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Biology

Tutto il monte In Situ di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/2797
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics, University of Georgia

Summary

Questo monte tutto

Abstract

Montare tutto ibridazione in situ è un approccio molto informativo per la definizione di schemi di espressione genica negli embrioni. Le procedure di ibridazione in situ sono lunghi e tecnicamente impegnativo, con passi più importanti che insieme contribuiscono alla qualità del risultato finale. Questo protocollo descrive in dettaglio alcuni punti chiave del controllo della qualità per l'etichettatura sonda l'ottimizzazione e le prestazioni. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei passi fondamentali necessari per ottenere risultati di alta qualità riproducibile. In primo luogo, si descrive la generazione di digossigenina (DIG) sonde marcate nella trascrizione dell'RNA tramite modelli in vitro di DNA generati mediante PCR. Ci descrivono tre saggi critici di controllo di qualità per determinare la quantità, l'integrità e l'attività specifica del DIG-sonde marcate. Questi passaggi sono importanti per la generazione di una sonda di sensibilità sufficiente per rilevare mRNA endogeni in un embrione di topo intero. Inoltre, si descrivono i metodi per la fissazione e lo stoccaggio di E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita per l'ibridazione in situ. Poi, si descrive metodi dettagliati di limitata digestione proteinasi K degli embrioni reidratati seguita da i dettagli delle condizioni di ibridazione, di post-ibridazione lavaggi e trattamenti per eliminare RNAsi non specifici ibridazione sonda. AP-coniugato anticorpale è utilizzato per visualizzare le sonda marcata e rivelare il pattern di espressione del trascritto endogena. Risultati rappresentativi sono riportati da esperimenti di successo e tipici esperimenti non ottimale.

