Summary
Hela denna montering
Abstract
Hela montera in situ hybridisering är en mycket informativ strategi för att definiera mönster genuttryck i embryon. In situ hybridisering förfaranden är långa och tekniskt krävande med flera viktiga steg som tillsammans bidrar till kvaliteten på det slutliga resultatet. Detta protokoll beskriver i detalj flera kontroll viktiga kvalitets steg för att optimera sond märkning och prestanda. Sammantaget ger vår protokoll en detaljerad beskrivning av de kritiska åtgärder som är nödvändiga för att reproducerbart få resultat av hög kvalitet. Först beskriver vi generering av digoxigenin-märkta (DIG) RNA-prober via transkription in vitro av DNA-mallar genererades genom PCR. Vi beskriver tre kritiska analyser kvalitetskontroll för att bestämma mängden, integritet och specifik aktivitet för DIG-märkta prober. Dessa steg är viktiga för att generera en sond med tillräcklig känslighet för att detektera endogena mRNA i en hel musembryo.Dessutom beskriver vi metoder för fixering och lagring av E8.5-E11.5 dygn gamla musembryon för in situ hybridisering. Sedan beskriver vi detaljerade metoder för begränsad proteinas K nedbrytning av de rehydrerade embryon följt av detaljerna i de hybridiseringsbetingelser, efter hybridisering tvättar och RNas behandling för att avlägsna icke-specifik sond hybridisering. En AP-konjugerad antikropp används för att visualisera den märkta proben och avslöjar uttrycksmönstret av den endogena transkriptet. Representativa resultat visas från framgångsrika experiment och typiska suboptimala experiment.
Protocol
1. Riboprob generation genom in vitro-transkription
- Förberedelse PCR-produkter för in vitro transkription mallar.
- Designing PCR-primrar med promotor fag transkriptions-sekvenser i deras 5-ändar.
Obs: Promotorsekvensen läggs till 5'-änden av sens-strängen PCR-primer kommer att användas för att transkribera känslan sonden, och promotorsekvensen sattes till 5'-änden av antisens-PCR-primern kommer att användas för att syntetisera anti-sens sökfragment 1-3. Vi har inte upptäckt någon skillnad i transkription effektivitet mellan mallar som endast innehåller sekvenser centrala promotor vs mallar som innehåller kärnan promotorn plus ytterligare 5 'sekvenser. Denna metod har använts med T3, T7 och SP6 promotorer fag.
Sekvenser som är mycket konserverade bland medlemmarna genfamilj eller mycket repetitiva sekvenser bör undvikas, eftersom de kan resultera i icke-specifik hybridisering och thereby öka bakgrundsfärgning. Prober med hög GC-halt kommer att ha begränsad digoxigenin-rUTP inkorporering och DNA-sekvenser mall med körningar av T-rester kommer att begränsa införlivandet av dig-UTP grund sterisk interferens mellan digoxigenin molekylerna. Sonden längd kan variera från 300 bp till 1 kb. Men så länge ovanstående kriterier är uppfyllda, oftast längre sönder har högre specifika aktiviteter. - Mallen för PCR kan vara en plasmidklon, genomisk klon eller genomiskt DNA. Vanligtvis köper vi fullängds EST-kloner (t.ex. från ATCC eller Open Biosystems) att använda som PCR-mallar. Amplifiera templat-DNA med användning av standard-PCR förfaranden för att framställa en PCR-produkt innehållande promotorsekvenser. För att göra tillräckligt sond mallar för att stödja flera reaktioner sond syntes vi normalt inrättat 8 x 50 PCR. Reaktionerna samlas för nästa steg. Generellt ett fåtal stora volymer PCR eller flera små reaktioner (t.ex. 50 pl reaktioner vi använder) enre tillräckliga för att generera tillräckligt med mall för flera reaktioner sond syntes.
- För att ta bort kontaminerande proteiner, i synnerhet spår av RNas i plasmid beredningar, smälta varje 100 pl PCR-reaktion med 1 pl 20mg/ml proteinas K vid 55 ° C under minst 30 minuter. Alla reagenser och andra objekt som används efter detta proteinas K digestion bör RNas fri och särskilt avsedda för RNA arbete.
- Under det proteinas K-digerering, kör ett prov av PCR-reaktionen på en gel för att kontrollera integriteten av PCR-produkten. Vi använder geler akrylamid mini för att lösa mindre PCR-produkter (mindre än 600-700 bp) och agarosgeler för att lösa större PCR-produkter (> 600-700 bp) för kvalitetskontroll analys. Om du ser flera band på gelen, rekommenderar vi optimera PCR-reaktionen, så att du får en enda PCR-produkt med rätt storlek.
- Grundligt extrahera proteinas K digererade PCR-reaktion med en lika stor volym av en fenol / kloroform (1:1) Mixture, följt av en extraktion med en lika stor volym kloroform. Blanda vid varje steg genom att vortexa röret i minst 30 sekunder. Dessa steg måste utföras i ett dragskåp.
