Summary
Den interstitiella celler Cajal (ICC) är pacemakern cellerna i gastrointestinal (GI) tarmkanalen. De bildar komplexa nätverk mellan glatta muskelceller och postganglionära neuronala fibrer för att reglera GI kontraktilitet. Här presenterar vi immunofluorescens metoder tvärsnitts-och hel-montera visualisering av murina ICC nätverk.
Abstract
Den interstitiella celler Cajal (ICC) är mesenkymala härrör "pacemaker celler" av gastrointestinala (GI) tarmkanalen som genererar spontana långsamma vågor som krävs för peristaltiken och medla neuronala input från det enteriska nervsystemet systemet1. Olika subtyper av ICC utgör distinkta nätverk i muscularis i mag-tarmkanalen 2,3. Förlust eller skada på dessa nätverk är förenat med en rad motilitetsrubbningar 4. ICC-celler uttrycker KIT receptorn tyrosinkinas på plasmamembranet och Kit immunfärgning har använts för de senaste 15 åren att märka ICC nätverk 5,6. Viktigt är normalt KIT verksamhet som krävs för ICC utveckling 5,6. Neoplastiska omvandlingen av ICC celler resulterar i mag-tarmcancer (GIST), som ofta hamn får-av-funktionen KIT mutationer 7,8. Vi visade nyligen att ETV1 är en släkt-specifik överlevnad faktorn uttrycks i ICC / GIST härstamning och är en mästare transkriptionell regulator behövs för både normala ICC nätverk bildas och för GIST Tumörgenesens 9. Vi visar vidare att den samarbetar med aktiverande KIT mutationer i Tumörgenesens. Här beskriver vi metoder för visualisering av ICC-nät i möss, till stor del bygger på tidigare publicerade protokoll 10,11. På senare tid har kloridkanalen anoctamin 1 (ANO1) också karaktäriseras som en specifik membran markör för ICC 11,12. På grund av deras plasmamembran lokalisering kan immunofluorescens av både proteiner kan användas för att visualisera ICC nätverk. Här beskriver vi visualisering av ICC: s nätverk fast fryst cyrosections och hela förberedelser montera.
Protocol
1. Dissekering av mus mag-tarmkanalen
- Avliva möss genom lokala IUCAC riktlinjer
- Pin varje lem på frigolit ytan och skölj buken yta med 70% etanol. Öppna bukhålan med långa mittlinjen snitt från membranet till pubis. Gör ett snitt i distala matstrupen och en andra klipp på distala tjocktarmen och ta bort mag-tarmkanalen från mage till anus i klump, noga skära ledband i tolvfingertarmen och blindtarmen med hjälp av en liten sax. Placera mag-tarmkanalen i en petriskål med PBS. Dissekera bort tarmkäx med pincett (Figur 1). Att separera magsäcken, tunntarmen och tjocktarmen, skuret i pylorus och ileocecal korsning. Skölj lumen i varje del av magtarmkanalen med PBS med hjälp av en 5 ml spruta kopplad till en matning nål (äldre möss) eller trubbig nål (yngre möss).
- Öppna magsäcken, tunntarmen och tjocktarmen längs mesenteriala gränsen. Klipp två bitar för varje del av mag-tarmkanalen, en för hela berget visualisering och en för cryosection.
2. Hela montera provberedning och immunfärgning
- Placera hela bit av varje del av mag-tarmkanalen till en 1,5 cm mikrofugrör fylld med 1,0 ml iskall aceton och prover fixa i minst 1 timme vid 4 ° C. Prov kan förvaras i upp till en vecka vid -20 ° C. Vi lagrar vanligtvis prover i aceton och fortsätta att förbereda cyrosections.
- Tvätta provet 2X med PBS. Placera provet i petriskål med PBS. Enligt dissekera miscroscope, försiktigt skrapa bort slemhinnor skikt med en skalpell genom att hålla ena änden med en pincett, lämnar muscularis.