Protocol

1. Generazione Riboprobe via di trascrizione in vitro

  1. Della preparazione dei prodotti PCR per la trascrizione nei modelli in vitro.
    1. Progettare primer PCR con sequenze di trascrizione promotore dei fagi nelle loro estremità 5 '.
      Nota: La sequenza promotore aggiunto 5'end del senso filamento di PCR saranno utilizzati per la trascrizione della sonda senso, e la sequenza promotore aggiunto 5'end del primer antisenso PCR sarà utilizzata per sintetizzare il senso anti-sonda 1-3. Non abbiamo rilevato alcuna differenza in termini di efficienza di trascrizione tra i modelli che contengono solo le sequenze promotore nucleo vs modelli che contengono il promotore core plus supplementari di 5 'sequenze. Questo metodo è stato utilizzato con il T3, T7 e SP6 promotori dei fagi.
      Sequenze che sono altamente conservati tra i membri della famiglia di geni o le sequenze altamente ripetitive dovrebbero essere evitati in quanto possono portare a non specifici di ibridazione e di conseguenza aumentare la colorazione di fondo. Sonde ad alto contenuto di GC hanno limitato digossigenina rUTP incorporazione modello e sequenze di DNA con corse di residui T limiterà l'incorporazione di dig-UTP a causa di interferenza sterica tra le molecole digossigenina. La lunghezza della sonda può variare da 300bp a 1kb. Ma finché i suddetti criteri sono rispettati, le sonde di solito hanno una maggiore attività più specifiche.
    2. Il modello per la PCR può essere un clone plasmide, clone genomico o DNA genomico. Di solito acquistiamo full-length dei cloni EST (ad esempio da ATCC o Apri Biosystems) da utilizzare come modelli PCR. Amplificazione del DNA stampo utilizzando le normali procedure di PCR per la produzione di un prodotto di PCR contenente le sequenze promotore. Per rendere i modelli della sonda abbastanza per sostenere diverse reazioni di sintesi sonda che tipicamente creato 8 x 50μl PCR. Le reazioni sono aggregate per il passo successivo. In generale un paio di PCR grande volume o reazioni più piccole (come le reazioni 50μl usiamo) sono sufficienti per generare modelli abbastanza diversi per le reazioni di sintesi della sonda.
    3. Per rimuovere le proteine ​​contaminanti, soprattutto le tracce di RNasi nei preparati plasmide, digerire ogni 100μl di reazione PCR con 1ml di 20mg/ml proteinasi K a 55 ° C per almeno 30 minuti. Tutti i reagenti e altri oggetti utilizzati dopo questa digestione proteinasi K deve essere RNAsi libero e specificamente dedicato per il lavoro RNA.
    4. Durante la digestione proteinasi K, eseguire un campione della reazione PCR su un gel per controllare l'integrità del prodotto della PCR. Utilizziamo mini gel di acrilamide per risolvere i piccoli prodotti di PCR (meno di 600-700 pb) e gel agarosio per risolvere i grandi prodotti di PCR (> 600-700 bp) per l'analisi di controllo qualità. Se vedete più bande sul gel, si consiglia di ottimizzare la reazione di PCR in modo da ottenere un unico prodotto di PCR di dimensioni corrette.
    5. Estrarre completamente il K Proteinase digerito la reazione di PCR con un volume pari di un fenolo / cloroformio (1:1) miscela, seguita da una estrazione con un volume uguale di cloroformio. Mescolare ad ogni passo vortexando il tubo per almeno 30 secondi. Questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa.
    6. Precipitare il prodotto di PCR purificato con l'aggiunta di 0,1 volumi di acetato di sodio 3M e 2 volumi di etanolo 100%. Lasciare a -20 ° C per almeno 30 minuti.
    7. Spin per 5 minuti a 13.000 rpm in una microcentrifuga, rimuovere il surnatante e lavare con etanolo al 70%. Lasciare che il pellet di DNA si asciughi completamente.
    8. Risospendere DNA in volume adeguato (ad esempio 50μl) di 1xTE. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro.
    9. Determinare la sequenza nucleotidica della preparazione di ogni modello di PCR utilizzando primers corrispondenti alle sequenze promotore del fago o ad una sequenza interna all'interno della sonda. Questo è un passo fondamentale il controllo della qualità che assicura che il modello di sonda è la sequenza corretta.
    10. Il DNA è pronto a servire come modello per la trascrizione in vitro. Conservare il modello di DNA a 4 ° C.
  2. trascrizione in vitro utilizzando il prodotto di PCR come modello.
    1. Impostare la reazione di trascrizione dell'RNA in un volume finale di 50μl. La reazione di trascrizione comprende 500 - 1000 ng di DNA stampo, 5μl Trascrizione di tampone 10X (con DTT 100mM), 10μl 2.5MM scavare NTP-mix, 3μl (50 ~ 90 unità) di RNA polimerasi, 1ml Alpha-32 P CTP (fino a 6 mesi di età) e il resto del volume è costituita con l'aggiunta di acqua diethylpyrocarbonate trattata. Il 2,5 dig-NTP mix è tipicamente costituito da un magazzino 40μl di lavoro contenente 10mM CTP 10μl, 10μl 10 mM GTP, 10μl 10mM ATP, UTP 6.5μl 10mM, 10mM 3.5μl digossigenina-11 UTP. Per il montaggio della reazione di trascrizione, assicurarsi che tutti i componenti della reazione (ad eccezione per l'enzima) sono portata a temperatura ambiente. Mescolare il DNA e l'acqua, poi aggiungere il tampone di reazione, mescolare e aggiungere gli altri componentialtrimenti il ​​spermidine nel buffer di trascrizione sarà precipitare il DNA. Incubare per 2 ore alla temperatura consigliata per l'RNA polimerasi utilizzata.
      Nota: l'α-32 P è aggiunto alla reazione per consentire di determinare la percentuale della piscina di partenza nucleotide che è incorporato nella sonda RNA. Si tratta di una misura importante l'efficienza della reazione. Tutti i passaggi seguenti seguire le procedure per la gestione di 32 pag
      Un metodo alternativo per misurare la quantità di sonda RNA sintetizzato è quello di utilizzare uno spettrofotometro piccolo volume. Questo evita l'uso di 32 etichette P (vedi note al punto 1.3.1)
    2. Negli ultimi minuti di incubazione, preparare la Colonna rapida Spin (Roche) secondo le istruzioni del produttore.
    3. Dopo l'incubazione, aggiungere 1ml di DNasi I RNasi libero e incubare a 37 ° C per 10 min.
    4. Diluire a 100μl con 50μl di tampone di diluizione di reazione (20 mM Tris pH7.5, 1% SDS, 20 mM EDTA, 100mM NaCl (RNasi libero, fare una 50ml fotografici e conservare a temperatura ambiente)). Prendere 1ml (di solito in 4μl di 1x TE) per scintillazione conteggio dei conti totale di partenza e per l'analisi del gel.
