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Biology

पूरे माउंट Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/2797
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics, University of Georgia

Summary

इस पूरे माउंट

Abstract

स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को परिभाषित करने के लिए एक बहुत जानकारीपूर्ण दृष्टिकोण है. स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया में लंबा है और तकनीकी रूप से कई महत्वपूर्ण कदम है कि सामूहिक रूप से अंतिम परिणाम की गुणवत्ता के लिए योगदान के साथ की मांग की. यह प्रोटोकॉल का विस्तार कई जांच लेबलिंग और प्रदर्शन के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण कदम वर्णन में कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है महत्वपूर्ण आवश्यक कदम की reproducibly उच्च गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए. सबसे पहले, हम digoxygenin (डीआईजी) लेबल डीएनए पीसीआर द्वारा उत्पन्न टेम्पलेट्स विट्रो प्रतिलेखन में शाही सेना के माध्यम से जांच की पीढ़ी का वर्णन करता है. हम तीन महत्वपूर्ण assays गुणवत्ता नियंत्रण का वर्णन करने के लिए राशि, अखंडता और जांच डीआईजी लेबल की विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण. ये कदम पर्याप्त संवेदनशीलता की एक जांच पैदा करने के लिए एक पूरी माउस भ्रूण में अंतर्जात mRNAs का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं.इसके अलावा, हम निर्धारण और स्वस्थानी संकरण में E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण की भंडारण के लिए विधियों का वर्णन. तो, हम rehydrated संकरण की स्थिति के बाद संकरण washes और RNase गैर विशिष्ट जांच संकरण को हटाने के लिए इलाज के विवरण के बाद भ्रूण की सीमित proteinase कश्मीर पाचन के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन. एक एंटीबॉडी एपी संयुग्मित लेबल जांच कल्पना और अंतर्जात प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रकट करने के लिए किया जाता है. प्रतिनिधि परिणाम सफल प्रयोगों और ठेठ suboptimal प्रयोगों से दिखाए जाते हैं.

