Summary
De interstitiële cellen van Cajal (ICC) zijn de pacemaker cellen van het gastro-intestinale (GI) stelsel. Ze vormen complexe netwerken tussen gladde spiercellen en postganglionaire neuronale vezels GI contractiliteit te reguleren. Hier presenteren wij immunofluorescentie methoden cross-sectionele en hele-mount visualisatie van muriene ICC-netwerken.
Abstract
De interstitiële cellen van Cajal (ICC) zijn mesenchymale afgeleid "pacemaker cellen" van het gastro-intestinale (GI) stelsel, dat spontane trage golven die nodig zijn voor peristaltiek genereren en bemiddelen neuronale input van het enterisch zenuwstelsel systeem1. Verschillende subtypes van ICC formulier verschillende netwerken in de muscularis van het maagdarmkanaal 2,3. Verlies of schade aan deze netwerken wordt in verband gebracht met een aantal motiliteitsstoornissen 4. ICC-cellen brengen de KIT-receptor tyrosine kinase op de plasmamembraan en KIT immunokleuring is gebruikt voor de afgelopen 15 jaar aan het ICC-netwerk 5,6 label. Belangrijker is, is normaal KIT activiteit die nodig zijn voor het ICC ontwikkeling van 5,6. Neoplastische transformatie van ICC-cellen resulteert in gastro-intestinale stromale tumor (GIST), die vaak haven gain-of-function KIT mutaties 7,8. We hebben onlangs aangetoond dat ETV1 is een lijn-specifieke overleving factor, uitgedrukt in het ICC / GIST afkomst en is een meester in transcriptionele regulator die nodig zijn voor zowel de normale ICC-netwerk voor vorming en van GIST tumorigenese 9. We verder aantonen dat het samenwerkt met activerende KIT mutaties in ontstaan van tumoren. Hier beschrijven we methoden voor het visualiseren van de ICC-netwerken in muizen, grotendeels gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen 10,11. Meer recent heeft het chloride kanaal anoctamin 1 (ANO1) ook gekenmerkt als een specifieke marker membraan van ICC 11,12. Door hun plasmamembraan lokalisatie, kan immunofluorescentie van beide eiwitten worden gebruikt om de ICC-netwerken te visualiseren. We beschrijven hier visualisatie van de ICC-netwerken door vaste-ingevroren cyrosections en hele berg preparaten.
Protocol
1. Dissectie van de muis maagdarmkanaal
- Gedood muizen door de lokale IUCAC richtlijnen
- Pin elke ledemaat op piepschuim oppervlak en spoel buik oppervlak met 70% ethanol. Open buikholte met lange middellijn incisie vanuit het middenrif tot schaambeen. Maak een snede in de distale slokdarm en een tweede snede bij de distale dikke darm en verwijder het spijsverteringskanaal van maag tot anus en bloc, zorgvuldig snijden ligamenten aan de twaalfvingerige darm en blindedarm met behulp van een klein schaartje. Plaats spijsverteringskanaal in een petrischaaltje met PBS. Ontleden weg mesenterium met een pincet (Figuur 1). De maag, dunne darm en dikke darm, knippen bij pylorus en Bauhin knooppunt te scheiden. Spoel het lumen van elk deel van het maagdarmkanaal met PBS met behulp van een 5ml spuit bevestigd aan een voeding naald (oudere muizen) of stompe naald (jongere muizen).
- Open maag, dunne darm en dikke darm langs de mesenteriale grens. Knip twee stukken voor elk deel van het maagdarmkanaal, een voor de ganse berg visualisatie en een voor cryosection.
2. Hele monteren monstervoorbereiding en immunokleuring
- Plaats het hele stuk van elk deel van maag-darmkanaal in een 1,5 cm microfugebuisje gevuld met 1,0 ml ijskoude aceton en vast monsters voor ten minste 1 uur bij 4 ° C. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 week bij -20 ° C. We meestal slaan monsters in aceton en ga verder met cyrosections voor te bereiden.
- Was monster 2X met PBS. Plaats monster in petrischaal met PBS. Onder ontleden microscoop, voorzichtig afschrapen mucosale laag met een scalpel door de holding een uiteinde met een pincet, het verlaten van de muscularis.
- Spier kan worden gesneden in 5mm stuks voor kleuring met verschillende antilichamen. Niet opslaan voor meer dan 2 dagen in PBS voor de kleuring.
- Blok en incubatie stappen kunnen worden gedaan in een putje van een 24-well plaat of in een 1,5 ml microfugebuis. Blok met 0,5 ml van het blokkeren van buffer (5% geit serum, 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij 4 ° C).
- Incubeer met primaire antilichaam verdund in de blokkeerbuffer en draait overnacht bij 4 ° C. We hebben met succes gebruikt ACK-2 rat anti-Kit, konijn anti-Ano1, en konijn anti-Pgp9.5 antilichamen voor ganse berg immunokleuring.
- Was gedurende 5 min. 2x met PBS op rotator bij kamertemperatuur.
- Incubeer met secundaire antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op rotator. Wij gebruiken meestal de Alexa Fluor 488 anti-konijn en Alexa Fluor 594 anti-rat antilichamen.
- Was gedurende 15 min 3X met PBS op rotator bij kamertemperatuur.