    5. Applicare il resto della reazione sul centro del letto della colonna e far girare a 1100 X g per 4 minuti in una centrifuga da tavolo clinica. A seguito del conferimento la sonda RNA è nel tubo di raccolta.
    6. Aggiungere 2 volumi di etanolo 100% in reazione eluiti. Mescolare bene e tenere in ghiaccio per 5 min (o -20 ° C o 30 min).
    7. Rotazione del tubo in una microcentrifuga a giri massimo per 5 minuti per far sedimentare la sonda RNA.
    8. Rimuovere completamente il surnatante tramite pipetta e lasciare che il pellet di aria secca. Non lasciate che il pellet troppo secco perché sarà molto difficile scioglierlo.
    9. Sciogliere la sonda RNA con 50 microlitri - 1xTE 100 ul o DEPC-H 2 O. Prendere un campione di 1 ml per determinare l'incorporazione per cento e per l'analisi su un gel di acrilammide denaturante. Regolare la concentrazione della sonda a 100 ng / mL in base al rendimento stimato.
    10. Sonde che hanno superato tutti i controlli di qualità e tre possono essere poi conservati in -20 ° C per 6 a 12 mesi. Di solito scarico stock sonda entro 12 mesi. E 'molto probabile che le sonde possono essere conservati per periodi molto estesi a-20C.
  3. Valutazione della qualità del riboprobe - resa sonda di misura.
    1. Per stimare il rendimento della sonda, dividere i conteggi recuperato dopo la colonna rotazione dai conti nella reazione prima della Spin Column (misurata con i campioni prelevati nel protocollo sintesi sonda). Per questa reazione, 100 incorporazione% = 33 mcg. Una reazione di successo di solito dà un rendimento 15-50%. Sonde con meno del 15% incorporazione (<5 mg di rendimento) non dovrebbe essere usato.
      Nota: Un metodo alternativo per misurare la resa della sonda è quella di utilizzare uno spettrofotometro piccolo volume o fluorimetro di misurare direttamente la quantità di RNA presente dopo cromatografia su colonna. Questo approccio alternativo evita l'uso di 32 etichettatura traccia P. Abbiamo misurato la concentrazione riboprobe utilizzando un Biotek Epoca Spettrofotometro per micropiastre. Un confronto tra i valori ottenuti allo spettrofotometro per le stime di massa riboprobe dalla incorporazione 32 P ha mostrato che i due metodi danno risultati comparabili con un volume analogo piccolo (2 mL) del campione dalla preparazione della sonda finale.
      Quasi sempre una resa molto bassa o nulla è dovuto alla contaminazione da RNasi provenienti dalla preparazione plasmide utilizzato come modello per la PCR. Assicurati di trattare il vostro DNA plasmidico e prodotto di PCR con proteinasi K come descritto al punto 1.1.3.
  4. Valutazione della qualità del riboprobe - misura specifica attività.
    1. Per misurare il grado di digossigenina - incorporazione UTP eseguire un test di spot. Questo è un importante test di controllo qualità.
      Regolare la concentrazione della sonda a 100 ng / mL. Spot 1 ml di diluizioni in serie (10 -2 a 10 -5) della sonda su un diametro di 82 millimetri di Hybond-N + (GE Healthcare) o altri filtro in nylon equivalente. Includere un campione di DNA senza etichetta come controllo negativo. Reticolare il filtro umido immediatamente in un reticolante UV 125mJoules o secondo le istruzioni del produttore per il filtro di nylon si sta utilizzando.
      Tutti i passaggi seguenti (1.4.2 - 1.4.6) sono eseguiti in una capsula di Petri su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente. Non dovete preoccuparvi di RNasi dopo aver individuato le diluizioni sonda sul filtro
    2. Blocco del filtro per 30 minuti a temperatura ambiente in 10 ml di 1% reagente di blocco (Roche) in 1X TN (TN 10X buffer = 1M Tris pH7.5, 1.5M NaCl)
    3. Lavare 1 x 15 min in un tampone da 10 ml 1X TN.
    4. Incubare con anti frammento Fab digossigenina alla diluizione 1 / 5000 in 1X TN tampone per 30 minuti. </ Li>
    5. Lavare 2 x 15 min in un tampone da 10 ml 1X TN.
    6. La reazione del colore viene eseguita con BM substrato viola (bisogno di circa 5 ml nel piatto). Colore dovrebbe essere visibile sul posto dalla diluizione 10 -4 in 30 minuti. A quel punto, fermare la reazione del colore con il lavaggio per 2 volte per 5 minuti ciascuno con 5X TE. Se il segnale non è visibile nel punto che corrisponde alla diluizione 10 -4 allora la sonda deve essere scartato.
      Nota: Nella nostra esperienza, inadeguata attività specifica è trovato solo con sonde breve. L'aumento delle dimensioni del modello della sonda (fino a 1kb) nel pieno rispetto dei criteri di progettazione specificati in questo protocollo dovrebbe aumentare l'attività specifica della sonda. Bassa attività specifica porta a livelli bassi o non rilevabili di segnale.
  5. Verificare l'integrità della sonda mediante elettroforesi in un gel al 5% di acrilammide denaturante.
    Questo è un altro importante test di controllo qualità. Questo protocollo si assume che la sonda è stata marcata con 32 P durante la reazione di sintesi (vedi punto 1.2.1). Noi usiamo gel acrilamide denaturazione di fornire una risoluzione molto alta, che ci permette di individuare facilmente le sonde degradati o incomplete. Tipicamente un 5% di acrilammide denaturante minigel (urea 7,5 g, 1.9ml 40% di acrilammide, 1.9ml 2% bis-acrilamide (o usare un 20:1 acrilamide: bis-acrilamide soluzioni), 1,5 ml gel MOPS 10X tampone (0,2 M morpholinopropanesulfonic acido, pH7.0, acetato di sodio 50mM 5mM EDTA) e H 2 O ad un volume finale di 15 ml), funziona molto bene per risolvere le sonde nelle dimensioni intervalli utilizzati in questo protocollo.
    Nota: In alternativa, TBE-urea gel prefabbricati possono essere acquistati da vari fornitori. Seguire le istruzioni del produttore per l'esecuzione di gel prefabbricati.
    1. Mescolare il campione con un uguale volume di tampone di caricamento del gel (Ambion) e mescolare bene.
    2. Di calore a 95 ° C per 5 minuti per denaturare le strutture secondarie.
    3. Raffreddare immediatamente in ghiaccio prima di caricare sul gel per prevenire una nuova ricottura.
    4. Eseguire il prima e dopo i campioni colonna insieme a 200V fino a quando il colorante blu corre verso la fine del gel. Il gel viene eseguito in gel 1X tampone MOPS.
    5. Avvolgere il gel in involucro di plastica ed esporla ai raggi X film o fosforo schermo imager per rilevare l'RNA radioattivo. Se 32 etichettatura P non è utilizzato si può macchiare il gel con un colorante fluorescente convenzionale per rilevare l'RNA
    6. Una sintesi della sonda di successo si tradurrà in un sonde di RNA che migra come una band forte molto vicino alla parte superiore del gel.