Protocol

1. इन विट्रो प्रतिलेखन में के माध्यम Riboprobe पीढ़ी

  1. विट्रो प्रतिलेखन टेम्पलेट्स में पीसीआर उत्पादों की तैयारी.
    1. डिजाइनिंग फेज प्रतिलेखन प्रमोटर दृश्यों के साथ अपने 5 'के सिरों में पीसीआर प्राइमरों.
      नोट: प्रमोटर अनुक्रम जोड़ा भावना कतरा प्राइमर पीसीआर के 5'end भावना जांच transcribing के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, और प्रमोटर अनुक्रम antisense प्राइमर पीसीआर के 5'end जोडी जांच विरोधी भावना synthesizing के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. 1-3. हम प्रतिलेखन दक्षता टेम्पलेट्स कि केवल कोर प्रमोटर दृश्यों बनाम टेम्पलेट्स कि कोर प्रमोटर प्लस अतिरिक्त 5 दृश्यों शामिल होते हैं के बीच में कोई अंतर नहीं पाया गया है. T3 T7, और SP6 फेज प्रमोटरों के साथ इस पद्धति का इस्तेमाल किया गया है.
      दृश्यों के है कि अत्यधिक जीन परिवार के सदस्यों या अत्यधिक दोहराव दृश्यों के बीच संरक्षित कर रहे हैं क्योंकि वे गैर विशिष्ट संकरण और thereb में परिणाम कर सकते हैं बचा जाना चाहिएy पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना वृद्धि हुई है. उच्च जीसी सामग्री के साथ जांच रन टी अवशेषों की खुदाई - UTP समावेश digoxigenin अणुओं के बीच steric हस्तक्षेप के कारण सीमित कर देगा के साथ सीमित निगमन digoxigenin rUTP और डीएनए टेम्पलेट दृश्यों होगा. 300bp से जांच लंबाई 1kb लेकर कर सकते हैं. लेकिन के रूप में लंबे समय के रूप में उपरोक्त मानदंडों से मुलाकात कर रहे हैं, आम तौर पर लंबे समय तक जांच उच्च विशिष्ट गतिविधियों है.
    2. पीसीआर के लिए टेम्पलेट एक प्लाज्मिड क्लोन, जीनोमिक क्लोन या जीनोमिक डीएनए हो सकता है. आमतौर पर हम पूर्ण लंबाई EST क्लोनों (ATCC या ओपन Biosystems से जैसे) खरीद पीसीआर टेम्पलेट के रूप में उपयोग. टेम्पलेट डीएनए मानक पीसीआर प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए एक पीसीआर प्रमोटर दृश्यों से युक्त उत्पाद का उत्पादन बढ़ाना. पर्याप्त जांच टेम्पलेट्स कई जांच संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को हम आम तौर पर 8 x 50μl PCRs सेट का समर्थन करने के लिए कर सकते हैं. प्रतिक्रियाओं अगले कदम के लिए जमा कर रहे हैं. सामान्य में कुछ बड़ी मात्रा PCRs या अधिक छोटे (जैसे 50μl प्रतिक्रियाओं का उपयोग हम के रूप में) प्रतिक्रियाओंकई जांच संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त रहे हैं.
    3. Contaminating प्रोटीन को दूर करने के लिए, प्लाज्मिड तैयारी में विशेष रूप से RNase के निशान है, कम से कम 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर साथ 1μl 20mg/ml proteinase कश्मीर की पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रत्येक 100μl पचा. Proteinase कश्मीर पाचन के बाद इस्तेमाल किया सभी अभिकर्मकों और अन्य मदों RNase मुक्त हो सकता है और विशेष रूप से शाही सेना के काम के लिए समर्पित होना चाहिए.
    4. Proteinase कश्मीर पाचन के दौरान, एक जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया का एक नमूना चलाने के लिए पीसीआर उत्पाद की अखंडता की जांच करने के लिए. हम acrylamide मिनी जैल का उपयोग करने के लिए छोटे पीसीआर (कम से कम 600-700 बीपी) उत्पादों और agarose जैल को हल करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के लिए बड़ा पीसीआर उत्पादों (600-700 बीपी) को हल. यदि आप जेल पर कई बैंड देखते हैं, हम पीसीआर प्रतिक्रिया अनुकूलन इतना है कि आप सही आकार की एक पीसीआर उत्पाद प्राप्त करने की सलाह देते हैं.
    5. अच्छी तरह से proteinase एक phenol / क्लोरोफॉर्म MIXT (1:1) के एक बराबर मात्रा के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया पचा कश्मीर निकालनेure, क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा के साथ एक निष्कर्षण द्वारा पीछा किया. कम से कम 30 सेकंड के लिए ट्यूब vortexing द्वारा हर कदम पर मिश्रण. ये कदम एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए.
    6. 3M सोडियम एसीटेट और 100% इथेनॉल के 2 संस्करणों के 0.1 मात्रा जोड़कर शुद्ध पीसीआर उत्पाद वेग. -20 डिग्री सेल्सियस में कम से कम 30 मिनट के लिए छोड़ दें.
    7. एक microcentrifuge में 13,000 rpm पर 5 मिनट के लिए स्पिन, तैरनेवाला हटाने, और 70% इथेनॉल से धो लो. डीएनए गोली पूरी तरह से शुष्क करने की अनुमति.
    8. उपयुक्त मात्रा में Resuspend 1xTE की डीएनए (50μl उदाहरण के लिए). डीएनए एक fluorometer का उपयोग एकाग्रता उपाय.
    9. प्रत्येक पीसीआर प्राइमरों कि फेज प्रमोटर दृश्यों या जांच के भीतर एक आंतरिक अनुक्रम अनुरूप टेम्पलेट का उपयोग कर प्रस्तुत करने के nucleotide अनुक्रम का निर्धारण करते हैं. यह एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण कदम है कि यह सुनिश्चित करता है कि जांच टेम्पलेट सही क्रम है.
    10. इन विट्रो प्रतिलिपि में डीएनए के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा करने के लिए तैयार हैआयन. 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए टेम्पलेट स्टोर
  2. इन विट्रो प्रतिलेखन में एक टेम्पलेट के रूप में पीसीआर उत्पाद का उपयोग.
    1. 50μl की एक अंतिम मात्रा में एक आरएनए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेट. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया 500 - 1000 टेम्पलेट डीएनए की एनजी, 10X ट्रांसक्रिप्शन बफर के 5μl (साथ 100mm डीटीटी), 10μl 2.5mm खुदाई NTP मिश्रण, 3μl की शाही सेना पोलीमरेज़ (50 ~ 90 इकाइयों), अल्फा-32 पी CTP (ऊपर 1μl 6 महीने) पुराना है और मात्रा के शेष diethylpyrocarbonate इलाज पानी जोड़ने के द्वारा किया जाता है. 2.5mm मिश्रण खुदाई - NTP आम तौर पर एक 40μl 10μl 10mM CTP, 10μl 10mM GTP, 10μl 10mM एटीपी, 6.5μl 10mM UTP, 3.5μl 10mM digoxigenin-11 UTP युक्त स्टॉक के रूप में बना हुआ है. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया कोडांतरण में, यह सुनिश्चित करें कि सभी घटकों के प्रतिक्रिया (एंजाइम के लिए छोड़कर) कमरे के तापमान पर गरम कर रहे हो. डीएनए और पानी 1 मिश्रण है, तो प्रतिक्रिया बफर मिश्रण, जोड़ने और तब अन्य घटकों को जोड़नेअन्यथा प्रतिलेखन बफर में spermidine डीएनए पेंदी में बैठ जाना जाएगा. आरएनए पोलीमरेज़ सिफारिश तापमान में 2 घंटे के लिए सेते हैं.
      नोट: α-32 पी प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा है आप शुरू nucleotide पूल कि आरएनए जांच में शामिल किया है के अनुपात निर्धारित करने की अनुमति है. यह प्रतिक्रिया की क्षमता का एक महत्वपूर्ण उपाय है. निम्न चरणों में सभी 32 पी. से निपटने के लिए प्रक्रिया का पालन करें
      आरएनए संश्लेषित जांच की मात्रा को मापने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक छोटी मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए है. यह 32 पी लेबलिंग के प्रयोग से बचा जाता है (1.3.1 चरण में नोट्स देखें)
    2. ऊष्मायन के अंतिम कुछ मिनट के दौरान, निर्माता के निर्देशों के अनुसार त्वरित स्पिन स्तंभ (Roche) तैयार करते हैं.
    3. ऊष्मायन के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए RNase मुक्त DNase मैं और सेते 1μl जोड़ने.
    4. रिएक्शन मन्दन बफर की 50μl साथ 100μl तनु (20mm TrispH7.5, 1% एसडीएस, 20mm EDTA, 100mm NaCl (RNase मुक्त, एक 50ml और कमरे के तापमान पर शेयर की दुकान)). कुल गिनती के शुरू गिनती जगमगाहट के लिए और जेल के विश्लेषण के लिए (आमतौर पर 1x ते की 4μl में) 1μl ले लो.