- Muskel kan skäras i 5 mm bitar för färgning med olika antikroppar. Förvara inte mer än 2 dagar i PBS före färgning.
- Block och inkubation steg kan göras i en brunn på en 24-brunnar eller i en 1,5 ml mikrofugrör. Block med 0,5 ml blockerande buffert (5% get serum, 0,1% Triton X-100 i PBS i 1 timme vid 4 ° C).
- Inkubera med primär antikropp spätts i blockerande buffert och rotera över natten vid 4 ° C. Vi har framgångsrikt använt ACK-2 råttor anti-Kit, kanin anti-Ano1, och kanin anti-Pgp9.5 antikroppar för hela berget immunfärgning.
- Tvätta i 5 min 2X med PBS på rotator vid rumstemperatur.
- Inkubera med sekundär antikropp spätts i blockerande buffert i 2 timmar vid rumstemperatur på rotator. Vi använder vanligtvis Alexa Fluor 488 anti-kanin och Alexa Fluor 594 anti-råtta-antikroppar.
- Tvätta i 15 min 3X med PBS på rotator vid rumstemperatur.
- Montera på bild, serös sida på toppen för att säkerställa att inriktningen av vävnad under mikroskopi. Denna inriktning kommer att säkerställa serös sida att möta täckglas och uppstå först som ett fokus i bilden på ett mikroskop. Vi gör detta på ett dissekera mikroskop. Ibland undersöker vi kortfattat vävnaden i fluorescensmikroskopi att korrekt orientera. Enligt fluorescensmikroskopi att visualisera Kit eller Ano1 bör man stöta på ICC-Mitt nätverk först från sidan av täckglas. Därefter aspirera PBS så mycket som möjligt utan att torka helt. Tillsätt 50 l av hårt som montering media (vi använder Förläng Gold) och försiktigt placera locket glida ovanpå vävnad. Tillåt inställning av montering över natten vid rumstemperatur och diabilder förvaras vid -80 ° C.
- För mikroskopisk undersökning använde vi ett brett fält mikroskop med en Z-Drive. Vi använde antingen en 20X luft mål (NA 0,75, planera apochromat) eller 60X olja mål (NA 1,4, planera apochromat) och tog 2 ìm eller 1 mikrometer Z-profiler som spänner över hela muscularis. Bilderna har därefter deconvoluted med Autoquant deconvolution programvara. Alternativt har många andra använt konfokalmikroskopi istället med liknande resultat.
3. Cryosection beredning och immunfärgning
- Placera varje del av magtarmkanalen, serös nedåt, platt på filterpapper. Skär filterpapper runt vävnad. Placera vävnad på filterpapper i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (vi späda 32% paraformaldehyd i förslutna flaskan i PBS höger före användning) i 2 timmar i rumstemperatur. Fixering kan göras i en 6 - eller 12-brunnar beroende på storlek av vävnad eller i en 1,5 ml mikrofugrör. Om det görs i plåt, för att parafilm minimera PFA exponering. Längre fixering gånger kan resultera i antigen maskering, särskilt för ACK-2 anti-Kit-antikropp.
- Ta bort vävnad från PFA och placera i 30% sackaros i PBS. Låt vävnad sjunka över natten i 4 ° C.
- Jämvikt vävnad med 1:1 förhållande på 30% sackaros och oktober i 1 timme. Montera sedan vävnad vertikalt i cryomold fylld med oktober längsgående axel mag-tarmkanalen bör ske parallellt med cyrosections. Vid granskningen av möss med olika genotyper eller med olika behandlingar, kan det vara lämpligt att montera vävnad från olika möss på samma cryomold att säkerställa parallell bearbetning. Frysa på torris och placera i -80 ° C frys för förvaring.
- Skär 10 mikrometer kryosnittpå bild och förvara vid -80 ° C frys. Vi skär oftast två avsnitt per bild. Vi brukar också gör H & E färgning av en cryosection bild.
- För immunofluorescens, först balansera bilden i rumstemperatur i 15 minuter. Rita sedan cirkel runt vävnad med hjälp av PAP penna.