- Fälla ut renade PCR-produkten genom att tillsätta 0,1 volym 3 M natriumacetat och 2 volymer 100% etanol. Låt i -20 ° C i minst 30 minuter.
- Snurra under 5 minuter vid 13.000 rpm i en mikrocentrifug, avlägsna supernatanten och tvätta med 70% etanol. Låt DNA-pelleten torka helt.
- Resuspendera DNA i lämplig volym (t.ex. 50 jul) av 1xTE. Mät DNA-koncentrationen med användning av en fluorometer.
- Bestämma nukleotidsekvensen av varje PCR-mall prep användning av primrar som motsvarar sekvenserna fag promotor eller till en intern sekvens inuti sonden. Detta är ett kritiskt kvalitetskontroll steg som säkerställer att sonden mallen är rätt ordning.
- DNA: t är redo att tjäna som en mall för in vitro-transkriptjon. Förvara DNA-templatet vid 4 ° C.
- Designing PCR-primrar med promotor fag transkriptions-sekvenser i deras 5-ändar.
- transkription in vitro med användning av PCR-produkten som mall.
- Ställ in en RNA-transkription reaktion i en slutlig volym av 50 pl. I transkriptionsreaktionen innehåller 500 - 1000 ng templat-DNA, 5 pl 10X transkription Buffer (med 100 mM DTT), 10 pl 2,5 mM dig-NTP-blandning, 3 pl (50 ~ 90 enheter) av RNA-polymeras, 1 pl Alpha-32 P CTP (upp till 6 månader gamla) och återstoden av volymen utgörs genom att tillsätta dietylpyrokarbonat behandlat vatten. Den 2,5 mM gräva-NTP-blandning består vanligtvis som en 40μl arbetar mald innehållande 10 pl 10 mM CTP, 10 | il 10 mM GTP, 10 ^ il 10 mM ATP, 10 mM 6.5μl UTP, 3.5μl 10 mM digoxigenin-11 UTP. Vid montering av transkriptionsreaktionen, vara säker på att alla reaktionskomponenterna (förutom enzym) värmdes till rumstemperatur. Blanda DNA och vatten först, tillsätt sedan reaktionsbuffert, blanda och sedan lägga till andra komponenterannars spermidin i transkriptionen bufferten kommer att fälla DNA. Inkubera 2 timmar vid den temperatur som rekommenderas för det använda RNA-polymeraset.
Obs: α-32 P till reaktionen så att du kan bestämma hur stor andel av den ursprungliga nukleotid pool som ingår i RNA-sonden. Detta är ett viktigt mått på effektiviteten av reaktionen. Alla följande steg följer rutiner för hantering 32 s.
En alternativ metod för mätning av mängden av RNA syntetiserad prob är att använda en liten volym spektrofotometer. Detta undviker användningen av 32 P-märkning (se anteckningar i steg 1.3.1) - Under sista minuterna av inkubation förbereda Quick Spin Column (Roche) enligt tillverkarens instruktioner.
- Efter inkubation, tillsätt 1 pl RNas-fritt DNas I och inkubera vid 37 ° C under 10 minuter.
- Späd till 100 | il med 50 ^ i Reaktionsschema Spädningsbuffert (20 mM TrispH 7,5, 1% SDS, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl (RNas fri, gör en 50 ml lager och butik vid rumstemperatur)). Ta 1 pl (vanligtvis i 4 pl 1x TE) för scintillationsräkning av de totala start räknas och för gelanalys.
- Applicera resten av reaktionen på mitten av kolonnen bädden och centrifugera vid 1100 X g under 4 min i en bordsskiva klinisk centrifug. Efter utdelningen din RNA-proben är i samlingen röret.
- Tillsätt 2 volymer 100% etanol till den eluerade reaktionen. Blanda väl och hålla på is under 5 min (eller i -20 ° C eller 30 minuter).
- Snurra röret i en mikrocentrifug vid maximal rpm under 5 minuter för att pelletera RNA sonden.
- Helt ta bort supernatanten genom pipett och låt pelleten lufttorka. Låt inte pelleten under torr eftersom det kommer att bli mycket svårt att lösa det.
- Lös upp RNA-sonden med 50 pl - 100 pl 1xTE eller DEPC-H 2 O Ta en 1 ul prov för att bestämma procent inkorporering och för analys på ett Denatnder akrylamidgel. Justera probkoncentration till 100 ng / ul enligt den uppskattade avkastningen.
- Sönder som har passerat alla tre kvalitetskontroller kan sedan lagras i -20 ° C i 6 till 12 månader. Vi uttömma brukar sonden lager inom 12 månader. Det är mycket troligt att prober kan lagras under mycket längre perioder vid-20C.