    5. स्तंभ बिस्तर और स्पिन के केंद्र पर 1100 एक्स छ एक तालिका के शीर्ष नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में 4 मिनट के लिए प्रतिक्रिया के बाकी लागू. स्पिन के बाद अपने शाही सेना जांच संग्रह ट्यूब में है.
    6. Eluted प्रतिक्रिया में 100% इथेनॉल के 2 संस्करणों जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 5min (या -20 डिग्री सेल्सियस या 30 मिनट में) के लिए बर्फ पर रख.
    7. गोली आरएनए जांच करने के लिए 5 मिनट के लिए अधिकतम rpm पर एक microcentrifuge में ट्यूब स्पिन.
    8. विंदुक द्वारा पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली शुष्क हवा. मत देना क्योंकि यह बहुत मुश्किल हो सकता है इसे भंग करने पर सूखी गोली.
    9. 100 μl 1xTE या DEPC एच 2 ओ - 50 μl शाही सेना के साथ जांच भंग प्रतिशत निगमन का निर्धारण करने के लिए और विश्लेषण के लिए एक denat पर एक 1 μl नमूना ले लोacrylamide जेल uring. 100 एनजी / μl अनुमानित उपज के अनुसार अपनी जांच एकाग्रता समायोजित.
    10. जांच है कि सभी तीन गुणवत्ता नियंत्रण पारित किया है तो 6 to12 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है. हम आम तौर पर 12 महीने के भीतर जांच स्टॉक निकास. यह बहुत संभावना है कि जांच-20C बहुत विस्तारित अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  3. Riboprobe की गुणवत्ता का आकलन मापने जांच उपज.
    1. जांच करने के लिए उपज का अनुमान है, स्पिन स्तंभ (जांच संश्लेषण प्रोटोकॉल में लिए गए नमूनों के साथ मापा) से पहले प्रतिक्रिया में गिनती से स्पिन कॉलम के बाद बरामद मायने रखता विभाजित करते हैं. इस प्रतिक्रिया के लिए, 100% समावेश = 33 ग्राम. एक सफल प्रतिक्रिया आम तौर पर एक 15-50% उपज देता है. कम से कम 15% (<5 ग्राम उपज) समावेश के साथ जांच नहीं किया जाना चाहिए.
      नोट: जांच उपज को मापने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक छोटी मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या fluorometer का उपयोग करने के लिए हैसीधे आरएनए की मात्रा को मापने के बाद स्पिन कॉलम क्रोमैटोग्राफी उपस्थित थे. इस वैकल्पिक दृष्टिकोण 32 पी ट्रेस लेबलिंग के प्रयोग से बचा जाता है. हम riboprobe एकाग्रता का उपयोग कर एक Biotek युग Microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर मापा है. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से 32 पी समावेश से riboprobe जन के अनुमानों को प्राप्त मूल्यों की तुलना से पता चला है कि दो तरीकों तुलनीय अंतिम जांच तैयारी से एक इसी तरह की छोटी मात्रा (2 μl) नमूने का उपयोग कर परिणाम दे.
      लगभग हमेशा एक बहुत कम या कोई उपज RNase प्लाज्मिड पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया तैयारी से प्रारंभिक संदूषण की वजह से है. प्लास्मिड डीएनए और पीसीआर उत्पाद proteinase कश्मीर के साथ इलाज के रूप में कदम 1.1.3 में वर्णित सुनिश्चित.
  4. Riboprobe की गुणवत्ता का आकलन - विशिष्ट गतिविधि को मापने के.
    1. की सीमा को मापने digoxigenin UTP समावेश के लिए एक जगह का परीक्षण करने के. यह एक crucial गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण.
      100 एनजी / μl जांच एकाग्रता समायोजित करें. स्पॉट धारावाहिक dilutions का 1 μl (10 -2 के लिए 10 -5) Hybond - एन (जीई हेल्थकेयर) + या अन्य समकक्ष नायलॉन फिल्टर के एक 82mm व्यास पर जांच की. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक unlabeled डीएनए नमूने शामिल है. Crosslink 125mJoules पर एक यूवी crosslinker में नम तुरंत फिल्टर या नायलॉन फिल्टर आप का उपयोग कर रहे हैं के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
      निम्नलिखित कदम (1.4.2 - 1.4.6) के सभी एक पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर एक कमाल मंच पर प्रदर्शन कर रहे हैं. आप फिल्टर पर जांच dilutions खोलना के बाद RNase के बारे में चिंता करने की ज़रूरत नहीं है
    2. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1% अवरुद्ध 10ml में फिल्टर ब्लॉक 1X तमिलनाडु (10X TN बफर NaCl = 1M pH7.5 Tris, 1.5) में अभिकर्मक (Roche)
    3. 1 X 10ml 1X तमिलनाडु बफर में 15 मिनट धो लें.
    4. विरोधी digoxigenin फैब टुकड़ा के साथ 1/5000 1X तमिलनाडु बफर में कमजोर पड़ने पर 30 मिनट के लिए सेते हैं./ Li>
    5. 2 X 10ml 1X तमिलनाडु बफर में 15 मिनट धो लें.
    6. रंग प्रतिक्रिया बी.एम. बैंगनी सब्सट्रेट (पकवान में 5ml की जरूरत के बारे में) के साथ किया जाता है. 30 मिनट में 10 -4 कमजोर पड़ने से मौके पर रंग में दिखाई जानी चाहिए. उस बिंदु पर, 5X ते के साथ 5 मिनट के लिए 2 बार धोने से रंग प्रतिक्रिया बंद करो. यदि संकेत जगह है कि 10 -4 कमजोर पड़ने से मेल खाती है में दिखाई नहीं है तो जांच खारिज किया जाना चाहिए.
      नोट: हमारे अनुभव में, अपर्याप्त विशिष्ट गतिविधि कम जांच के साथ ही पाया जाता है. जांच टेम्पलेट (1kb के लिए) का आकार बढ़ाने जबकि अन्य डिजाइन इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट मापदंड का पालन करने के लिए जांच के विशिष्ट गतिविधि में वृद्धि करनी चाहिए. कम विशिष्ट गतिविधि के संकेत के कम या undetectable स्तर की ओर जाता है.
  5. एक 5% denaturing acrylamide जेल के माध्यम से टेस्ट वैद्युतकणसंचलन द्वारा जांच की अखंडता.
    यह एक और महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण परख है.इस प्रोटोकॉल ग्रहण कि जांच संश्लेषण प्रतिक्रिया के दौरान किया गया है 32 पी के साथ लेबल (1.2.1 कदम देखें). हम acrylamide जैल denaturing बहुत उच्च संकल्प प्रदान करने के लिए उपयोग करते हैं, तो हमें आसानी से अपमानित या अधूरा जांच का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. आमतौर पर एक 5% denaturing acrylamide minigel (7.5g यूरिया, 1.9ml 40% acrylamide, 1.9ml 2% बीआईएस acrylamide (या एक 20:01 acrylamide का उपयोग: बीआईएस acrylamide समाधान), 1.5ml 10X MOPS जेल बफर (0.2 एम morpholinopropanesulfonic एसिड, pH7.0, 50mm सोडियम एसीटेट 5mm EDTA) और एच 2 हे 15 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा) आकार में जांच पर्वतमाला इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है को हल करने के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करता है.
    नोट: एक विकल्प के रूप में, tbe यूरिया मिल में बना हुआ जैल विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है. मिल में बना हुआ जैल को चलाने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
    1. जेल लोड हो रहा है बफर (Ambion) की एक समान मात्रा के साथ नमूना मिलाएं और अच्छी तरह से मिश्रण.
    2. 95 के लिए हीट ° C 5 मिनट के लिए किसी भी माध्यमिक संरचना denature.
    3. Immediately जेल फिर से annealing रोकने के पर लोड करने से पहले बर्फ पर शांत.
    4. पहले और बाद स्तंभ के नमूने 200V पर एक साथ भागो नीले डाई तक जेल के अंत तक चलता है. जेल 1X MOPS जेल बफर में चलाया जाता है.
    5. प्लास्टिक की चादर में जेल लपेटें और यह एक्स - रे फिल्म या भास्वर imager स्क्रीन को बेनकाब radiolabeled शाही सेना का पता लगाने के लिए. यदि 32 पी लेबलिंग नहीं प्रयोग किया जाता है आप एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट डाई के साथ जेल दाग आरएनए का पता लगा सकते हैं
    6. एक सफल जांच संश्लेषण एक शाही सेना जांच है कि एक तेज बैंड के रूप में जेल के शीर्ष करने के लिए बहुत करीब migrates में परिणाम देगा.

