modificaties. In deze gevallen de lengte van alle behandelingen en wasstappen moet worden aangepast aan weefselgrootte en empirisch geoptimaliseerd.
Het protocol omvat ook werkwijzen voor post-hybridisatie snijden en analyse van expressiepatronen. In combinatie met de ganse berg visualisatie van genexpressie deze extrationele stap kunt een veel aanvullende informatie met betrekking tot het expressiepatroon van een gen. We hebben ingesloten embryo na het ondergaan in situ hybridisatie in paraffine en in plastic hars 4,16. Secties van gekleurde embryo's kunnen worden gebruikt om een driedimensionale reconstructie van het expressiepatroon onthuld door de whole mount in situ hybridisatie procedure genereren. We hebben gebruik reconstructiesoftware van SURFdriver software voor dit doel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R21MH082360 (BGC) en R01HD056315 (NRM) en de Universiteit van Georgia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Reagent | Roche Group | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche Group | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche Group | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | PerkinElmer, Inc. | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche Group | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher Scientific | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene, Agilent Technologies | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros Organics | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences, Inc. | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche Group | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche Group | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche Group | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma-Aldrich | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche Group | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National Scientific Company | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisher Scientific | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences, Inc. | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisher Scientific | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma-Aldrich | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
- Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
- Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
- Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
- Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
- Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
- Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
- Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
- Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).