- Ställ in en RNA-transkription reaktion i en slutlig volym av 50 pl. I transkriptionsreaktionen innehåller 500 - 1000 ng templat-DNA, 5 pl 10X transkription Buffer (med 100 mM DTT), 10 pl 2,5 mM dig-NTP-blandning, 3 pl (50 ~ 90 enheter) av RNA-polymeras, 1 pl Alpha-32 P CTP (upp till 6 månader gamla) och återstoden av volymen utgörs genom att tillsätta dietylpyrokarbonat behandlat vatten. Den 2,5 mM gräva-NTP-blandning består vanligtvis som en 40μl arbetar mald innehållande 10 pl 10 mM CTP, 10 | il 10 mM GTP, 10 ^ il 10 mM ATP, 10 mM 6.5μl UTP, 3.5μl 10 mM digoxigenin-11 UTP. Vid montering av transkriptionsreaktionen, vara säker på att alla reaktionskomponenterna (förutom enzym) värmdes till rumstemperatur. Blanda DNA och vatten först, tillsätt sedan reaktionsbuffert, blanda och sedan lägga till andra komponenterannars spermidin i transkriptionen bufferten kommer att fälla DNA. Inkubera 2 timmar vid den temperatur som rekommenderas för det använda RNA-polymeraset.
- Kvalitetsbedömning av riboprob - mätsonden avkastning.
- För att uppskatta sonden avkastningen, dela räkningarna återhämtat sig efter spinnkolonn av räkningarna i reaktionen innan spinnkolonn (mätt med de prover som tagits i sonden syntesprotokollet). För denna reaktion, 100% införlivande = 33 pg. En framgångsrik reaktion ger vanligtvis en 15-50% utbyte. Sonder med mindre än 15% inkorporering (<5 mikrogram avkastning) bör inte användas.
Obs: En alternativ metod för mätning av sond avkastning är att använda en liten volym spektrofotometer eller fluorometeratt direkt mäta mängden RNA närvarande efter spinn kolonnkromatografi. Detta alternativa tillvägagångssätt undviker användningen av 32 P-spår märkning. Vi har mätt riboprob koncentration med en Biotek Epoch Microplate spektrofotometer. En jämförelse av de värden som erhållits från spektrofotometern till beräkningarna av riboprob massa från 32 P-inkorporering visade att de två metoderna ger jämförbara resultat med en liknande liten volym (2 pl) prov från den slutliga beredningen sonden.
Nästan alltid en mycket låg eller ingen avkastning beror på RNas förorening härrör från plasmiden preparatet användes som mall för PCR. Var noga med att behandla din plasmid-DNA och PCR-produkt med proteinas K som beskrivs i steg 1.1.3.
- För att uppskatta sonden avkastningen, dela räkningarna återhämtat sig efter spinnkolonn av räkningarna i reaktionen innan spinnkolonn (mätt med de prover som tagits i sonden syntesprotokollet). För denna reaktion, 100% införlivande = 33 pg. En framgångsrik reaktion ger vanligtvis en 15-50% utbyte. Sonder med mindre än 15% inkorporering (<5 mikrogram avkastning) bör inte användas.
- Kvalitetsbedömning av riboprob - mätning specifik aktivitet.
- För att mäta graden av digoxigenin - UTP inkorporering utföra ett spot test. Detta är en crufinansiella kvalitetskontroll test.
Justera probkoncentration till 100 ng / | il. Spot 1 pl av serieutspädningar (10 -2 till 10 -5) av sonden på en 82mm diameter av Hybond-N + (GE Healthcare) eller annan motsvarande nylonfilter. Inkludera en omärkt DNA-prov som en negativ kontroll. Tvärbinda den fuktiga filtret omedelbart i en UV-tvärbindare på 125mJoules eller enligt tillverkarens instruktioner för nylonfiltret du använder.
Alla följande steg (1.4.2 - 1.4.6) utförs i en petriskål på en gungande plattform vid rumstemperatur. Du behöver inte oroa dig för RNas efter observation sonden spädningar på filtret - Blockera filtret under 30 minuter vid rumstemperatur i 10 ml 1% blockeringsreagens (Roche) i 1X TN (10X TN-buffert = 1 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl)
- Tvätta 1 X 15 min i 10 ml 1X TN-buffert.
- Inkubera med anti digoxigenin-Fab-fragment vid 1/5000 utspädning i 1X TN-buffert under 30 minuter. </ Li>
- Tvätta 2 X 15 min i 10 ml 1X TN-buffert.
- Färgreaktionen utförs med BM lila substrat (behöver om 5 ml i skålen). Färg ska vara synlig på plats från 10 -4 utspädning i 30 minuter. Vid denna punkt, stoppa färgreaktionen genom tvättning 2 gånger under 5 minuter vardera med 5X TE. Om signalen inte är synlig i stället som motsvarar 10 -4 utspädning då sonden ska kasseras.
Obs: Enligt vår erfarenhet är otillräcklig specifik aktivitet bara finns med korta sönder. Öka storleken på sondens mallen (upp till 1 kb) samtidigt som de övriga designen kriterier som anges i detta protokoll bör öka den specifika aktiviteten av sonden. Låg specifik aktivitet leder till låga eller ej detekterbara nivåer av signalen.
- För att mäta graden av digoxigenin - UTP inkorporering utföra ett spot test. Detta är en crufinansiella kvalitetskontroll test.
- Testa integriteten av sonden genom elektrofores genom en 5% denaturerande akrylamidgel.