2. संग्रह और माउस भ्रूण की भंडारण

  1. माउस भ्रूण बर्फ ठंड PBST (पीबीएस + 0.1% के बीच 20, ((DEPC) diethylpyrocarbonate इलाज)) में एकत्र किया जाना चाहिए और विच्छेदन के दौरान बर्फ पर रखा.
  2. भ्रूण 4 मिलीलीटर पेंच छाया कांच की शीशियों में संसाधित कर रहे हैं. एकाधिक भ्रूण को एक शीशी में तय किया जा सकता है. के रूप में कई के रूप में 10 से 15 E9.5या 5 E10.5 भ्रूण एक एकल शीशी में तय किया जा सकता है. भ्रूण के बढ़ते आकार के कारण, E11.5 भ्रूण एक धार के साथ hemisected किया जाना चाहिए निर्धारण संकरण के दौरान जांच का उपयोग करने में सहायता करने के लिए पहले. अप करने के लिए 3 hemisected E11.5 भ्रूण एक एकल शीशी में रखा जा सकता है.
  3. इस प्रोटोकॉल में कदम की प्रभावशीलता को अधिकतम और भ्रूण, भ्रूण निर्धारण और सभी washes नमूना शीशियों में शीशी गर्दन के निचले स्तर तक भरा समाधान के साथ प्रदर्शन कर रहे नुकसान को कम इतना है कि केवल एक छोटा सा हवाई बुलबुले रहता है, जब तक अन्यथा निर्दिष्ट नहीं है. धोने के सभी चरणों का शीशियों नीचे उनके पक्ष में एक घुमाव मंच पर रखी हैं.
  4. PBST में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ 4 सी ° एक कमाल की मेज पर रात भर के लिए 6 घंटे के लिए फिक्स. शीशियों क्षैतिज से रखा जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाकर रख एक घुमाव मंच पर
  5. निर्धारण के बाद, भ्रूण PBST में 5 मिनट के लिए दो बार धोया जाता है और बर्फ पर तो एक Metha के माध्यम से निर्जलित stepwisenol / PBST (PBST में 25% मेथनॉल, PBST में 50% मेथनॉल और PBST में 75% मेथनॉल) कांच पाश्चर pipettes का उपयोग कर शीशी में समाधान की जगह 100% मेथनॉल में श्रृंखला. भ्रूण 8 महीने के लिए 100% मेथनॉल में और शायद अब-20C में संग्रहित किया जा सकता है.

3. Digoxigenin के संकरण पूरे माउस भ्रूण जांच करने के लिए लेबल

  1. पंचर दिल और E10.5 और एक microdissection चाकू के साथ उम्र भ्रूण का सिर जबकि भ्रूण मेथनॉल में अभी भी कर रहे हैं (अगर इस विच्छेदन के दौरान नहीं किया गया था). यह सरल कदम धोने समाधान मस्तिष्क vesicles और दिल जिससे बहुत पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना कम कक्षों में प्रवेश करने की अनुमति देता है.
  2. एक श्रृंखला / मेथनॉल PBST में प्रत्येक मेथनॉल एकाग्रता में 5-10 मिनट के लिए लगातार washes (75% मेथनॉल में PBST, PBST में 50% मेथनॉल और फिर PBST में 25% मेथनॉल) भ्रूण rehydrate. 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए दो बार 100% PBST में धो लें.
  3. 04:01 PBST में सेते: 30% एच 2 हे 2बर्फ पर 1 घंटे के लिए. फिर 3 परिवर्तन के साथ 1X PBST में 5 मिनट धो प्रत्येक.
  4. पिछले PBST धोने निकालें और 1ml छ / मिलीलीटर proteinase कश्मीर PBST में 10 के साथ जगह. एक 25 डिग्री सेल्सियस नहाने के पानी में एक रैक में proteinase कश्मीर पाचन ट्यूबों खड़ी जगह के दौरान.
    नोट: proteinase कश्मीर के समाधान आत्म पाचन के कारण समय पर गतिविधि खो देते हैं. अधिकतम और लगातार गतिविधि को सुनिश्चित करने के proteinase कश्मीर समाधान तुरंत प्रत्येक का उपयोग करने से पहले ताजा कर दिया जाना चाहिए. प्रत्येक उपयोग एक 1mg/ml स्टॉक की एक छोटी राशि है तो इसे कमजोर. ऊष्मायन proteinase कश्मीर पाउडर के प्रत्येक बहुत कुछ समय के लिए है और प्रत्येक भ्रूण उम्र के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, E9.5 भ्रूण के लिए एक अच्छा समय आमतौर पर 25 मिनट में 10-15 डिग्री सेल्सियस जबकि E10.5 के लिए यह आम तौर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट है proteinase कश्मीर ऊष्मायन समय भी प्रयोगों के दौरान ठीक चाहिए मापा जा शीशियों के बीच और प्रयोगों के बीच वैध तुलना के लिए अनुमति देने के लिए. तापमान को बढ़ाने के पाचन के दौरान ध्यान रखा जाना चाहिए    reproducibility. 1 के रूप में छोटे रूप में मतभेद डिग्री सेल्सियस प्रयोगों के बीच पाचन की राशि बदल सकते हैं. यह पुरजोर सिफारिश की है कि proteinase कश्मीर digestions एक मशीन या सटीक तापमान नियंत्रण के लिए एक waterbath में किया जाना है. जांच जिससे मजबूत संकेत पैदा ऊतक घुसना करने के लिए अनुमति देने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है. हालांकि, पर पाचन भ्रूण को नुकसान और वे धीरे - धीरे खत्म हो बचे हुए चरणों के दौरान बिखर जाएगा.
