HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

Summary

وصفت طريقة جديدة مستقلة عن العاصمة الاستقراء وتوسيع خلايا محددة مستضد تي. يتم تحميل HLA - A2 الإيج المعتمدة على خلايا مولدة تقديم الاصطناعي (aAPC) مع HLA - A2 الببتيدات يقتصر على توسيع بكفاءة CTL من خصوصية المستضد متنوعة. هذه التكنولوجيا يحمل إمكانات كبيرة للCTL المستندة المناعي بالتبني.

Abstract

CTL مع وظيفة المستجيب الأمثل تلعب أدوارا حاسمة في التوسط في الحماية ضد الأمراض المختلفة والخلايا السرطانية. ومع ذلك ، قد يحمل الأفراد المكروية المناعي القمعية ، وعلى النقيض من تفعيل CTL ، زنزاناتهم مستضد ذاتي قد تميل إلى تقديم tolerize أو anergize CTL مستضد معين. نتيجة لذلك ، وإن كانت لا تزال في مرحلة تجريبية ، وقد تطورت على أساس CTL المناعي بالتبني لتصبح واعدة لعلاج لمختلف الأمراض مثل السرطان والالتهابات الفيروس. في التجارب الأولية التي استخدمت في خارج الجسم الموسعة CMV (المضخم للخلايا) CTL محددة للعلاج من عدوى في CMV المناعة خيفي مرضى زرع نخاع العظم. في حين أنه من الشائع أن تهدد الحياة viremia CMV في هؤلاء المرضى ، أي من المرضى الذين يتلقون توسيع CTL تطوير CMV مرض ذات الصلة ، مما يعني ضمنا تأسيس مناعة مضادة للCMV من CTL نقل adoptively ^1. وتم أيضا نتائج واعدة لوحظ سرطان الجلد ، ويمكن توسيعه ليشمل أنواع أخرى من السرطان ^2.

في حين أن هناك العديد من الطرق لتحفيز الجسم الحي السابقين وتوسيع CTL الإنسان ، وتقتصر المناهج الحالية من قيود التكلفة والتقنية. على سبيل المثال ، يعتمد معيار الذهب الحالي على استخدام العاصمة ذاتي. هذا يتطلب من كل مريض على التبرع بعدد كبير من الكريات البيض ، وأيضا مكلفة جدا وشاقة. وعلاوة على ذلك ، فقد كشفت تفاصيلها في توصيف المختبر من العاصمة توسيع CTL أن هذه وظيفة المستجيب الأمثل فقط ^3.

هنا نقدم كفاءة عالية aAPC نظام قائم للتوسع خارج الجسم الحي من CTL CMV الإنسان محددة لعلاج مناعي بالتبني (الشكل 1). قدمت من قبل اقتران aAPC الخلية الخرز المغناطيسي الحجم مع ديمر HLA - A2 - الإيج الإنسان ومكافحة CD28mAb ^4. مرة واحدة مصنوعة aAPC ، يمكن تحميلها مع الببتيدات مختلف المصالح ، ويظل ساريا لمدة شهور. في هذا التقرير ، تم تحميلها aAPC مع الببتيد المهيمنة من CMV ، pp65 (NLVPMVATV). بعد زرع النقي الإنسان CD8 ⁺ CTL من متبرع صحية مع aAPC لمدة أسبوع ، ويمكن زيادة CMV CTL محددة بشكل كبير في نوعية ما يصل الى 98 ٪ (الشكل 2) وتضخيمها أكثر من 10000 مرة. إذا كانت مطلوبة أكثر CMV CTL محددة ، ويمكن تحقيق مزيد من التوسع بسهولة عن طريق التحفيز المتكرر مع aAPC. توصيف المظهري وظيفية تظهر هذه الخلايا لديها ذاكرة موسعة المستجيب النمط الظاهري ، وجعل كميات كبيرة من كلا TNFα وIFNγ (الشكل 3).