- Block med 150 l blockerande buffert (samma som för hela berget immunfärgning) i 1 timme.
- Aspirera blockerande buffert och tillsätt 150 l primära antikroppen spätts i blockerande buffert och inkubera över natten vid 4 ° C i en fuktig kammare.
- Tvätta 5 min 2X med PBS.
- Inkubera med sekundär antikropp spätts i blockerande buffert i 2 timmar vid rumstemperatur. Vi använder vanligtvis Alexa 488 anti-kanin och Alexa 594 anti-råtta-antikroppar.
- Tvätta i 15 min 3X med PBS.
- Aspirera bild utan helt torkning vävnad. Tillsätt en droppe av hårt som monteras media med DAPI (vi använder Förläng Gold) och placera # 1,5 täckglas. Placera bilden i rumstemperatur över natten för att ställa in och förvara i -80 ° C frys.
- Förvärva trippel fluorescens bilder med DAPI, FITC och Texas Red filter set.
4. Representativa resultat:
Här använder vi tjocktarmen som ett exempel. H & E färgning av sackaros skyddad fast frysta avsnitt används för immunofluorescens visar några artefakter jämfört med en referens paraffin avsnitt (figur 2), där den gula linjen demarks de myenteric plexus mellan cirkulära och längsgående muskler lager och den gröna demarks linjen gränsen mellan slemhinna och muscularlis. Undersöka cryosection, från slemhinnorna till slemhinnan, möter du först tunnare längsgående muskeln (LM) skikt följt av tjockare runda muskeln (CM) lager. Avsnittet bör ske parallellt med det längsgående muskeln så att atomkärnor LM bör vara något långsträckt, medan kärnan i CM bör vara liten och rund. Mellan LM och CM är myenteric plexi gjorda av nervceller som fläcken med Pgp9.5. Pgp9.5 också fläckar neuronala processer i hela GH. Den myenteric ICC-nätverket (ICC-MY) omger myenteric plexus och är tillverkade i multipolär celler. Inom den längsgående muskeln skiktet finns sällsynta intramuskulär ICCS (ICC-IMS) som är bipolära celler som körs parallellt med muskler. Inom den cirkulära muskeln skiktet finns det rikligt med ICC-IM som också är bipolär celler som löper parallellt med den cirkulära muskler och är cross-delad med denna minskning. Vid korsningen av muscularis och submucosa är submukosala ICC nätverk bestående av ICC-operatörer med betydande marknadsinflytande en platt nätverk av multipolär ICCS. Undersöka hela Mount Kit immunfärgning av tjocktarmen, bör man räkna med att stöta på ICC-Mitt nätverk först och sedan ICC-IM i CM, och ICC-SMP-nät, en fokuserar på täckglas (Figure. 3) . Volymetriska mått på ICC-nätverk med hjälp av 3D-rekonstruktion av hela montera bilder har beskrivits 10. Använda brett fält mikroskop, det finns en betydande out-of-planet fluorescens i RAW-bilder som kan tas bort efter deconvolution (Figur 3). Ofullständig strippning av slemhinnor kommer att resultera i höga bakgrundsfluorescens. ANO1 är en annan markör för ICC: s och co-immunfärgning av KIT och ANO1 uppvisar fullständig överlappning av ICC färgning (Figur 4).
Figur 1. Representant dissekeras musen mag-tarmkanalen, återges med tillstånd 13.
Figur 2. A) representant H & E färgning av musen tjocktarmen av kryosnitt beretts enligt anvisningarna och referens paraffininbäddad avsnitt visar några krymper artefakter av kryosnitt. Den gula linjen demarks de myenteric plexus och den blå linjen skiljer slemhinnan från muscularis. B) Representativa Kit (röd, ACK-2) och Pgp9.5 (grön) dubbla immunofluorescens med DAPI (blå) motfärgning av musen tjocktarmen. LM: längsgående muskler CM: cirkulära muskler. Skala bar 20 mikrometer.