  5. 5 मिनट के लिए दो बार ताजा बना 2 मिलीग्राम / मिलीलीटर ग्लाइसिन PBST में प्रत्येक धोने धोने के कमरे के तापमान पर proteinase कश्मीर पाचन बंद करो. फिर PBST में 5 मिनट के लिए दो बार धो लो.
  6. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​/ PBST, 0.2% gluteraldehyde (Polysciences) में पचा भ्रूण को ठीक करें. खत्म करना है या नहीं underfix. PBST में 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं.
  7. इस बिंदु पर, भ्रूण संकरण के लिए समूहों में विभाजित किया जाना चाहिए. PBST निकालें. 1 मिलीग्राम संकरण बफर (50% ult जोड़ें(Invitrogen) rapure Formamide, 5x एसएससी, 5 पीएच, 1% एसडीएस, 50 ग्राम / एमएल हेपरिन (acros), 50 ग्राम / एमएल torula आरएनए (सिग्मा)) है कि 65 डिग्री सेल्सियस (जांच) के बिना गरम है. भ्रूण को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, तब hybrization बफर के सभी को हटा दें और 1 मिलीग्राम नए सिरे से जांच के बिना गर्म संकरण बफर के साथ बदलें.
  8. 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक मिलाते हुए पानी में स्नान या कमाल मंच (Boekle हिला 'एन' गरम ओवन उदाहरण के लिए, 1 टेबल देखें) पर एक ओवन में Prehybridize. यदि आप एक पानी में स्नान सेते शीशियों यकीन है कि पानी के लिए आता है, लेकिन अधिक नहीं, शीशियों में से सबसे ऊपर हो. संकरण तापमान 70 से बढ़ सकता है ° सी. 65 संकरण से ऊपर तापमान ° C अधिकांश जांच हम परीक्षण किया है के साथ संकेत तीव्रता या पृष्ठभूमि नहीं प्रभावित करते हैं. भ्रूण, चिपचिपा, पारदर्शी और Formamide buffers में कमजोर (जैसे संकरण बफर) सावधान रहना है जब उन्हें संभाल हो गया है.
  9. 0.4ml संकरण बफर एक जांच युक्त साथ prehybridization बफर बदलें0.25-1 छ / मिलीलीटर की एकाग्रता. भ्रूण के लिए जांच की 0.5 ग्राम / मिलीलीटर E8.5 के बारे में प्रयोग करें. उम्र भ्रूण जांच को 1-0.1 से titrated छ / मिलीलीटर कम पृष्ठभूमि (आमतौर पर 0.25-0.5 छ / मिलीलीटर या तो) के साथ एक अच्छा संकेत के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण किया जाना चाहिए. ध्यान दें कि बड़ा संकरण संस्करणों बड़ा भ्रूण के लिए आवश्यक हो सकता है. 65 पर रातोंरात संकरण डिग्री सेल्सियस
  10. यदि भ्रूण पर proteinase लालकृष्ण साथ इलाज किया गया है वे अत्यंत पारदर्शी दिखाई देगा. वे भी शीशी के पक्ष में रहना, हो सकता है, या अलग गिर. भ्रूण कि इस तरह दिखाई देते हैं प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर खारिज किया जाना चाहिए. उन्हें प्रसंस्करण आगे व्याख्या डेटा में परिणाम नहीं होगा.
  11. गर्म समाधान के साथ संकरण बफर बदलें पर 70 (50% Formamide, एसएससी 5x 5 पीएच, 1% एसडीएस) मैं डिग्री सेल्सियस E8.5 भ्रूण, E9.5 और पुराने के लिए धोने प्रति 30 मिनट के लिए तीन बार के लिए दो बार 30 मिनट के लिए प्रत्येक धोने धो लें.
  12. धो: 50% समाधान II (0.5 पूर्व गर्म 50% समाधान के साथ मैं एक बारएम NaCl, 10mm Tris एचसीएल पीएच 7.5, 0.1% के बीच 20) 70 पर ° सी 10 मिनट के लिए.
  13. समाधान द्वितीय के साथ धोने प्रति 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर तीन बार धोएं.
  14. समाधान द्वितीय, RNase 100 छ / मिलीलीटर, RNase T1 100 इकाइयों / मिलीलीटर युक्त बफर बदलें. धोने प्रति 30 मिनट के लिए दो बार 37C गर्म कमरे में एक घुमाव पर सेते RNase धोने पृष्ठभूमि को कम करने के लिए आवश्यक है. Nonspecifically hybridized जांच से हुई.
  15. 65 पर समाधान III (50% Formamide, 2x pH5 एसएससी) में धो ° C दो बार E8.5, E9.5 और पुराने के लिए धोने प्रति 30 मिनट के लिए 3 बार के लिए 30 मिनट के लिए प्रत्येक धोने.
  16. साथ 1X TBST (10X टीबीएस के 100 मिलीलीटर 8g NaCl, 0.2g KCl, 12.5ml 2M पानी में Tris एचसीएल 7.6 पीएच शामिल 1X TBST पानी की उचित मात्रा में 10X टीबीएस पतला और धोने प्रति 5 मिनट के लिए 3 बार धोयें. जोड़ने के बीच अंतिम एकाग्रता 20 0.1%)
  17. जब तक निर्दिष्ट, सभी washes नमूना शीशियों में के निचले स्तर पर भरा समाधान के साथ प्रदर्शन कर रहे हैंशीशी गर्दन. धोने के सभी चरणों के लिए, शीशियों नीचे उनके पक्ष में एक घुमाव मंच पर रखी हैं.