Detta är en annan viktig kvalitetskontroll analys.Detta protokoll förutsätter att proben har märkts med 32 P under syntesreaktionen (se steg 1.2.1). Vi använder denaturerande akrylamidgeler för att ge mycket hög upplösning, tillåter oss att enkelt upptäcka skadade eller ofullständiga sonder. Typiskt en 5% denaturerande akrylamid minigel (7,5 g urea, 1,9 ml 40% akrylamid, 1,9 ml 2% bis-akrylamid (eller använd en 20:1 akrylamid: bis-akrylamid lösningar), 1,5 ml 10X MOPS gelbuffert (0,2 M morfolinopropansulfonsyra syra, pH 7,0, 50 mM natriumacetat 5 mM EDTA) och H 2 O till en slutlig volym av 15 ml) fungerar mycket bra för att lösa prober i storlek varierar används i detta protokoll.
Obs: Som ett alternativ kan TBE-urea förgjutna geler köpas från olika leverantörer. Följ tillverkarens instruktioner för att köra prefabricerade geler.- Blanda provet med en lika stor volym av gelladdningsbuffert (Ambion) och blanda väl.
- Värm till 95 ° C under 5 minuter för att denaturera eventuella sekundära struktur.
- Omedelbart svalna på is innan de laddas på gelen för att förhindra nytt glödgning.
- Kör före och efter kolonnen proverna tillsammans vid 200V tills den blå färgen går till slutet av gelén. Gelén körs i 1X MOPS gelbuffert.
- Linda gelen i plastfolie och utsätta den för röntgenfilm eller fosfor imager skärm för att upptäcka radioaktivt märkt RNA. Om 32 P-märkning inte används kan färga gelén med en konventionell fluorescerande färgämne för att detektera RNA
- En lyckad sond syntes kommer att resultera i en RNA-prober som migrerar som ett skarpt band mycket nära toppen av gelén.
2. Insamling och lagring av musembryon
- Musembryon ska samlas i iskall PBST (PBS + 0,1% Tween 20, (dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlat)) och hölls på is under dissektion.
- Embryona behandlas i 4 utjämnade ml skruv glasflaskor. Flera embryon kan fixeras i en injektionsflaska. Så många som 10 till 15 E9.5eller 5 E10.5 embryon kan fixeras i en injektionsflaska. På grund av den ökande storleken av embryot bör E11.5 embryon hemisected med ett rakblad före fixering för att underlätta tillträde sond under hybridiseringssteget. Upp till 3 hemisected E11.5 embryon kan placeras i en injektionsflaska.
- För att maximera effektiviteten av stegen i detta protokoll och för att minska skador på embryon embryo fixering och alla tvättar utförs i provflaskor med lösningar fyllda till den lägre nivån i flaskan halsen så att endast en liten luftbubbla kvar, om inte annat anges. För alla tvättningssteg ampullerna fastställs på sin sida på en vipp-plattform.
- Fix i 6 timmar till över natten vid 4 ° C på en gungande bord med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBST. Injektionsflaskorna ska placeras horisontellt och gungade på en rocker plattform vid 4 ° C.
- Efter fixering, är embryon tvättas två gånger under 5 minuter vardera i PBST på is och därefter dehydratiseras stegvis genom en metaNol / PBST serie (25% metanol i PBST, 50% metanol i PBST och 75% metanol i PBST) i 100% metanol genom att ersätta lösningar i injektionsflaskan med glas Pasteur-pipetter. Embryon kan lagras vid-20C i 100% metanol under 8 månader och kanske längre.
3. Hybridisering av digoxigenin märkt prob till hela musembryon
- Punktering hjärtan och cheferna för E10.5 och äldre embryon med en mikrodissektion kniv medan embryona fortfarande i metanol (om detta inte gjordes under dissektionen). Denna enkla steg gör att tvättlösningar att ange hjärnan blåsor och kamrarna hjärta vilket avsevärt minskar bakgrundsfärgning.
- Rehydrera embryona genom successiva tvättar i en metanol / PBST serie (75% metanol i PBST, 50% metanol i PBST och därefter 25% metanol i PBST) under 5-10 minuter vid varje koncentration metanol. Tvätta två gånger under 5 minuter varje tvätt i 100% PBST.
- Inkubera i 4:1 PBST: 30% H 2 O 2under 1 timme på is. Tvätta sedan med 3 byten 5 minuter vardera i 1X PBST.
- Avlägsna de sista PBST tvätta och ersätt med 1 ml 10 pg / ml proteinas K i PBST. Under proteinas K-spjälkning plats rören vertikalt i ett ställ i en 25 ° C vattenbad.