2. Raccolta e conservazione di embrioni di topo

  1. Embrioni di topo deve essere raccolto in ghiaccio freddo PBST (PBS + 0,1% Tween 20, (diethylpyrocarbonate (DEPC) trattati)) e tenuta in ghiaccio durante la dissezione.
  2. Gli embrioni sono trattati in 4 ml fiale di vetro con tappo a vite. Più embrioni può essere fissato in un flaconcino. Ben il 10-15 E9.5 o 5 embrioni 10,5 può essere fissato in un singolo flaconcino. A causa delle dimensioni sempre più l'embrione, gli embrioni dovrebbero essere E11.5 hemisected con una lametta prima di fissaggio per facilitare l'accesso della sonda durante l'ibridazione. Fino a 3 embrioni hemisected E11.5 può essere collocato in un singolo flaconcino.
  3. Per massimizzare l'efficacia dei passaggi di questo protocollo e per ridurre i danni agli embrioni, la fissazione degli embrioni e tutti i lavaggi vengono eseguiti in fiale del campione con soluzioni riempito al livello inferiore del collo flaconcino, in modo che solo una piccola bolla d'aria rimane, se non diversamente specificata. Per tutti i flaconi di lavaggio passi sono stabilite dalla loro parte su una piattaforma rocker.
  4. Fix per 6 ore a notte a 4 ° C su un tavolo a dondolo con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBST. Fiale deve essere posizionato in orizzontale e cullato su una piattaforma rocker a 4 ° C.
  5. Dopo la fissazione, gli embrioni vengono lavati due volte per 5 minuti ciascuno in PBST su ghiaccio e poi disidratati attraverso un graduale metanolo / PBST serie (25% metanolo in PBST, il 50% di metanolo in PBST e il 75% di metanolo in PBST) in 100% di metanolo, sostituendo soluzioni nel flaconcino di vetro utilizzando pipette Pasteur. Gli embrioni possono essere conservati a-20C a 100% di metanolo per 8 mesi e forse più a lungo.

3. Ibridazione della sonda marcata con digossigenina di embrioni di topo intero

  1. Cuori puntura e capi di 10,5 anni in embrioni con un coltello microdissezione mentre gli embrioni sono ancora in metanolo (se questo non è stato fatto durante la dissezione). Questa semplice operazione consente di soluzioni di lavaggio di entrare nel cervello e vescicole camere cardiache quindi riducendo di molto la colorazione di fondo.
  2. Reidratare gli embrioni da lavaggi successivi in ​​metanolo / PBST serie (75% metanolo in PBST, il 50% di metanolo in PBST e poi 25% di metanolo in PBST) per 5-10 minuti per ogni concentrazione di metanolo. Lavare due volte per 5 minuti ogni lavaggio in 100% PBST.
  3. Incubare a 04:01 PBST: 30% H 2 O 2per 1 ora su ghiaccio. Lavare quindi con 3 cambi 5 minuti ciascuno in 1X PBST.
  4. Rimuovere l'ultimo lavaggio PBST e sostituirlo con 1ml 10 mg / ml di proteinasi K in PBST. Durante la digestione posto proteinasi K i tubi in verticale in un rack in un bagno d'acqua ° 25 C.
    Nota: Le soluzioni di proteinasi K perdere attività nel tempo a causa di auto-digestione. Per assicurare la massima attività e coerente la soluzione di proteinasi K deve essere fresco, immediatamente prima di ogni utilizzo. Per ogni utilizzo fare una piccola quantità di uno stock 1mg/ml poi diluito. Il tempo di incubazione deve essere determinato per ogni lotto di polvere proteinasi K e per ogni età embrionale. Ad esempio, per gli embrioni E9.5 un buon tempo è di solito 10-15 minuti a 25 ° C, mentre per il 10,5 è di solito 20-30 minuti a 25 ° C. L'incubazione proteinasi K tempo deve essere misurato con precisione durante gli esperimenti per consentire di eseguire confronti validi tra fiale e tra esperimenti. La temperatura deve essere accuratamente mantenuta durante la digestione per aumentare la riproducibilità. Differenze piccolo come 1 ° C può alterare la quantità di digestione tra esperimenti. Si raccomanda vivamente che la proteinasi K digestioni essere fatto in un incubatore o un bagno d'acqua per un controllo accurato della temperatura. Questo passaggio è fondamentale per consentire alla sonda di penetrare il tessuto in modo da generare segnale forte. Tuttavia, oltre-digestione danneggiare gli embrioni e che gradualmente si disintegrano nel corso dei passaggi successivi.
  5. Fermare la digestione proteinasi K con il lavaggio due volte per 5 minuti ogni lavaggio a temperatura ambiente con appena fatto 2 mg / ml di glicina in PBST. Poi lavare due volte per 5 minuti ciascuno in PBST.
  6. Fissare gli embrioni digerito per 20 minuti a temperatura ambiente nel 4% PFA / PBST, gluteraldehyde 0,2% (Polysciences). Non sovra o underfix. Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBST.
  7. A questo punto, gli embrioni dovrebbero essere divisi in gruppi per l'ibridazione. Rimuovere il PBST. Aggiungere 1 ml di tampone di ibridazione (formammide ultrapura 50% (Invitrogen), 5x SSC, pH 5, 1% SDS, 50 mg / ml di eparina (Acros), 50 mg / ml di RNA Torula (Sigma)) che è stato riscaldato a 65 ° C (senza sonda). Lasciare embrioni per risolvere, quindi rimuovere tutti i buffer di hybrization e sostituirlo con 1 ml di tampone fresco ibridazione scaldato senza sonda.
  8. Prehybridize per 1 ora a 65 ° C in un bagno d'acqua agitazione o in forno su una piattaforma oscillante (per esempio il Agitare Boekle 'n' Oven Bake, vedi Tabella 1). Se si incubare le provette in un bagnomaria essere sicuri acqua arriva fino a, ma non oltre, le cime dei flaconcini. La temperatura di ibridazione può essere aumentata fino a 70 ° C. le temperature di ibridazione superiori a 65 ° C non influiscono l'intensità del segnale o di fondo con la maggior parte delle sonde che abbiamo testato. Gli embrioni diventano traslucidi, appiccicoso, e fragile nei buffer formammide (ibridazione ad esempio buffer) fare attenzione quando loro manipolazione.
  9. Sostituire il buffer prehybridization con il tampone di ibridazione contenente 0,4 ml sonda ad una concentrazione di 0,25-1 mg / ml. Utilizzate da 0,5 mg / ml di sonda per gli embrioni fino a circa E8.5. Per le vecchie embrioni, sonde deve essere titolato 1-0,1 mg / ml per determinare la concentrazione ottimale per un buon segnale con sfondo (di solito intorno 0,25-0,5 mg / ml o giù di lì). Si noti che i volumi di ibridazione più grande può essere necessario per gli embrioni più grandi. Ibridare notte a 65 ° C.
  10. Se gli embrioni sono stati oltre trattati con proteinasi K. appariranno estremamente trasparente. Possono aderire anche ai lati della fiala, o cadere a pezzi. Gli embrioni che appaiono in questo modo dovrebbe essere scartato a questo punto del protocollo. Elaborarli ulteriormente non si tradurrà in dati interpretabili.
  11. Sostituire il tampone di ibridazione con la soluzione riscaldata I (50% formammide, 5x SSC pH 5, 1% SDS) a 70 ° C. Lavare due volte per 30 minuti ogni lavaggio per E8.5 embrioni, tre volte per 30 minuti a lavaggio per E9.5 e anziani.
  12. Lavare una volta con pre-riscaldato soluzione al 50% I: 50% Solution II (0.5M NaCl, 10mM Tris HCl pH 7,5, 0,1% Tween 20) a 70 ° C per 10 minuti.
  13. Lavare tre volte per 5 minuti a lavaggio con la soluzione II a temperatura ambiente.
  14. Sostituire il tampone con la soluzione II contenente RNAsi A 100 mg / ml RNasi T1 100 unità / ml. Incubare su una sedia a dondolo in camera calda a 37 ° C due volte per 30 minuti per ogni lavaggio. RNasi Il lavaggio è essenziale per ridurre sfondo il risultato di sonde ibridate non specifico.
  15. Lavare in Solution III (50% formammide, 2x SSC pH5) a 65 ° C due volte per 30 minuti ogni lavaggio per E8.5, 3 volte per 30 minuti a lavaggio per E9.5 e anziani.
  16. Lavare 3 volte per 5 minuti per lavare con 1X TBST (100 ml di 10X TBS contiene 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 12.5ml 2M Tris HCl pH 7,6 in acqua. Per fare 1X TBST diluire il 10X TBS in un volume adeguato di acqua e aggiungere concentrazione Tween 20-0,1% finale)
  17. Se non diversamente specificato, tutti i lavaggi vengono eseguiti nei flaconcini campione con soluzioni riempito al livello inferiore delfiala collo. Per tutte le fasi di lavaggio, fiale sono stabilite dalla loro parte su una piattaforma rocker.

