HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

Summary

En ny DC oberoende metod för induktion och expansion av antigen-specifika T-celler beskrivs. HLA A2-Ig bygger konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPC) är laddade med HLA-A2 begränsad peptider för att effektivt utöka CTL av olika antigenspecificitet. Denna teknik innebär stora möjligheter för CTL-baserade adoptiv immunterapi.

Abstract

CTL med optimal effektor funktion spela avgörande roller i att förmedla skydd mot olika intracellulära infektioner och cancer. Dock kan individer uppvisa repressiv immun mikromiljö, och i motsats till att aktivera CTL, kan deras autologa antigenpresenterande celler tenderar att inducera tolerans hos eller anergize antigenspecifikt CTL. Som ett resultat, men fortfarande i den experimentella fasen har CTL-baserade adoptiv immunterapi utvecklats till att bli en lovande behandling för olika sjukdomar som cancer och infektioner virus. I inledande experiment ex vivo expanderade CMV (cytomegalovirus) Särskilda CTL har använts för behandling av CMV-infektion hos immunsupprimerade allogen benmärgstransplantation patienter. Även om det är vanligt med livshotande CMV viremi hos dessa patienter, ingen av de patienter som fick utökad CTL utveckla CMV-sjukdom, vilket innebär att anti-CMV immunitet fastställs av adoptively överförda CTL ^1. Lovande resultat har också observerats för melanom och kan utvidgas till andra typer av cancer ^2.

Medan det finns många sätt att ex vivo stimulera och utveckla mänskliga CTL, är aktuella metoder begränsas av kostnaderna och tekniska begränsningar. Till exempel är den nuvarande guldmyntfoten som bygger på användning av autologa DC. Detta kräver varje patient för att donera ett betydande antal leukocyter och är också mycket dyrt och arbetskrävande. Dessutom har detaljerade in vitro karaktärisering av DC expanderat CTL visade att dessa bara har suboptimal effektor funktion ^3.

Här presenterar vi ett mycket effektivt aAPC baserat system för ex vivo expansion av mänskliga CMV specifik CTL för adoptiv immunterapi (figur 1). Den aAPC gjordes av koppling cell storlek magnetiska pärlor med humant HLA-A2-Ig dimer och anti-CD28mAb ^4. När aAPC görs, kan de laddas med olika peptider av intresse, och förbli funktionella i månader. I denna rapport har aAPC laddad med en dominerande peptid från CMV, pp65 (NLVPMVATV). Efter odling renat mänskliga CD8 ⁺ CTL från en frisk donator med aAPC en vecka, kan CMV specifik CTL ökas dramatiskt i specificitet på upp till 98% (figur 2) och förstärks mer än 10.000 gånger. Om fler CMV-specifik CTL krävs kan ytterligare expansion lätt uppnås genom repetitiv stimulering med aAPC. Fenotypisk och funktionell karakterisering visar dessa utökade celler har en effektormedierad minne fenotyp och göra betydande mängder av både TNF-och IFNγ (Figur 3).