Protocol

1. القرارات ، HLA - A2 - الإيج تستند aAPC

1. تعد عقيمة العازلة بورات
   1. تذوب في الماء حمض البوريك لجعل 0.1M. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0.
   2. التصفية من خلال تصفية وتعقيم 0.22μm المحل في 4 درجات مئوية.
2. تعد عقيمة العازلة اغسل الخرزة
   1. اتخاذ 956ml PBS ث / س المغنيسيوم أو الكالسيوم.
   2. إضافة 30ml الإنسان AB المصل.
   3. إضافة EDTA 2mm والتركيز النهائي.
   4. إضافة 0.1gsodium أزيد.
   5. من خلال فلتر تصفية العقيمة 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. تأخذ 1ml من الخرز Invitrogen إبوكسي M - 450 من الأوراق المالية ، وحوالي 400 مليون الخرز (يمكن عدها الخرز التي عدادة الكريات) ، ووضع في قارورة معقمة المسمار ، والزجاج العلوي.
4. وضع قنينة ضد المغناطيس Dynal MPC - 1 ، في حين أن حبات تلتزم جانب القارورة ، إزالة طاف بواسطة الطموح. تغسل حبات مرة واحدة مع من 1ml العازلة بورات.
5. Resuspend الخرز في خليط من بورات 1ml العازلة و 20 ميكروغرام من HLA - A2 - الإيج ديمر و 20 ميكروغرام من خريطة موقع CD28 مكافحة الإنسان (استنساخ 9.3).
6. البروتين لاقتران حبة : ضع قارورة من الزجاج على المدورة وتناوب على 4 ساعات لمدة 24 درجة مئوية.
7. وضع أنبوب في MPC - 1 المغناطيس وإزالة كافة العازلة بورات.
8. تغسل حبات مرتين مع 1ml العازلة اغسل الخرزة.
9. احتضان حبات في 1ml العازلة اغسل الخرزة ، وتناوب على 4 ساعات لمدة 24 درجة مئوية. لأن حبة العازلة اغسل يحتوي المصل AB الإنسان ، فإنه سيتم منع كل موقع بروتين ملزمة المتبقية على الخرز.
10. إزالة طاف من قارورة زجاجية ، مع استبدال 1ml جديدة عازلة اغسل الخرزة.

2. مراقبة جودة التحميل aAPC والببتيد والتخزين

1. إضافة ~ 5 × 10 ⁵ حبات لFACS 100μl غسل الأنابيب العازلة في نظام مراقبة الأصول الميدانية ، وصمة عار مع 1μl من الماوس مكافحة IgG1 - PE (التعرف على جزء من القطعة Fc HLA - A2 - IG) و1μl من الماوس مكافحة IgG2a - FITC (الاعتراف الجزء التيسير المضادة للCD28 ماب). بعد تلطيخ لمدة 20 دقيقة في FACS غسل العازلة ، ويغسل مرة أخرى وقراءة النتيجة مباشرة تلطيخ تدفق عداد الكريات (الشكل 4).
2. تحميل الببتيد على حبات : تغسل حبات مرتين في قنينة زجاجية معقمة 1ml مع برنامج تلفزيوني. Resuspend 1ml العقيمة مع برنامج تلفزيوني ثم تضاف 10μl من الببتيد CMV (1mg/ml)
3. عد حبات بواسطة عدادة الكريات ، والتسمية القارورة مع التاريخ والتركيز.
4. aAPC جاهزة للاستعمال بعد 3 أيام على الأقل حضانة الببتيد في 4 درجات مئوية ، لإتاحة الوقت الكافي للملزمة على الببتيد في ديمر HLA - A2 - الإيج. ويمكن تخزين حبات عند 4 درجة مئوية ، ويظل ساريا لمدة لا تقل عن 6 أشهر.

3. CTL عزلة الإنسان

1. جمع ~ 100ML من الدم المحيطي جديدة من المانحين HLA - A2 صحية إيجابية إلى 10 دينار بحريني أنابيب الصوديوم Vacutainer الهيبارين. استخدام إبرة عيار 21 أو أكبر لمنع انحلال الدم.
2. الطرد المركزي في 300xg لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة
3. إزالة طبقة البلازما بعناية من قبل كبار الطموح. يمكن استخدام البلازما وتكملة لمستنبت.
4. استبدال البلازما التي تم جمعها مع برنامج تلفزيوني العقيمة ونقل الدم في قارورة معقمة أو ثقافة T75 50ml أنابيب مخروطية. مزج الدم مع PBS جيدا pipetting صعودا وهبوطا.
5. حالما يتم جمع كل الدم ، وإعداد أربعة أنابيب إضافية 50ml 15ml المخروطية وإضافة لFicoll - Paque بلس.
6. تراكب ببطء 30 35ml من خلايا الدم في أعلى Ficoll كل أنبوب. الحفاظ على واجهة متميزة بين Ficoll وخلايا الدم.
7. الطرد المركزي في 500xg لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تشغيل الفرامل "قبالة" ، والتسارع عند أدنى مستوى ممكن للحفاظ على واجهة واضحة بين الطبقات.
8. باستخدام ماصة seriological ، نضح بعناية طبقة PBMC وجمع PBMC في أنبوب 50ml جديدة المخروطية. عندما يتم حصاد جميع PBMC إضافة 30ml من برنامج تلفزيوني وتدور 400xg لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني 30ml لإزالة كافة Ficoll المتبقية.
9. انتقل إلى CD8 ⁺ الخلايا التائية العزلة باستخدام Miltenyi الإنسان CD8 ⁺ T عدة عزل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. هذه المجموعة يثري عالية لخلايا ⁺ CD8 (عادة> 95 ٪) خلال استنزاف CD8 ^-- الخلايا.
10. عد CD8 ⁺ الخلايا التائية. وينبغي على نقاء المتوقع أن تكون أكبر من 95 ٪. لتأكيد هذا الاستخدام 2x10 ⁵ الخلايا وإجراء تحليل FACS CD4/3/8. يمكن أن تكون إما CTL المتبقية استخدمت على الفور لمستضد معين أو التحفيز aAPC يمكن تجميدها لاستخدامها في المستقبل.