4. Rilevazione degli anticorpi della sonda marcata con digossigenina

  1. Gli embrioni sono già bloccati in 0,5 ml 1X TBST calore + 10% di siero di pecora trattata. Poi le fiale di roccia verticale a temperatura ambiente (~ 20 ° C) per almeno 2,5 ore.
  2. Sostituire la soluzione di saturazione con freschi TBST 1X + 10% di siero contenente un 1:2000 - 1:5000 diluizione della fosfatasi alcalina coniugata pecora anti-digossigenina frammenti Fab (sottratta da incubazione con polvere embrione acetone, vedi sotto). Usare diluizioni più elevate per gli embrioni E9.5 e più anziani, fino a 1:5000 per minimizzare sfondo. Incubare a picco sul bilanciere a 4 ° C durante la notte.
    Nota: Abbiamo scoperto che l'incubazione del movimento anti-digossigenina frammenti Fab con una polvere acetone embrione riduce i livelli di colorazione di fondo in questo protocollo. Per preparare la polvere acetone embrione E12.5-omogeneizzare pool 14,5 embrioni di topo in un volume minimo di PBS. Aggiungere 4 volumi di acetone freddo ghiaccio, mescolare e incubare in ghiaccio per 30 minuti. Rimuovere il surnatante facendo girare a 10.000 xg per 10 minuti. Lavare il pellet con acetone ghiacciate e girare di nuovo. Diffusione del pellet fuori e macinare in polvere su un foglio di carta da filtro e lasciare asciugare all'aria. La polvere può essere immagazzinato in un tubo a tenuta d'aria a 4 ° C per anni.
    Per la sottrazione di anticorpi, l'anticorpo deve essere pre-assorbito alla polvere acetone embrione per ridurre legame aspecifico durante o prima di pre-bloccante. Incubare anticorpi al 1 / 100 con una piccola quantità di polvere embrione (l'ammontare non è critica) in 1xTBST/10% di siero per almeno 1 ora a 4 ° C con dondolo. Togliere polvere dal giro in una microcentrifuga per 10 minuti a 4 ° C. Anticorpi sottratto può essere conservato a 4 ° C per almeno 6 mesi.
  3. Lavare tre volte 5 minuti ciascuno con TBST 1X, poi 5-6 volte per 1 ora ciascuna a temperatura ambiente per eliminare l'anticorpo in eccesso. Se si preferisce, fare un lavaggio prolungato notte a 4 ° C per ridurre sfondo. Il lavaggio durante la notte può ridurre drasticamente i livelli di fondo aumentando così il rapporto segnale-rumore.
  4. Lavare due volte per 20 minuti per lavare con appena fatto tampone della fosfatasi alcalina (100mM Tris, pH 9,5, 50mM MgCl 2, 100mM NaCl, 0,1% Tween 20. Aggiungi levamisolo 0.5mg/ml, un inibitore endogeno AP, per E9.5 e anziani embrioni).
  5. Sostituire l'ultimo lavaggio con substrato BM Viola AP (Roche) preriscaldata a temperatura ambiente.
  6. Lasciare che la reazione di colore per incubare a temperatura ambiente, e guardare per il segnale periodicamente tramite un microscopio da dissezione. Per le reazioni colore esteso (diverse ore per notte) le fiale devono essere schermati dalla luce. Segnale per mRNA abbondanti devono essere visibili entro 15 minuti. Reazioni deve essere interrotto quando si è soddisfatti con il segnale, o quando il fondo comincia ad essere un problema. Se la stessa soluzione inizia a diventare scuro è possibile estendere la reazione a colori sostituendo la soluzione di substrato.
  7. Fermare la reazione mediante lavaggio due volte per 5 minuti a lavaggio in 1X PBST/5mM EDTA.
  8. Trasferimento al 4% paraformaldeide / PBST di ri-fix, da diverse ore a notte. O gli embrioni possono essere conservati nel 4% PBST paraformaldehyde/1X per anni o può essere immediatamente trattati per sezionamento. Questo passo fissazione finale è cruciale per la conservazione a lungo termine del modello di colorazione.