Protocol

1. Göra, HLA-A2-Ig baserade aAPC

1. Förbered steril boratbuffert
   1. Lös borsyra i vatten till 0,1 miljoner. Justera pH till 7,0.
   2. Filtrera genom ett 0.22μm sterilt filter och förvara vid 4 ° C.
2. Förbered steril Bead Tvättbuffert
   1. Ta 956ml PBS w / o magnesium eller kalcium.
   2. Lägg 30ml mänskliga AB serum.
   3. Lägg EDTA 2mm slutlig koncentration.
   4. Lägg 0.1gsodium azide.
   5. Filtrera genom 0,22 ìm sterilt filter och förvara vid 4 ° C.
3. Ta 1 ml Invitrogen M-450 Epoxy pärlor från lager, cirka 400 miljoner pärlor (pärlor kan räknas av hemocytometer), och sattes i en steril, skruvlock injektionsflaska av glas.
4. Sätt flaskan mot en Dynal magnet MPC-1, medan kulorna följer på sidan av flaskan, avlägsna supernatanten genom aspiration. Tvätta pärlor gång med 1 ml boratbuffert.
5. Återsuspendera pärlor i en blandning av 1 ml boratbuffert och 20 mikrogram av HLA-A2-Ig dimer och 20 mikrogram av anti-humant CD28 Mab (Clone 9,3).
6. Protein pärla konjugering: sätta glasflaska på rotator och rotera vid 4 ° C i 24 timmar.
7. Placera röret i MPC-1 magnet och ta bort alla boratbuffert.
8. Tvätta pärlor två gånger med 1 ml Bead tvättbuffert.
9. Inkubera på pärlorna i 1ml Bead Tvättbuffert, rotera vid 4 ° C i 24 timmar. Eftersom Bead Tvättbuffert innehåller humant AB-serum, kommer det att blockera alla kvarvarande proteinbindning plats på pärlor.
10. Avlägsna supernatanten från glasflaska, ersätta med 1 ml färsk Bead tvättbuffert.

2. Kvalitetskontroll av aAPC och peptid lastning, lagring

1. Tillsätt ~ 5 × 10 ⁵ pärlor till 100μl FACS tvätt buffert i FACS rör, och fläcken med 1μl av anti-mus IgG1-PE (igen Fc delen av HLA-A2-IG) och 1μl av anti-mus IgG2a-FITC (igen Fc-delen av anti-CD28-mAb). Efter färgning i 20 minuter i FACS tvätt buffert, tvätta igen och läsa färgning resultatet omedelbart flödescytometer (Figur 4).
2. Peptid lastning ombord på pärlor: tvätta pärlor två gånger i glasflaska med 1 ml sterilt PBS. Resuspendera med 1 ml sterilt PBS sedan lägger 10μl av CMV peptid (1mg/ml)
3. Räkna pärlor av hemocytometer, och etiketten på flaskan med datum och koncentration.
4. aAPC är klara för användning efter minst 3 dagar peptid inkubation vid 4 ° C, för att ge tillräcklig tid för peptid bindande på HLA-A2-IG dimer. Kulorna kan lagras vid 4 ° C och förbli funktionella i minst 6 månader.

3. Mänskliga CTL isolering

1. Samla ~ 100 ml färskt perifert blod från friska HLA-A2 positiv donator till 10 BD Vacutainer natriumheparin rör. Använd en 21-nål eller större för att förhindra hemolys.
2. Centrifugera vid 300xg i 10 minuter vid rumstemperatur
3. Försiktigt bort det översta lagret plasma genom aspiration. Plasma kan användas som komplement för odlingsmedium.
4. Byt in plasman med steril PBS och överföra blodet i ett sterilt T75 kultur kolv eller 50 ml koniska rör. Blanda blodet med PBS väl genom att pipettera upp och ned.
5. När allt blod samlas in, förbereda ytterligare fyra 50ml koniska rör och tillsätt 15ml av Ficoll-Paque Plus.
6. Sakta overlay 30-35ml av blodceller på toppen av Ficoll av varje rör. Håll gränssnittet distinkt mellan Ficoll och blodkroppar.
7. Centrifugera vid 500xg i 20 minuter i rumstemperatur. Vrid bromsen "off" och accelerationen så lågt som möjligt för att upprätthålla ett tydligt gränssnitt mellan skikten.
8. Med hjälp av en seriological pipett försiktigt aspirera PBMC lagret och samla PBMC i en ny 50 ml koniska rör. När alla PBMC skördas lägga 30ml PBS och centrifugera vid 400xg i 10 min. Kassera supernatanten och skölj en gång med 30 ml PBS för att avlägsna alla kvarvarande Ficoll.
9. Gå vidare till CD8 ⁺ T-cell isolering genom att använda Miltenyi mänskliga CD8 ⁺ T-cell isolering kit enligt tillverkarens protokoll. Detta kit berikar högt för CD8 ⁺ celler (vanligtvis> 95%) av ozonnedbrytande CD8 ^- celler.
10. Räkna CD8 ⁺ T-celler. Den förväntade renhet ska vara större än 95%. För att bekräfta denna användning 2x10 ⁵ celler och utföra en CD4/3/8 FACS analys. Resterande CTL kan antingen användas direkt för antigenspecifika aAPC stimulering eller de kan frysas för framtida bruk.