Figur 3. Representant Kit (röd, ACK-2) Hela montera immunofluorescens i samma område på tre fokalplan, ICC-mitt plan på LM / CM gränsen, ICC-IM plan i CM, och ICC- SMP-plan på CM / submucosa gränsen. RAW-bilder och deconvoluted bilder visas. Skala bar 20 mikrometer.
Figur 4. Representant dubbel-immunofluorescens av Ano1 (grön) och Kit (röd, ACK-2) i tjocktarmen. Skala bar 20 mikrometer.
Discussion
Interstitiella celler Cajal var inledningsvis präglats av Santiago Ramóón y Cajal exakt ett sekel sedan med metylenblått och silver kromat fläckar av gastrointestinala muscularis. Cajal trodde initialt ICC-talet var nervceller utifrån sina processer som påminner om axoner och dendriter. Under många efterföljande år har studiet av ICC biologi varit begränsad genom avsaknaden av specifika markörer fram till upptäckten av att KIT inte bara uttrycks i ICC, men också för deras utveckling 6. Sedan dess har KIT immunofluorescens använts i stor utsträckning att studera ICC biologi och har också lett till uppskattning av ICC i andra kontraktila organ såsom urinblåsan. Nyligen har ANO1 identifierats som en andra pålitlig ICC markör.
Det har varit ett flertal publikationer under de senaste 15 åren med hjälp av immunofluorescens för att identifiera ICC med hjälp av olika fixering och montering tekniker. I våra händer "fast fryst" kryosnitt som har prefixet paraformaldehyd och sackaros skyddade verk bäst jämfört med aceton eller paraformaldehyd efter fixering efter cryosectioning. För hela fästen, har vi funnit att aceton fixation följt av slemhinnor dissektion ger den mest robusta resultat.
Historiskt har ACK-2 varit Kit-antikropp i valet för mus ICC identifiering. Det är en råtta monoklonal som erkänner den extracellulära domänen och det är också en blockerande antikropp som orsakar ileus givet att leva möss. Dock är ACK-2 epitopen långsamt förstörs av paraformaldehyd fixering och inte räddas av standardmetoder antigenåtervinning. Vi har funnit att det ACK-4 epitopen är mer motståndskraftig mot paraformaldehyd fixering. Jämfört med fasta frysta block och sektioner, paraffininbäddade block och sektioner bevarar morfologi bättre och är bättre lämpad för långtidslagring (Figur 4). Varken ACK-2 eller ACK-4 har framgångsrikt använts i paraffin. Vi har präglats att D13A2, en ny kanin monoklonal antikropp, fungerar utmärkt i både fast-frusna och paraffin i mag-tarmkanalen.
Kit uttrycks i flera andra celltyper, inklusive melanocyterna, hematopoetiska celler, könsceller, särskilt mastceller, som också finns i mag-tarmkanalen. Lyckligtvis är de flesta mastceller funnit är slemhinnan och inte i muscularis. Dubbel färgning med kanin anti-Ano1 och råtta anti-Kit kan eliminera icke-specifik färgning av varje antikropp (Figur 4). Det är också värt att notera att den relativa uttrycket av Kit och Ano1 mellan subklasser till ICC verkar annorlunda. Till exempel, i tunntarmen, är Kit färgning mycket mer intensivt i myenteric ICC jämfört med ICC i den djupa muskeln plexus medan Ano1 färgning är jämförbar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Cancer Institute (K08CA140946 till YC), (5F32CA130372, till PC), (R01CA102774 och R01HL055748 till PB), försvarsdepartementet (PC094302 till YC), den Shuman Familj fonden för GIST forskning (till PC) och Starr Cancer Consortium (till PC, YC, CLS och PB). Vi vill tacka Katia MANOVA, Ning Fläkt och Mesurh Turkekul av MSKCC molekylär Cytologi core facilitet för hjälp med cryosectioning och immunfärgning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , Forthcoming (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