5. Inclusione in paraffina e sezionamento degli embrioni macchiato

  1. Prima che gli embrioni sono fissati dopo la reazione di colore (punto 4.8) le immagini degli embrioni intero monte colorati vengono prese quando il livello di colorazione è l'intensità desiderata. Dopo aver documentato il pattern di espressione in tutta la loro embrioni vengono incubati nel substrato BM viola durante la notte per 24 ore a temperatura ambiente fino a quando l'embrione diventa tutto blu scuro. Questo passo è quello di garantire che la colorazione sia sufficientemente scuro di presentarsi in sezioni di tessuto. Si prega di notare che il colore blu dell'embrione è dovuto alla deposizione di un sottilissimo strato di pigmento su tutta la superficie dell'embrione. Questa colorazione di fondo non rilevabili all'interno del tessuto di interesse dopo il sezionamento.
  2. Lavare gli embrioni colorati con PBS per tre volte per rimuovere il substrato in eccesso precipita e fissare la notte in PFA 4% a 4 ° C.
  3. Lavare con PBS per tre volte, e poi disidratano gli embrioni in 100% metanolo (come descritto al punto 2.4).
  4. Sostituire il metanolo scorso con xilene. Lavare in xilene 2 o 3 volte per 2 minuti ogni lavaggio fino a quando gli embrioni diventato chiaro. Non più di lavare in xilene in quanto renderà il tessuto molto fragile dopo che è stato incorporato che rende molto difficile recuperare sezioni intatto. Monitorare visivamente ciascuna incubazione xilene per fare gli embrioni che sono solo al punto di essere chiari ed essere molto attenti a non permettere l'incubazione xilene di estendere oltre questo punto.
  5. Trasferimento di embrioni (10,5 e oltre) Nella biopsia Certo-Tek cassette (Fisherbrand), e incubare la cassetta tutto in cera (Fisherbrand) per 15 ~ 30 minuti a 65 ° C. Trasformarsi in cera fresca per altri 15 ~ 30 minuti e poi cambiare di nuovo. Piccoli embrioni / tronchi tessuto richiedono minore tempo di incubazione cera. Embrioni E9.5 può essere collocato in formelle del tessuto per tutte le modifiche cera. In questi casi è possibile rimuovere la cera dallo stampo invece di trasferire gli embrioni.
  6. Dopo tre cambi di cera, il trasferimento degli embrioni in formelle del tessuto (Polysciences) e incorporare con cera fresca. Posizionare accuratamente gli embrioni per il piano desiderato di sezionamento. Lasciate che la cera si raffreddi fino solidificato.
  7. Sezione la cera blocchi in 8 ~ 14μm fette utilizzando le normali microtomo (es. Leica RM2155). Raccogliere sezioni su vetrini da microscopio (Fisherbrand).
  8. Lasciate che le diapositive laici piatto e asciugare su un slidewarmer. Le slide possono essere conservati a 4 ° C per mesi.
  9. Sezioni secchi sono deparaffinato per due lavaggi min 5 xilene e reidratati in acqua da seriale metanolo / acqua lava (100% di metanolo 2 min, 100% di metanolo 2 min, 90% di metanolo / acqua 2min, 70% di metanolo / acqua 2min, acqua deionizzata 5 min).
  10. Macchiare le sezioni con rosso nucleare fast (Sigma), soluzione colorante per 1 minuto. Per generare il nucleare soluzione rapida colorazione rossa, diluire uno stock concentrato di nucleare veloce rosso (0,1% nucleare rosso veloce in solfato di alluminio al 5% in acqua, sciogliere con il calore e filtrare su filtro di carta Whatman) 1:5 in una soluzione acquosa su 5 % solfato di alluminio. Dopo la colorazione lavare i vetrini con acqua corrente finché l'acqua diventa chiara. Il rosso nucleare veloce funge da contrasto e rivela la struttura complessiva dei tessuti in sezioni. Il suo colore contrasta bene con la colorazione viola-blu che segna la localizzazione della sonda RNA. Nucleare rosso veloce è una macchia e saturando l'intensità di colorazione è controllata dalla concentrazione della soluzione colorante. Se l'intensità della colorazione nucleare veloce rosso è inadeguata quando si usa questa soluzione colorante si può ripetere questo passaggio con un più concentrato nucleare soluzione rapida rosso.
  11. Preparare i vetrini coprioggetto per il montaggio da lavaggi in ciascuna delle soluzioni della serie seguente: 90% di metanolo / acqua seguito da 2 lavaggi in 100% di metanolo seguiti da 2 lavaggi in xileni. Incubare il vetrino per 2 minuti in ciascuno dei lavaggi.
  12. Montare i vetrini con 60 Cytoseal mezzo di montaggio (Richard Allan-scientifico). Si prega di notare che il mezzo di montaggio acquoso si dissolverà il rosso nucleare veloce macchia.
    Nota: abbiamo usato anche una resina plastica embedding (Immuno-letto, Polysciences Inc) per la generazione di embrioni sezioni colorate con ottimi risultati 4.