4. وفي المختبر aAPC نظام ثقافة تستند

1. تحضير مستنبت
   1. لTF (T عامل نمو الخلايا ، التي أدلي بها في مختبر ⁴⁾ 2X مستنبت : استكمال RPMI المتوسطة بالإضافة إلى الجهات المانحة 5 ٪ ذاتي البلازما و 8 ٪ عامل نمو الخلايا التائية.
2. Resuspend 1000000 CTL في 8ml المتوسطة TF الثقافة 2X بالإضافة إلى 8ml المتوسطة RPMI كاملة ، إضافة 1 × 10 ⁶ aAPC ، ومزيج جيد.
3. pipetter استخدام متعدد القنوات للخلايا على 96 لوحة لوحات جيدا U الثقافة أسفل الأنسجة. (160 ميكرولتر لكل بئر)
4. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ incubater لمدة 7 أيام. تغذية الخلايا في يوم 4 و 80 ميكرولتر / TF 2X جيدا المتوسطة.
5. خلايا جاهزة للحصاد يوم 7. بعد الحصاد ، ومكان الخلايا ضد المغناطيس وإزالة aAPC القديمة.
6. ويمكن تحديد خصوصية المستضد بواسطة تلطيخ tetramer وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تجرى داخل الخلايا وتلطيخ النمط الظاهري وفقا لتلطيخ خلوى ³ دراستنا السابقة.
7. ويمكن حصادها مع الخلايا replated aAPC مرة أخرى تحت نفس الظروف. ومن المتوقع أن عدد الخلايا وخصوصية لزيادة المستضد بعد التحفيز المتكرر.

5. ممثل النتائج :

ويرد مثال aAPC بعد الاقتران HLA - A2 الإيج ومكافحة CD28 في الشكل 4. نجاح الاقتران البروتين هو واضح من خلال تحول واضح للتلوين الأجسام المضادة المقابلة. في حين أن تواتر CMV CTL معينة في الدم المحيطي عادة 0.5-1 ٪ ، وبعد اسبوع واحد من aAPC بوساطة التحفيز ، ويمكن الوصول إلى خصوصية 55-93 ٪ (الشكل 2 و 3). ويمكن التوسع في CTL مستضد محددة تكون متغيرة جدا بين مختلف الجهات المانحة ، ولكن النتائج هي استنساخه داخل الجهة المانحة نفسها. بالاستقراء ، ويمكن التوسع في خلايا CMV تكون محددة آلاف أضعاف مقارنة مع مستويات السلائف فيفو السابقين مباشرة (لا تظهر البيانات). جواني تلطيخ خلوى (الشكل 3) يوضح أن هذه CTL الموسعة polyfunctional ، بدلا من استنفاد بعد زراعة الخلايا لفترات طويلة وانتشار كبير.

الشكل 1. الممثل مخطط تدفق aAPC أساس التوسع فيفو السابقين من CTL الإنسان لالمناعي بالتبني في HSCT خيفي

الشكل 2. تلطيخ tetramer الممثل نتيجة CTL CMV المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة aAPC بعد أسبوع واحد من الثقافة

(كانت خصوصية CMV 61 ٪) الشكل 3. الممثل تلطيخ خلوى الخلايا نتيجة CTL CMV محددة تم إنشاؤها بواسطة aAPC

الشكل 4. الممثل نتيجة تلون M - 450 الايبوكسي بعد الاقتران الخرز الملون مع بروتين مضاد الفأر IgG1 - PE ومكافحة الفأر IgG2 - FITC

Discussion

نظام aAPC وصفنا هنا هو وجود نظام فعال للتوسع خارج الجسم الحي من CTL الإنسان ضد مجموعة متنوعة من مولدات المضادات. يجب توخي الحذر خاصة فيما يتعلق بنوعية تصريف البروتين والتوزيع حتى aAPC CTL والثقافة في لوحة 96 - جيدا. باستخدام هذا النهج كنا قادرين على توسيع CTL لأكثر من 8 أسابيع ، حيث نجحنا في توسيع مستضد محددة CTL يصل الى ⁴ ملايين أضعاف. كانت هناك عدة نظم APC الاصطناعية التي تستخدم خطوط الخلايا أو غيرها من المنصات ديكي ⁵ ، ولكن وفقا لبيانات نشرت كل نظام ومكانتها الفريدة في ما يتعلق بتوسيع ودعم التطبيقات خصوصية مختلفة. الأهم ، لأن نوعية CTL لا يقل أهمية عن الكمية ، ومن المتوقع أن polyfunctionality من CTL CMV الخاصة التي تم إنشاؤها بواسطة نظامنا للتشاور متفوقة المضادة للفيروسات الكفاءة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512