4. Digoxygenin के एंटीबॉडी का पता लगाने जांच लेबल

  1. भ्रूण 0.5 मिलीलीटर 1X TBST + 10% गर्मी का इलाज भेड़ सीरम में पूर्व अवरुद्ध. तो शीशियों खड़ी कम से कम 2.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान (~ 20 डिग्री सेल्सियस) पर रॉक.
  2. Alkaline फॉस्फेट संयुग्मित विरोधी digoxigenin भेड़ फैब टुकड़े (भ्रूण एसीटोन पाउडर के साथ incubating द्वारा घटाया, नीचे देखें) के 1:5000 कमजोर पड़ने ताजा 1X TBST साथ अवरुद्ध समाधान + 10% 1:2000 एक युक्त सीरम बदलें. E9.5 और उम्र भ्रूण के लिए उच्च dilutions का प्रयोग करें, 1:5000 अप करने के लिए पृष्ठभूमि के लिए कम से कम. घुमाव पर खड़ी 4 ° C विकेट पर सेते हैं.
    नोट: हमने पाया है कि विरोधी एक भ्रूण एसीटोन पाउडर के साथ फैब टुकड़े digoxigenin ऊष्मायन पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना इस प्रोटोकॉल में स्तर को कम कर देता है. तैयार भ्रूण एसीटोन पाउडर जमा E12.5 14.5 माउस embr homogenizeपीबीएस की एक न्यूनतम मात्रा में yos. 4 बर्फ ठंड एसीटोन मिश्रण, की मात्रा जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर कताई तैरनेवाला निकालें. बर्फ के ठंडे एसीटोन के साथ गोली धो और फिर स्पिन. गोली से बाहर फैला और फिल्टर पेपर के एक पत्रक पर पाउडर में पीसने और यह शुष्क हवा करने के लिए अनुमति देते हैं. पाउडर तो एक हवाई तंग ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर साल के लिए भंडारित किया जा.
    , एंटीबॉडी एंटीबॉडी घटाव के लिए किया जाना चाहिए भ्रूण एसीटोन पाउडर पूर्व अवशोषित के दौरान या उससे पहले पूर्व अवरुद्ध nonspecific बाध्यकारी कम. / 1 100 में भ्रूण पाउडर की एक छोटी सी राशि (राशि महत्वपूर्ण नहीं है) के साथ 1xTBST/10% 4 में कम से कम 1 ghante के लिए सीरम में एंटीबॉडी सेते ° सी के साथ कमाल. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक microcentrifuge में कताई पाउडर निकालें घटाया एंटीबॉडी कम से कम 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  3. 1X TBST के साथ तीन बार 5 मिनट प्रत्येक धोएं, तो कमरे के तापमान पर प्रत्येक 1hr के लिए 5-6 बार अतिरिक्त एंटीबॉडी को दूर. यदि pसंदर्भित, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तारित रातोंरात धोने करने के लिए पृष्ठभूमि कम. रातोंरात धोने नाटकीय रूप से पृष्ठभूमि जिससे शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ते स्तर को कम कर सकते हैं.
  4. धोने प्रति 20 मिनट के लिए दो बार ताजा बना alkaline फॉस्फेट बफर (100mm Tris, पीएच 9.5, 50mm 2 MgCl, 100mm NaCl, 0.1% 20 Tween 0.5mg/ml levamisole जोड़ें., एक अंतर्जात एपी अवरोध करनेवाला, E9.5 के लिए और पुराने के साथ धो ) भ्रूण.
  5. बी.एम. बैंगनी एपी सब्सट्रेट (Roche) के साथ कमरे के तापमान को prewarmed पिछले धोने बदलें.
  6. रंग प्रतिक्रिया के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, और एक विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से संकेत के लिए समय - समय पर देखने के लिए अनुमति दें. विस्तारित रंग प्रतिक्रियाओं (रात भर के लिए कई घंटे) के लिए शीशियों प्रकाश से परिरक्षित किया जाना चाहिए. प्रचुर मात्रा mRNAs के लिए सिग्नल 15 मिनट के भीतर दिखाई जानी चाहिए. जब आप संकेत के साथ संतुष्ट हैं प्रतिक्रियाओं रोका जा चाहिए, या जब पृष्ठभूमि करने के लिए एक समस्या हो शुरू होता है. यदि समाधान ही अंधेरे बारी शुरू तुम ग का विस्तार कर सकते हैंolor सब्सट्रेट समाधान की जगह द्वारा प्रतिक्रिया.
  7. 1X PBST/5mM EDTA में धोने के प्रति 5 मिनट के लिए दो बार धोने से प्रतिक्रिया बंद करो.
  8. 4% paraformaldehyde PBST / फिर से तय करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए, कई घंटे से रात भर के लिए. या भ्रूण साल के लिए 4% paraformaldehyde/1X PBST में संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत सेक्शनिंग के लिए संसाधित किया जा सकता है. यह अंतिम कदम निर्धारण धुंधला पैटर्न के लंबी अवधि के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है.