Obs: Lösningar av proteinas K förlorar aktivitet över tiden på grund av själv-spjälkning. För att säkerställa maximal och konsekvent aktivitet proteinas K lösningen måste göras färska omedelbart före varje användning. För varje användning att göra en liten mängd av en 1mg/ml bestånd sedan späda ut det. Inkubationstiden bör bestämmas för varje parti av proteinas K och pulver för varje embryo ålder. Till exempel, för E9.5 embryon en god tid är vanligen 10-15 min vid 25 ° C medan för E10.5 är vanligen 20-30 min vid 25 ° C. Den proteinas K inkubationstiden bör också mätas exakt under experiment för att möjliggöra giltiga jämförelser mellan flaskor och mellan experiment. Temperaturen bör noggrant bibehållas under uppslutning att ökareproducerbarhet. Så små som 1 ° C kan ändra mängden matsmältningen mellan experiment. Det rekommenderas starkt att proteinas K digereringar utföras i en inkubator eller ett vattenbad för exakt temperaturreglering. Detta steg är kritiskt för att tillåta proben att penetrera vävnaden därigenom alstra stark signal. Dock kommer över matsmältning skada embryon och de kommer successivt upplösas under loppet av de återstående stegen. - Stoppa matsmältningen proteinas K genom tvättning två gånger i 5 minuter varje tvätt vid rumstemperatur med nybakade 2 mg / ml glycin i PBST. Tvätta sedan två gånger under 5 minuter vardera i PBST.
- Fäst digererade embryon för 20 minuter vid rumstemperatur i 4% PFA / PBST, 0,2% glutaraldehyd (Polysciences). Inte över-eller underfix. Tvätta 3 gånger under 5 minuter vardera i PBST.
- Vid denna punkt bör embryon delas in i grupper för hybridisering. Avlägsna PBST. Tillsätt 1 buffert ml hybridisering (50% ULTrapure formamid (Invitrogen), 5x SSC, pH 5, 1% SDS, 50 pg / ml heparin (Acros), 50 pg / ml Torula-RNA (Sigma)) som har värmts till 65 ° C (utan givare). Låt embryon att lösa och ta sedan bort allt hybrization buffert och ersätt med 1 ml färsk uppvärmda hybridiseringsbuffert utan prob.
- Prehybridize under 1 timme vid 65 ° C i ett skakande vattenbad eller i en ugn på en gungande plattform (t.ex. Boekle Shake 'n' Bake Ugn, se tabell 1). Om du inkubera injektionsflaskorna i ett vattenbad vara säker vatten kommer upp till, men inte över, toppar flaskorna. Det hybridiseringstemperaturen kan ökas upp till 70 ° C. Hybridiserings temperaturer över 65 ° C inte påverkar signalintensitet eller bakgrund med de flesta sonder vi har testat. Embryona blir genomskinlig, klibbiga, och bräcklig i formamid buffertar (t.ex. hybridiseringsbuffert) vara försiktig när du hanterar dem.
- Ersätt förhybridiseringsbufferten med 0,4 ml hybridiseringsbuffert innehållande sond vid enkoncentration av 0,25-1 pg / ml. Använd 0,5 pg / ml sond för embryon upp till ca E8.5. För äldre embryon, bör prober titreras 1 till 0,1 ng / ml för att bestämma den optimala koncentrationen för en bra signal med låg bakgrund (vanligen 0,25-0,5 pg / ml eller så). Tänk på att större hybridisering volymer kan vara nödvändig för de större embryon. Hybridiserar över natten vid 65 ° C.
- Om embryona har över behandlats med proteinas K. de visas väldigt transparent. De kan också fastna på sidorna av flaskan eller falla sönder. Embryon som visas på detta sätt ska kasseras vid denna punkt i protokollet. Bearbeta dem vidare inte kommer att resultera i tolkningsbara data.
- Ersätt hybridiseringsbuffert med uppvärmd lösning I (50% formamid, 5x SSC pH 5, 1% SDS) vid 70 ° C. Tvätta två gånger under 30 minuter varje tvätt för E8.5 embryon, tre gånger för 30 minuter per tvätt för E9.5 och äldre.
- Tvätta en gång med förvärmd 50% Lösning I: 50% Lösning II (0,5M NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 0,1% Tween 20) vid 70 ° C under 10 minuter.
- Tvätta tre gånger under 5 minuter per tvätt med lösning II vid rumstemperatur.
- Ersätt buffert med lösning II innehållande RNas A 100 pg / ml, RNas T1 100 enheter / ml. Inkubera på en rocker i det varma rummet vid 37 ° C två gånger 30 minuter per tvätt. Den RNas tvätten är avgörande för att minska bakgrunden berodde ospecifikt hybridiserade prober.
- Tvätta i lösning III (50% formamid, 2x SSC pH 5) vid 65 ° C två gånger under 30 minuter varje tvätt för E8.5, 3 gånger i 30 minuter per tvätt för E9.5 och äldre.
- Tvätta 3 gånger under 5 minuter per tvätt med 1X TBST (100 ml 10X TBS innehåller 8g NaCl, 0,2 g KCl, 12,5 ml 2M Tris HCl pH 7,6 i vatten. För att göra 1X TBST späda 10X TBS i en lämplig mängd vatten och lägg Tween 20 till 0,1% slutlig koncentration)
- Såvida inget är alla tvättar utförs i provflaskor med lösningar fyllda till den lägre nivån avinjektionsflaska hals. För alla tvättsteg är flaskor fastställs på sin sida på en rocker plattform.