6. Rappresentante dei risultati:

La figura 1 illustra i risultati ottenuti rappresentante utilizzando questo protocollo. La figura 1A mostra il pattern di espressione di Gata3 in embrioni di topo 10,5. Questo pannello mostra un buon risultato con un elevato rapporto segnale-fondo. Figura 1C, al contrario, mostra un fallito ibridazione in situ per mRNA Gata3 quella utilizzata una sonda di parziale degrado RNA. Una sonda bassa attività specifica si tradurrà in risultati simili con basso segnale di contrasto di fondo. Un confronto tra i pannelli A e C illustra l'importanza di effettuare un'attenta valutazione della qualità controllo di qualità sonda per assicurare risultati di alta qualità. Il risultato ottenuto con la sonda Foxg1 (Figura 1B) mostra anche un buon risultato con colorazione specifica nel telencefalo con sfondo basso in altre parti del cervello. Il cervello e il cuore sono luoghi comuni di colorazione di fondo causato dalla cattura della sonda. Pungere il cervello e il cuore con le pinze permette lavare soluzioni in embrione e colorazione di fondo riduce al minimo (vedi punto 3.1). 1D figura illustra il tipico sfondo azzurro trovato quando il cervello non è forato. Questo mostra un risultato ottimale ottenuto con una sonda Pax1. Pax1 non si esprime in ogni parte del cervello e tutte le colorazione visto nel cervello di questo embrione è dovuto alla non-specifico fondo.

Figura 1
Figura 1. Rappresentante risultati mostrando esempi di successo (A, B) e di non ottimale (C, D) esiti. A. embrione 10,5 Gata3 ibridato con la sonda. B. embrione E11.5 ibridato con Foxg1 sonda. C. E10. 5 embrione Gata3 ibridato con la sonda che è parzialmente degradato, mostrando segnale molto debole, ma di fondo alto durante tutto l'embrione intero. D. embrione 10,5 ibridato con Pax1 sonda senza pungere la testa, mostrando la colorazione di fondo nei ventricoli (teste di freccia).

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Discussion

I metodi descritti in questo protocollo sono stati adattati da un certo numero di fonti diverse e ottimizzato per montare tutto E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita. Metodi per montare tutto ibridazione in situ degli embrioni dei vertebrati prima apparizione nei primi anni 1990 2,5-12. Questo protocollo è stato adattato principalmente dai metodi sviluppati per gli embrioni di Xenopus 7,8 e 2,11 del mouse. Nel nostro protocollo una grande enfasi è posta sulla valutazione della qualità attenta della sonda. Attenzione alla generazione di una qualità alta e alta attività specifica della sonda RNA come determinato dai primi passi in questo protocollo aumenterà notevolmente la qualità dei dati e risparmiare una considerevole quantità di tempo e fatica nel lungo periodo. Il nostro protocollo prevede anche l'utilizzo di modelli di DNA PCR generato per la trascrizione RNA polimerasi dei fagi. Questo approccio è rapido e molto scalabile. E 'possibile attivare la generazione di un gran numero di sonde di RNA per schermi di grandi dimensioni in ibridazione in situ 13-15.