5. पैराफिन embedding और दाग भ्रूण की सेक्शनिंग

  1. इससे पहले भ्रूण रंग प्रतिक्रिया (4.8 कदम) पूरे माउंट दाग भ्रूण के चित्रों के बाद जब धुंधला हो जाना स्तर वांछित तीव्रता में लिया जाता है तय कर रहे हैं. पूरे भ्रूण में अभिव्यक्ति पैटर्न का दस्तावेजीकरण करने के बाद वे बी.एम. बैंगनी सब्सट्रेट में incubated रात भर कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए जब तक पूरे भ्रूण गहरे नीले रंग बन जाता है. इस कदम के लिए सुनिश्चित करें कि धुंधला हो जाना पर्याप्त वें में दिखाने के लिए अंधेरा हो जाएगाई ऊतक वर्गों. कृपया ध्यान दें कि भ्रूण की नीले रंग भ्रूण सतह पर एक रंगद्रव्य का एक बहुत पतली परत के बयान की वजह से है. इस पृष्ठभूमि धुंधला हो हित के ऊतक के भीतर सेक्शनिंग के बाद नहीं detectable जाएगा.
  2. पीबीएस के साथ तीन बार धो दाग भ्रूण को दूर करने के अतिरिक्त सब्सट्रेट precipitates और 4% पीएफए ​​में 4 में रात को ठीक ° सी.
  3. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और फिर 100% मेथनॉल (के रूप में 2.4 में वर्णित) में भ्रूण निर्जलीकरण.
  4. Xylene के साथ पिछले मेथनॉल बदलें. 2 मिनट के लिए प्रत्येक धोने xylene 2 से 3 बार में धो जब तक भ्रूण स्पष्ट हो गया है. नहीं खत्म करो xylene में धोने के बाद से यह बहुत भंगुर ऊतक बनाने के बाद यह यह बहुत मुश्किल बरकरार वर्गों को ठीक करने के लिए कर रही है एम्बेडेड है. नेत्रहीन प्रत्येक xylene ऊष्मायन पर नजर रखने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण स्पष्ट किया जा रहा है की सिर्फ बात करने के लिए कर रहे हैं और बहुत सावधान रहना xylene ऊष्मायन इस बिंदु से परे का विस्तार करने के लिए अनुमति नहीं है.
  5. स्थानांतरण भ्रूण (E10.5 और पुरानेबायोप्सी) यकीन है कि टेक कैसेट (Fisherbrand) में, और मोम में पूरे कैसेट (Fisherbrand) 15 ~ 65 मिनट में 30 डिग्री सेल्सियस के सेते हैं एक और ~ 15 30min के लिए नए सिरे से मोम में बदलें और तब फिर से बदल. छोटे भ्रूण ऊतक / चड्डी कम मोम ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है. E9.5 भ्रूण सभी मोम परिवर्तन के लिए टिशू embedding molds में रखा जा सकता है. उन मामलों में आप भ्रूण स्थानांतरित करने की बजाय मोल्ड से मोम निकाल सकते हैं.
  6. तीन मोम ऊतक embedding molds (Polysciences) में परिवर्तन हस्तांतरण भ्रूण के बाद और ताजा मोम के साथ एम्बेड. ध्यान सेक्शनिंग के वांछित विमान के लिए भ्रूण स्थिति. मोम जब तक जम शांत करने के लिए करते हैं.
  7. धारा 8 ~ 14μm स्लाइस में मानक सूक्ष्म (जैसे Leica RM2155) का उपयोग करते हुए मोम ब्लॉकों. खुर्दबीन स्लाइड (Fisherbrand) पर वर्गों ले लीजिए.
  8. चलो स्लाइड्स और फ्लैट सूखी एक slidewarmer पर रखना. स्लाइड महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  9. सूखे वर्गों दो 5 मिनट xylen Dewaxedई washes और धारावाहिक / मेथनॉल पानी washes (100% मेथनॉल 2 मिनट, 100% मेथनॉल 2 मिनट, 90% / मेथनॉल पानी 2min, 70% / मेथनॉल पानी 2min, विआयनीकृत पानी 5 मिनट) पानी में rehydrated.
  10. परमाणु तेजी से लाल (सिग्मा) 1 मिनट के लिए धुंधला हो समाधान के साथ वर्गों दाग. परमाणु तेज लाल धुंधला हो समाधान उत्पन्न परमाणु तेजी से लाल रंग का एक केंद्रित स्टॉक कमजोर (0.1% 5% पानी में एल्यूमीनियम सल्फेट में परमाणु तेजी लाल, गर्मी और वाटमान फिल्टर पेपर के माध्यम से फिल्टर के साथ भंग) 5 के एक जलीय घोल में 1:05 % एल्यूमीनियम सल्फेट. धुंधला के बाद पानी चल रहा है जब तक पानी साफ हो जाता है के साथ स्लाइड्स धो लो. एक counterstain के रूप में परमाणु तेज लाल कार्य करता है और वर्गों में समग्र ऊतक संरचना का पता चलता है. इसका रंग धुंधला हो जाना बैंगनी नीले रंग कि आरएनए जांच के स्थानीयकरण के निशान के साथ अच्छी तरह से विरोधाभासों. परमाणु तेज लाल एक saturating दाग है और धुंधला हो तीव्रता धुंधला समाधान की एकाग्रता द्वारा नियंत्रित किया जाता है. यदि परमाणु तेजी लाल धुंधला हो जाना की तीव्रताअपर्याप्त है जब यह धुंधला हो समाधान का उपयोग कर आप एक और अधिक केंद्रित परमाणु तेजी लाल समाधान के साथ इस कदम को दोहरा सकते हैं.
  11. निम्नलिखित श्रृंखला में समाधान में से प्रत्येक में washes द्वारा coverslips बढ़ते के लिए स्लाइड तैयार: 90% / 100% मेथनॉल में 2 washes द्वारा पीछा पानी मेथनॉल xylenes में 2 washes द्वारा पीछा किया. Washes में से प्रत्येक में 2 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं.
  12. Cytoseal 60 बढ़ते मध्यम (वैज्ञानिक रिचर्ड एलन) के साथ स्लाइड माउंट. कृपया ध्यान दें कि जलीय बढ़ते मीडिया को भंग करेंगे परमाणु तेजी लाल दाग.
    नोट: हम भी एक प्लास्टिक embedding (इम्यूनो - बिस्तर, Polysciences इंक) राल उत्कृष्ट 4 परिणाम साथ दाग भ्रूण की वर्गों उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1 प्रतिनिधि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त परिणाम दिखाता है. चित्रा 1A Gata3 की E10.5 माउस भ्रूण में अभिव्यक्ति पैटर्न से पता चलता है. इस पैनल में एक अच्छा r दिखाता हैपृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत के साथ esult. चित्रा 1C, इसके विपरीत में पता चलता है, एक Gata3 mRNA है कि एक आंशिक रूप से अपमानित शाही सेना जांच के लिए स्वस्थानी संकरण में विफल पृष्ठभूमि विपरीत कम संकेत के साथ इसी तरह के परिणाम में एक कम विशिष्ट गतिविधि के जांच परिणाम होगा. पैनल की तुलना ए और सी महत्व को दिखाता है सावधान गुणवत्ता नियंत्रण आकलन जांच गुणवत्ता के प्रदर्शन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को सुनिश्चित करने के. Foxg1 जांच (चित्रा 1B) से प्राप्त परिणाम भी मस्तिष्क के अन्य भागों में कम पृष्ठभूमि के साथ telencephalon में विशिष्ट धुंधला के साथ एक अच्छा परिणाम दिखाता है. मस्तिष्क और हृदय पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना आम साइटों जांच फँसाने की वजह से कर रहे हैं. मस्तिष्क और संदंश के साथ दिल puncturing भ्रूण और कम से कम पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना में समाधान धोने (3.1 कदम देखें) की अनुमति देता है. चित्रा 1D ठेठ हल्के नीले रंग की पृष्ठभूमि में पाया गया जब मस्तिष्क नहीं हवा निकाल दी है दिखाता है. इससे पता चलता है एक suboptimal परिणाम प्राप्त एक Pax1 जांच का प्रयोग. Pax1 मस्तिष्क के किसी भी हिस्से में व्यक्त नहीं किया है और इस भ्रूण के मस्तिष्क में देखा धुंधला हो जाना के सभी गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि के कारण है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रतिनिधि परिणाम सफल (ए, बी) और suboptimal (सी, डी) के परिणामों उदाहरण दिखा. ए E10.5 Gata3 भ्रूण जांच के साथ संकरित बी E11.5 भ्रूण Foxg1 जांच के साथ संकरित. सी. E10. 5 भ्रूण Gata3 जांच है कि आंशिक रूप से अपमानित है साथ संकरित, पूरे भ्रूण बाहर के माध्यम से बहुत ही कमजोर संकेत है, लेकिन उच्च पृष्ठभूमि दिखा डी. E10.5 भ्रूण सिर puncturing बिना Pax1 जांच के साथ संकरित ventricles (तीर सिर) में पृष्ठभूमि धुंधला हो दिखा.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों के विभिन्न स्रोतों के एक नंबर से अनुकूलित किया गया है और पूरे माउंट E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण के लिए अनुकूलित. हड्डीवाला भ्रूण की स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट के लिए तरीके पहली बार 1990 के दशक 2,5-12 में दिखाई दिया. इस प्रोटोकॉल Xenopus 7,8 भ्रूण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 2,11 माउस के लिए विकसित की विधियों से मुख्य रूप से रूपांतरित किया गया. हमारे प्रोटोकॉल में जोर का एक बड़ा सौदा जांच के सावधान गुणवत्ता मूल्यांकन पर रखा गया है. इस प्रोटोकॉल में जल्द से जल्द कदम से एक उच्च गुणवत्ता और उच्च विशिष्ट गतिविधि शाही सेना को पैदा करने के लिए सावधान ध्यान के रूप में निर्धारित PROBE बहुत डेटा की गुणवत्ता में वृद्धि होगी और लंबे समय में समय और प्रयास की काफी मात्रा में बचा. हमारी प्रोटोकॉल भी फेज आरएनए पोलीमरेज़ प्रतिलेखन के लिए पीसीआर उत्पन्न डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग भी शामिल है. इस दृष्टिकोण तेजी से और बहुत स्केलेबल है. यह आरएनए जांच के लिए एक बड़ी संख्या के पीढ़ी सक्षम कर सकते हैंस्वस्थानी संकरण में बड़े पैमाने पर r 13-15 स्क्रीन.