4. Antikropp detektering av digoxigenin märkta proben
- Embryon är redan blockerad i 0,5 ml 1X TBST behandlad + 10% värme fårserum. Sedan rocka flaskorna vertikalt vid rumstemperatur (~ 20 ° C) under minst 2,5 timmar.
- Ersätt den blockerande lösningen med färsk 1X TBST + 10% serum innehållande en 1:2000 - 1:5000 utspädning av alkaliskt fosfatas-konjugerade får-anti-digoxigenin Fab-fragment (subtraheras genom inkubering med embryon aceton pulver, se nedan). Använd högre spädningar för E9.5 och äldre embryon, upp till 1:5000 för att minimera bakgrunden. Inkubera vertikalt på vipparmen vid 4 ° C över natten.
Obs: Vi har funnit att inkubation av anti-digoxigenin Fab-fragment med ett embryo aceton pulver minskar nivåerna av bakgrundsfärgning i detta protokoll. För att förbereda embryot acetonpulver homogenisera samman E12.5-14,5 mus EMBRyos i en minimal volym av PBS. Lägg 4 volymer iskall aceton, blanda och inkubera på is under 30 minuter. Avlägsna supernatanten genom centrifugering vid 10.000 x g under 10 minuter. Tvätta pelleten med iskall aceton och snurra igen. Sprid ut pelleten och mala till pulver på ett ark av filterpapper och låt det lufttorka. Pulvret kan sedan lagras i en lufttät rör vid 4 ° C för år.
För antikroppen subtraktion, bör antikroppen förabsorberades till embryot aceton pulvret för att minska ospecifik bindning under eller före för-blockering. Inkubera antikropp vid 1/100 med en liten mängd embryon pulver (mängden är inte kritisk) i 1xTBST/10% serum under minst 1 timme vid 4 ° C med skakning. Avlägsna pulver genom spinning i en mikrocentrifug under 10 minuter vid 4 ° C. Subtraheras antikropp kan förvaras vid 4 ° C under minst 6 månader. - Tvätta tre gånger 5 minuter vardera med TBST 1X, sedan 5-6 gånger för 1 timme vardera vid rumstemperatur för att avlägsna överskott av antikropp. Om pavses, gör en utökad natten tvätt vid 4 ° C för att minska bakgrunden. Den natten tvätt kan dramatiskt minska bakgrundsnivåerna därigenom öka signalbrusförhållandet.
- Tvätta två gånger under 20 minuter per tvätt med nyligen gjorda alkaliskt fosfatas-buffert (100 mM Tris, 9,5 pH, 50 mM MgClj 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20. Lägg 0.5mg/ml levamisol, en endogen AP-inhibitor, för E9.5 och äldre embryon).
- Ersätt sista tvättningen med BM Lila AP substrat (Roche) förvärmdes till rumstemperatur.
- Låt färgen reaktionen inkubera vid rumstemperatur, och titta på signalen periodiskt via ett dissektionsmikroskop. För längre färgreaktioner (flera timmar till över natten) injektionsflaskorna ska avskärmas från ljus. Signal för rikliga mRNA ska vara synliga inom 15 minuter. Reaktioner bör stoppas när du är nöjd med signalen, eller när bakgrunden börjar bli ett problem. Om lösningen själv börjar bli mörk kan du förlänga color reaktion genom att ersätta substratlösningen.
- Stoppa reaktionen genom tvättning två gånger under 5 minuter per tvätt i 1 x PBST/5mM EDTA.
- Överföring till 4% paraformaldehyd / PBST att åter fixa, från flera timmar till över natten. Eller embryon kan lagras i 4% paraformaldehyde/1X PBST under år eller kan omedelbart behandlas för sektionering. Denna sista fixering steg är avgörande för långsiktigt bevarande av färgningsmönstret.
5. Paraffin inbäddning och snittning av fläckade embryon
- Innan embryona fast efter färgreaktionen (steg 4,8) bilder på hela montera färgade embryon tas när färgningen nivån är på önskad intensitet. Efter att ha dokumenterat uttrycksmönstren i hela embryon de inkuberas i BM lila substratet natten till 24 timmar vid rumstemperatur tills hela embryot blir mörkblå. Detta steg är att se till att färgningen kommer att vara tillräckligt mörkt för att visa upp i the vävnadssnitt. Observera att den blå färgen av embryot beror på avsättning av ett mycket tunt skikt av pigment i hela embryot yta. Denna bakgrundsfärgning kommer inte upptäckas i vävnaden av intresse efter snittning.
- Tvätta de färgade embryon med PBS tre gånger för att avlägsna överskottet substratet fällningarna och fixera natten i 4% PFA vid 4 ° C.
- Tvätta med PBS tre gånger, och sedan dehydrera embryona i 100% metanol (såsom beskrivits i 2,4).