4. In vitro aAPC baserat kultur-system

1. Förbered odlingsmedium
   1. För TF (T-cell growth factor, som gjordes i labbet ⁴⁾ 2X odlingsmedium: komplett RPMI medelstora plus 5% donator autolog plasma och 8% T-cell growth factor.
2. Resuspendera en miljon CTL i 8ml av TF 2X odlingsmedium plus 8ml av kompletta RPMI medium, tillsätt 1 × 10 ⁶ aAPC, blanda väl.
3. Använd ett flerkanaligt pipetter till tallrik celler på 96 och U botten vävnadskultur plattor. (160 l per brunn)
4. Kultur celler i 37 ° C, 5% CO ₂ incubater i 7 dagar. Mata celler på dag 4 med 80 l / brunn TF 2X medium.
5. Celler är redo att skördas på dag 7. Efter skörden, placera cellerna mot magneten och ta bort den gamla aAPC.
6. Antigenspecificitet kan avgöras genom tetramer färgning enligt tillverkarens protokoll. Fenotyp färgning och intracellulär cytokin färgning utförs enligt vår tidigare studie ^3.
7. Skördade celler kan replated med aAPC igen på samma villkor. Mobilnummer och antigenspecificitet väntas öka efter upprepad stimulering.

5. Representativa resultat:

Ett exempel på aAPC efter HLA A2-IG och anti-CD28-konjugering visas i figur 4. Framgångsrik protein konjugering framgår av en tydlig förskjutning av motsvarande antikropp färgning. Även frekvensen av CMV specifik CTL i perifert blod är vanligtvis 0,5-1%, efter en enda vecka av aAPC-medierad stimulering kan specificitet vid 55 - 93% (figur 2 och 3). Utbyggnaden av antigenspecifikt CTL kan vara mycket varierande mellan olika givare, men resultaten är reproducerbara inom samma donator. Genom extrapolering kan utbyggnaden av CMV specifika celler vara tusentals gånger jämfört med föregångaren nivåer direkt ex vivo (data visas inte). Intracellulär cytokin färgning (Figur 3) visar att dessa utökade CTL Polyfunktionella, snarare än utmattad efter långvarig cellodling och betydande spridning.

Figur 1. Representant flödesschemat aAPC baserade ex vivo expansion av mänskliga CTL för adoptiv immunterapi vid allogen HSCT

Figur 2. Representant tetramer färgning resultatet av CMV-specifik CTL genereras av aAPC efter en vecka av kultur

Figur 3. Representant intracellulär cytokin färgning resultatet av CMV-specifik CTL genereras av aAPC (CMV specificiteten var 61%)

Figur 4. Representant missfärgning på grund av M-450 Epoxy pärlor efter protein konjugering färgats med anti-mus IgG1-PE och anti-mus IgG2-FITC

Discussion

Det aAPC system vi beskriver här är ett effektivt system för ex vivo expansion av mänskliga CTL mot en mängd olika antigener. Särskild försiktighet bör iakttas när det gäller kvaliteten på protein konjugering och jämn fördelning av aAPC och CTL i 96-brunnar kultur. Med hjälp av denna metod har vi kunnat expandera CTL för mer än 8 veckor, under vilka vi utökat antigenspecifika CTL upp till en miljon gånger ^4. Det har funnits olika artificiella APC system som använder cell-linjer eller andra acellulära plattformar ^5, men enligt publicerade data varje system har sin unika profil vad gäller expansion och specificitet stödja olika applikationer. Viktigt eftersom kvaliteten på CTL är lika viktig som kvantiteten, är polyfunctionality av CMV-specifika CTL genereras av vårt system förväntas ge överlägsen antivirala effektiviteten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512