इस प्रोटोकॉल में कई कदम जब पृष्ठभूमि उच्च है, लेकिन संकेत कम है माना जाना चाहिए. एक विचार की जांच है. हम आरएनए जांच जो डिजाइन इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट मानदंड से मुलाकात की और कहा कि सभी तीन गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षणों (उपज, विशिष्ट गतिविधि और जांच की लंबाई) पारित किया था के साथ उच्च पृष्ठभूमि कभी नहीं किया है. एक और पहलू है कि पृष्ठभूमि के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं जांच की क्षमता को भ्रूण के ऊतकों में घुसना है. देखभाल विच्छेदन के दौरान लिया जाना चाहिए करने के लिए पूरी तरह से extraembryonic झिल्ली है कि भ्रूण कवर हटाने. इसके अलावा, proteinase कश्मीर पाचन कदम E9.5 से अधिक पुराने भ्रूण के लिए जरूरी है. अब proteinase कश्मीर पाचन बार कम पृष्ठभूमि और मजबूत संकेत देते हैं, लेकिन, अत्यधिक पाचन बार ऊतकों को नुकसान में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व और प्रक्रिया के दौरान भ्रूण के विघटन में परिणाम हो सकते हैं कर सकते हैं. Optimizatपाचन समय के proteinase कश्मीर के प्रत्येक स्थल के लिए आयन के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. एक और कदम है कि पृष्ठभूमि अनुपात उच्च संकेत प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है RNase ऊष्मायन (3.14 कदम) है. हमारा प्रोटोकॉल RNase एक और RNase T1 के एक मिश्रण का उपयोग करता है. दोनों एंजाइमों एकल असहाय आरएनए पचाने लेकिन हर एंजाइम एक अलग बेस विशिष्टता है. एकल असहाय आरएनए के छोटे oligoribonucleotides व्यापक पाचन में दो एंजाइमों के परिणामों के संयोजन. यह सक्षम बनाता है सबसे गैर विशेष रूप से संकरित के बाद संकरण द्वारा हटाया जा जांच की पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना एक बड़ी कमी में जिसके परिणामस्वरूप washes. वृद्धि की पृष्ठभूमि में RNase एक या T1 परिणाम अकेले का प्रयोग करें और बचा जाना चाहिए. हम यह भी पाया गया है कि अंतिम रंग प्रतिक्रिया की गुणवत्ता ताजा एपी बफर का उपयोग करके सुधार हुआ है, तुरंत उपयोग करने के लिए पूर्व बनाया.

हमारा प्रोटोकॉल पुराने अतिरिक्त संसाधन के साथ या भ्रूण वयस्क ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम भी हैंइस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल वयस्क माउस मस्तिष्क (नहीं दिखाया डेटा) की मोटी (100 सुक्ष्ममापी) vibratome वर्गों पर स्वस्थानी hybridizations में प्रदर्शन. हम भी इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है पुराने भ्रूण में जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन. कुछ मामलों में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है E13.5 और E14.5 भ्रूण 4 दृढ़रोम के रोम में Gad1 अभिव्यक्ति के रूप में इस तरह की सतह पर जीन की अभिव्यक्ति की कल्पना. अन्य मामलों में हम एक रेजर ब्लेड या स्केलपेल E12.5 - E14.5 भ्रूण में कटौती करने के लिए भ्रूण के भीतर जांच विशिष्ट ऊतकों के लिए उपयोग प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया है. इस तरीके से तैयार भ्रूण टुकड़े को कुछ संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित किया जा सकता है. इन मामलों में सभी उपचार और वाशिंग कदम की लंबाई ऊतक आकार के अनुसार समायोजित किया जा और empirically अनुकूलित की जरूरत है.

हमारा प्रोटोकॉल के बाद संकरण और अभिव्यक्ति पैटर्न के सेक्शनिंग विश्लेषण के लिए तरीके भी शामिल हैं. जीन की अभिव्यक्ति की पूरी आरोह दृश्य इस addi के साथ संयुक्तराष्ट्रीय कदम एक जीन की अभिव्यक्ति के पैटर्न के बारे में अतिरिक्त जानकारी का एक बड़ा सौदा जोड़ सकते हैं. हम आयल में स्वस्थानी संकरण के दौर से गुजर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद प्लास्टिक 4,16 राल में भ्रूण एम्बेडेड है. दाग भ्रूण की धारा अभिव्यक्ति स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया में पूरे माउंट द्वारा पता चला पैटर्न के एक तीन आयामी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस उद्देश्य के लिए SURFdriver सॉफ्टवेयर से पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान R21MH082360 (BGC) और R01HD056315 (एनआरएम) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जॉर्जिया के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Reagent Roche Group 11209256910
Ribonucleoside Triphosphate Set Reagent Roche Group 11277057001
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification Supply Roche Group 11274015001
T7 RNA polymerase Reagent Roche Group 10881767001
SP6 RNA polymerase Reagent Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase Reagent Roche Group 11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi Reagent PerkinElmer, Inc. BLU008X250UC
DNase I recombinant, RNase-free Reagent Roche Group 4716728001
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder Reagent Fisher Scientific BP169-500
Gel loading buffer Reagent Ambion AM8547
Hybond-N+, Amersham Supply GE Healthcare RPN82B
UV Stratalinker 2400 Equipment Stratagene, Agilent Technologies
Diethyl pyrocarbonate Reagent Sigma-Aldrich D5758-100ML
Heparin sodium Reagent Acros Organics 41121-0010
hydrogen peroxide 30% in water Reagent Fisher Scientific BP2633-500
Gluteraldehyde, 8% EM grade Reagent Polysciences, Inc. 0/710 Use with caution according to manufacture’s instructions
Blocking reagent Reagent Roche Group 11096176001 Make into 5% stock and store at -20° C
Proteinase K Reagent Roche Group 3115852001
Rnase A Reagent Roche Group 10109142001 Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C.
Rnase T1 Reagent Roche Group 10109193001
Ultrapure Formamide Reagent Invitrogen 15515-026
Levamisole hydrochloride Reagent ICN Biomedicals 155228
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI Reagent Sigma-Aldrich R6625 phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. Reagent Roche Group 11 442 074 001
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit Supply National Scientific Company B7800-2
Shake N Bake hybridization oven Equipment Boekel Scientific 136400
Biopsy Sure-Tek Supply Fisher Scientific 15-200-402C
Paraplast Plus tissue embedding medium Reagent Fisher Scientific 23-021-400
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds Supply Polysciences, Inc. 18646A
Colorfrost Plus Microscope slides Supply Fisher Scientific 12-550-17
Nuclear Fast Red Reagent Sigma-Aldrich N8002
Cytoseal 60 Reagent Richard-Allan Scientific 8310-16

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान 56 अंक transcriptome, माउस भ्रूण जीन अभिव्यक्ति टेप mRNA, riboprobe
पूरे माउंट<em&gt; स्वस्थानी में</em&gt; E8.5 E11.5 माउस भ्रूण संकरण
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Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (56), e2797, doi:10.3791/2797 (2011).

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