- Ersätt sista metanol med xylen. Tvätta i xylen 2 till 3 gånger under 2 minuter varje tvätt tills embryona blir klar. Inte över tvätta i xylen eftersom det kommer att göra vävnaden mycket skör efter att det inbyggda vilket gör det mycket svårt att återhämta intakta delar. Visuellt övervaka varje xylen inkubation för att försäkra embryon är bara till den grad att vara tydliga och vara mycket noga med att inte låta xylen inkubationen att sträcka sig bortom denna punkt.
- Överför embryon (E10.5 och äldre) Till Biopsi Sure-Tek kassetter (Fisherbrand), och inkubera hela kassetten i vax (Fisherbrand) under 15 ~ 30 minuter vid 65 ° C. Förändring i färskt vax för en annan 15 ~ 30min och sedan ändra igen. Mindre embryon / trunkar vävnad kräver kortare vax inkubation. E9.5 embryon kan placeras i formarna vävnad inbäddning för alla vax förändringar. I de fall du kan ta bort vaxet ur formen i stället för att överföra embryon.
- Efter tre vax förändringar, embryon överföring till formarna vävnad inbäddning (Polysciences) och bädda med färsk vax. Försiktigt placera embryon för önskad plan sektionering. Låt vaxet svalna tills stelnat.
- Avsnitt vax block till 8 ~ 14μm skivor med vanliga mikrotom (t.ex. Leica RM2155). Samla delar till mikroskopglas (Fisherbrand).
- Låt bilderna låg platt och torr på en slidewarmer. Objektglasen kan lagras vid 4 ° C för månader.
- Torkade sektioner avvaxades av två 5 minuter xylene tvättar och rehydratiserades i vatten genom seriella metanol / vatten tvättar (100% metanol 2 minuter, 100% metanol 2 minuter, 90% metanol / vatten 2min 70% metanol / vatten 2min, avjoniserat vatten 5 min).
- Stain sektionerna med nukleär Fast Red (Sigma) färgning lösning under 1 minut. För att generera den nukleära snabb röda färglösning, späd en koncentrerad förrådslösning av nukleär Fast Red (0,1% nukleär snabb röd i 5% aluminiumsulfat i vatten, löses med värme och filtrera genom Whatman filterpapper) 01:05 i en vattenhaltig lösning av 5 % aluminiumsulfat. Efter färgning tvätta objektglasen med rinnande vatten tills vattnet blir klart. De nukleära Fast Red fungerar som en motfärg och avslöjar övergripande vävnadsstruktur i avsnitten. Dess färg kontrasterar väl med den lila-blå färgning som markerar lokaliseringen av RNA-sonden. Nukleär Fast Red är en mättande fläck och färgningsintensitet styrs av koncentrationen av färglösningen. Om intensiteten av den nukleära snabb röd färgningär otillräcklig när du använder färgning lösning du kan upprepa detta steg med en mer koncentrerad nukleär Fast Red lösning.
- Förbered bilderna för montering täckglas av tvättar i varje lösningar i följande serier: 90% metanol / vatten följt av 2 tvättar i 100% metanol följt av 2 tvättar i xylener. Inkubera objektglaset under 2 minuter i varje tvättar.
- Montera bilder med Cytoseal 60 monteringsmedium (Richard-Allan Scientific). Observera att vattenbaserade montering medier löser den nukleära snabb röd fläck.
Obs: vi har också använt en plast inbäddning harts (Immuno-säng, Polysciences Inc.) för att generera delar av färgade embryon med utmärkt resultat 4.
6. Representativa resultat:
Figur 1 visar representativa resultat som erhållits med detta protokoll. Figur 1A visar uttrycksmönstret av Gata3 i E10.5 musembryon. Denna panel visar en god result med en hög signal till bakgrundsförhållande. Figur 1C, däremot, visar en misslyckad in situ hybridisering för Gata3 mRNA som använde en partiellt nedbruten RNA-prob. En låg specifik aktivitet prob kommer att resultera i liknande resultat med låg signal till bakgrund kontrast. En jämförelse av paneler A och C illustrerar betydelsen att utföra noggranna bedömningar kvalitetskontroll av sond kvalitet för att säkerställa hög kvalitet. Det erhållna resultatet med Foxg1 sonden (Figur 1B) visar också ett bra resultat med specifik färgning i telencefalon med låg bakgrund i andra delar av hjärnan. Hjärnan och hjärtat är vanliga platser för bakgrundsfärgning som orsakats av sond svällning. Punktering av hjärnan och hjärtat med pincett kan tvättlösningar i embryot och minimerar bakgrundsfärgning (se steg 3,1). Figur 1D illustrerar den typiska ljusblå bakgrund fann när hjärnan inte punkteras. Detta visar en suboptimal resultatet med en Pax1 sond. Pax1 uttrycks inte i någon del av hjärnan och hela färgning ses i hjärnan av detta embryo beror på icke-specifik bakgrund.