Diversi passi in questo protocollo dovrebbe essere considerato quando lo sfondo è alto, ma il segnale è basso. Una considerazione è la sonda. Non abbiamo mai avuto elevato background con sonde di RNA che ha incontrato i criteri di progettazione di cui al presente protocollo e che aveva superato tutti e tre i test di controllo qualità (resa, l'attività specifica e la lunghezza della sonda). Un altro fattore che può influenzare i livelli di fondo è la capacità della sonda di penetrare nei tessuti embrionali. Si deve prestare attenzione durante la dissezione per rimuovere completamente le membrane extraembrionali che coprono l'embrione. Inoltre, la digestione proteinasi K passo è assolutamente essenziale per gli embrioni più di E9.5. Più lunghi tempi di digestione proteinasi K dare più basso e più forte segnale di fondo, però, i tempi di digestione eccessiva può provocare danni tissutali aumentato e può portare alla disintegrazione dell'embrione durante la procedura. Ottimizzazione del tempo di digestione per ogni lotto di proteinasi K è necessaria per ottenere i migliori risultati. Un altro passo che possono essere ottimizzate per ottenere alti rapporti segnale di fondo è l'incubazione RNasi (passo 3.14). Il nostro protocollo utilizza una miscela di RNasi A e RNasi T1. Entrambi gli enzimi digeriscono singolo filamento di RNA, ma ogni enzima ha una specificità diversa base. La combinazione dei due risultati enzimi per la digestione completa di singolo filamento di RNA oligoribonucleotides piccoli. Ciò consente la maggior parte della sonda non specificamente ibridato da rimuovere dal post-ibridazione lava con una conseguente diminuzione di grandi dimensioni in colorazione di fondo. L'uso di RNase A o risultati T1 da solo in fondo aumentata e dovrebbe essere evitato. Abbiamo anche trovato che la qualità della reazione colore finale è migliorata usando fresca tampone AP, fatta immediatamente prima dell'uso.

Il nostro protocollo può essere adattato per anziani embrioni o tessuti adulti con ulteriori elaborazioni. Per esempio, abbiamo usato anche questo protocollo per effettuare ibridazioni in situ su spessore (100 micron) vibratome sezioni di cervello di topo adulto (dati non riportati). Abbiamo anche usato questo protocollo per lo studio dell'espressione genica nei vecchi embrioni. In alcuni casi hanno usato questo protocollo per visualizzare l'espressione genica sulla superficie del E13.5 e E14.5 embrioni, come Gad1 espressione nei follicoli del vibrisse 4. In altri casi abbiamo usato una lametta o bisturi per tagliare E12.5, E14.5 embrioni per consentire l'accesso della sonda ai tessuti specifici all'interno dell'embrione. Frammenti embrione preparato in questo modo possono essere trattati con questo protocollo con alcune modifiche. In questi casi la lunghezza di tutti i trattamenti e le fasi di lavaggio deve essere regolata in base alle dimensioni del tessuto e ottimizzato empiricamente.

Il nostro protocollo include anche dei metodi per la post-ibridazione sezionamento e l'analisi di modelli di espressione. In combinazione con la visualizzazione monte intero di espressione genica questo ulteriore passo può aggiungere una grande quantità di informazioni aggiuntive relative il pattern di espressione di un gene. Abbiamo incorporato embrioni dopo aver subito ibridazione in situ in paraffina così come in resina plastica 4,16. Le sezioni di embrioni macchiato può essere utilizzato per generare una ricostruzione tridimensionale del modello dell'espressione rivelato da tutto il monte procedura di ibridazione in situ. Abbiamo usato software di ricostruzione dal software SURFdriver per questo scopo.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede R21MH082360 (Cgcf) e R01HD056315 (NRM), così come l'Università della Georgia.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Reagent Roche Group 11209256910
Ribonucleoside Triphosphate Set Reagent Roche Group 11277057001
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification Supply Roche Group 11274015001
T7 RNA polymerase Reagent Roche Group 10881767001
SP6 RNA polymerase Reagent Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase Reagent Roche Group 11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi Reagent PerkinElmer, Inc. BLU008X250UC
DNase I recombinant, RNase-free Reagent Roche Group 4716728001
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder Reagent Fisher Scientific BP169-500
Gel loading buffer Reagent Ambion AM8547
Hybond-N+, Amersham Supply GE Healthcare RPN82B
UV Stratalinker 2400 Equipment Stratagene, Agilent Technologies
Diethyl pyrocarbonate Reagent Sigma-Aldrich D5758-100ML
Heparin sodium Reagent Acros Organics 41121-0010
hydrogen peroxide 30% in water Reagent Fisher Scientific BP2633-500
Gluteraldehyde, 8% EM grade Reagent Polysciences, Inc. 0/710 Use with caution according to manufacture’s instructions
Blocking reagent Reagent Roche Group 11096176001 Make into 5% stock and store at -20° C
Proteinase K Reagent Roche Group 3115852001
Rnase A Reagent Roche Group 10109142001 Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C.
Rnase T1 Reagent Roche Group 10109193001
Ultrapure Formamide Reagent Invitrogen 15515-026
Levamisole hydrochloride Reagent ICN Biomedicals 155228
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI Reagent Sigma-Aldrich R6625 phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. Reagent Roche Group 11 442 074 001
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit Supply National Scientific Company B7800-2
Shake N Bake hybridization oven Equipment Boekel Scientific 136400
Biopsy Sure-Tek Supply Fisher Scientific 15-200-402C
Paraplast Plus tissue embedding medium Reagent Fisher Scientific 23-021-400
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds Supply Polysciences, Inc. 18646A
Colorfrost Plus Microscope slides Supply Fisher Scientific 12-550-17
Nuclear Fast Red Reagent Sigma-Aldrich N8002
Cytoseal 60 Reagent Richard-Allan Scientific 8310-16

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 56 trascrittoma, embrione di topo l'espressione genica trascrizioni mRNA nella trascrizione in vitro riboprobe
Tutto il monte<em> In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo
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Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (56), e2797, doi:10.3791/2797 (2011).

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