Figur 1. Representativa resultat som visar exempel på lyckade (A, B) och suboptimal (C, D) resultat. A. E10.5 embryo hybridiserade med Gata3 sond. B. E11.5 embryo hybridiserade med Foxg1 sond. C. E10. 5 embryo hybridiserade med Gata3 sond som är delvis försämrad, visar mycket svag signal, men hög bakgrund genom hela embryot. D. E10.5 embryo hybridiserade med Pax1 sond utan punktera huvudet, som visar bakgrundsfärgning i ventriklarna (pilhuvuden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs i detta protokoll har anpassats från ett antal olika källor och optimerad för hela montering E8.5-E11.5 dygn gamla musembryon. Metoder för hela montera in situ hybridisering av ryggradsdjur embryon visades först i början av 1990-talet 2,5-12. Detta protokoll anpassades främst från metoder som utvecklats för Xenopus embryon 7,8 samt mus 2,11. I vår protokoll stor vikt läggs på noggrann kvalitetsbedömning av sonden. Noggrann uppmärksamhet att generera en hög kvalitet och höga specifika RNA aktivitet sond som bestäms av de tidigaste stegen i detta protokoll kommer att öka kvaliteten på data och spara avsevärd tid och ansträngning i det långa loppet. Vår protokoll innefattar också användningen av PCR alstrade DNA-mallar för fag-RNA-polymeras-transkription. Detta tillvägagångssätt är en snabb och mycket skalbar. Den kan möjliggöra genereringen av ett stort antal RNA-prober för stor skala i situ hybridisering skärmar 13-15.
Flera steg i detta protokoll bör övervägas när bakgrunden är hög, men signalen är låg. Ett övervägande är sonden. Vi har aldrig haft hög bakgrund med RNA-sonder som uppfyllde designen kriterier som anges i detta protokoll och som hade klarat alla tre tester kvalitetskontroll (utbyte, specifik aktivitet och sond längd). En annan faktor som kan påverka bakgrundsnivåerna är förmågan hos sonden att tränga in i de embryonala vävnaderna. Man måste vara försiktig vid dissektionen att helt ta bort extraembryonic membran som täcker embryot. Dessutom är proteinas K-spjälkning steg absolut nödvändigt för embryon äldre än E9.5. Längre proteinas K digestionstid ger lägre bakgrund och starkare signal, men kan alltför digestionstid leda till ökad vävnadsskada och kan resultera i sönderfall av embryot under förfarandet. Optimizatjon av koktiden för varje parti proteinas K krävs för att uppnå bästa resultat. Ett annat steg som kan optimeras för att erhålla hög signal till bakgrund förhållanden är RNas inkubationen (steg 3,14). Vår protokollet använder en blandning av RNas A och RNas T1. Båda enzymerna smälta enstaka RNA men varje enzym har en annan bas specificitet. Kombinationen av de två enzymer resulterar i omfattande nedbrytning av enstaka RNA till små oligoribonukleotider. Detta möjliggör det mesta av icke-specifikt hybridiserade proben tas bort genom efter hybridisering tvättar resulterar i en stor minskning i bakgrundsfärgning. Användning av RNas A eller T1 enbart resultat i ökad bakgrunden och bör undvikas. Vi har också funnit att kvaliteten på den slutliga färgen reaktionen förbättras genom att använda färsk AP-buffert, gjord omedelbart före användning.
Vår protokoll kan anpassas för äldre embryon eller vuxna vävnader med ytterligare bearbetning. Till exempel har vi ocksåanvänds detta protokoll för att utföra in situ hybridisering på tjocka (100 nm) vibratome delar av vuxen mus hjärna (data visas inte). Vi har också använt detta protokoll för att studera genuttryck i äldre embryon. I vissa fall har använt detta protokoll för att visualisera genuttryck på ytan av E13.5 och E14.5 embryon, såsom Gad1 uttryck i hårsäckarna i vibrissae 4. I andra fall har vi använt ett rakblad eller skalpell för att skära E12.5-E14.5 embryon för att ge prob tillgång till specifika vävnader i embryot. Embryo fragment framställda på detta sätt kan bearbetas med detta protokoll med vissa modifikationer. I dessa fall längden på alla behandlingar och tvättningssteg behöver justeras efter vävnads storlek och optimeras empiriskt.
Vår protokoll innehåller också metoder för efter hybridisering sektionering och analys av uttryck mönster. Kombinerat med hela berget visualisering av genuttryck detta ytterligarenella steg kan lägga en hel del ytterligare information om uttrycksmönstret av en gen. Vi har bäddat embryon efter att ha genomgått in situ hybridisering i paraffin samt plast harts 4,16. Sektioner av färgade embryon kan användas för att generera en tredimensionell rekonstruktion av uttrycksmönstret avslöjas genom hela fästet hybridisering in situ förfarande. Vi har använt rekonstruktion programvara från SURFdriver programvara för detta ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R21MH082360 (BGC) och R01HD056315 (NRM) samt University of Georgia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Reagent | Roche Group | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche Group | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche Group | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | PerkinElmer, Inc. | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche Group | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher Scientific | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene, Agilent Technologies | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros Organics | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences, Inc. | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche Group | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche Group | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche Group | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma-Aldrich | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche Group | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National Scientific Company | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisher Scientific | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences, Inc. | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisher Scientific | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma-Aldrich | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
- Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
- Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
- Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
- Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
- Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
- Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
- Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
- Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).