- Mount op dia, sereuze kant op de top om de oriëntatie van de weefsels te garanderen tijdens microscopie. Deze oriëntatie zal zorgen voor de sereuze kant naar de dekglaasje gezicht en eerst worden aangetroffen als een zich richt op de dia op een microscoop. We doen dit op een dissectie microscoop. Soms hebben we kort ingegaan op het weefsel onder fluorescentie microscopie goed te oriënteren. Onder fluorescentie microscopie aan Kit of Ano1 visualiseren, moet een eerste ontmoeting van de ICC-MY netwerk van de kant van de dekglaasje aan. Vervolgens aspiratie PBS zoveel mogelijk zonder dat het volledig drogen. Voeg 50 ul van harde set monteren media (we gebruiken Verleng Gold) en voorzichtig plaats dekglas op de top van het weefsel. Laat instelling van de montage 's nachts bij kamertemperatuur en op te slaan dia's bij -80 ° C.
- Voor microscopisch onderzoek hebben we gebruik gemaakt van een wide-veld microscoop met een Z-drive. We gebruikten ofwel een 20X lucht doelstelling (NA 0,75, plan apochromat) of 60X olie doelstelling (NA 1,4, plan apochromat) en nam 2 urn of een urn Z-profielen, dat beslaat het hele muscularis. De beelden werden vervolgens met behulp van deconvoluted Autoquant deconvolutie software. Als alternatief zijn er vele anderen gebruikt confocale microscopie in plaats daarvan met vergelijkbare resultaten.
3. Cryosection voorbereiding en immunokleuring
- Plaats elk deel van het maagdarmkanaal, de sereuze naar beneden, plat op filtreerpapier. Cut filter papier om het weefsel. Plaats tissue op filtreerpapier in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS (we 32% paraformaldehyde verdunnen in verzegelde flacon op in PBS vlak voor gebruik) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Fixatie kan worden gedaan in een 6 - of 12-well plaat afhankelijk van de grootte van het weefsel, of in een 1,5 ml microfugebuis. Indien het wordt gedaan in de plaat, tot een minimum te beperken parafilm PFA blootstelling. Langere fixatie tijden kan dit leiden tot antigeen maskeren, met name voor de ACK-2 anti-Kit antilichaam.
- Verwijderen weefsel van PFA en plaats in 30% sucrose in PBS. Laat weefsel een nacht zinken in 4 ° C.
- Evenwicht weefsel met 1:1 verhouding van 30% sucrose en de LGO gedurende 1 uur. Dient vervolgens verticaal te monteren weefsel in cryomold gevuld met oktober De lengteas van het maagdarmkanaal moet worden parallel met de cyrosections. Bij de behandeling van muizen met verschillende genotypes of met verschillende behandelingen, kan het nuttig zijn om weefsel monteren van verschillende muizen op dezelfde cryomold om parallelle verwerking te waarborgen. Freeze op droog ijs en plaats in de -80 ° C vriezer voor de opslag.
- Snij 10 urn vriescoupesop glijbaan en bewaar bij -80 ° C vriezer. We meestal gesneden uit twee delen per slide. We hebben ook meestal uit te voeren H & E kleuring van een cryosection dia.
- Voor immunofluorescentie, eerst evenwicht glijbaan bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Teken cirkel rond weefsel met behulp van PAP pen.
- Blok met 150 ul van het blokkeren van buffer (dezelfde als voor de gehele montage immunokleuring) gedurende 1 uur.
- Aspireren blokkeerbuffer en voeg 150 ul primair antilichaam verdund in de blokkeerbuffer en incubeer overnacht bij 4 ° C in een bevochtigde kamer.
- Was 5 min 2x met PBS.
- Incubeer met secundaire antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Wij gebruiken meestal de Alexa 488 anti-konijn en Alexa 594 anti-rat antilichamen.
- Was gedurende 15 minuten 3x met PBS.
- Aspireren glijden zonder dat het volledig drogen weefsel. Voeg een druppel harde set montage media met DAPI (we gebruiken Verleng Gold) en plaats # 1.5 dekglaasje aan. Plaats glijbaan bij kamertemperatuur gedurende de nacht in te stellen en op te slaan in de -80 ° C vriezer.
- Acquire triple fluorescentie beelden met behulp van DAPI, FITC, en Texas Red filter sets.
4. Representatieve resultaten:
Hier gebruiken we de dikke darm als een voorbeeld. H & E kleuring van een sucrose beschermde vaste vriescoupe gebruikt voor immunofluorescentie toont enkele artefacten in vergelijking met een referentie-paraffine gedeelte (figuur 2), waar de gele lijn markeert de myenterische plexus tussen de circulaire en longitudinale spieren lagen en de groene lijn markeert de grens tussen de mucosa en muscularlis. Het onderzoeken van de cryosection, van de serosa tot mucosa, moet je eerst kennis met de dunnere longitudinale spier (LM) laag, gevolgd door de dikkere ronde spier (CM) laag. De sectie moet in parallel met de longitudinale spieren, zodat de kernen van LM moet enigszins worden verlengd, terwijl de kernen van de CM moeten klein en rond. Tussen de LM en CM zijn myenterische plexi gemaakt van neuronen die vlek met Pgp9.5. Pgp9.5 ook vlekken neuronale processen in de CM. De myenterische ICC-netwerk (ICC-MY) omringen de myenterische plexus en zijn gemaakt van multipolaire cellen. Binnen de longitudinale spierlaag, zijn er zeldzame intramusculaire ICC (ICC-IMS) die bipolaire cellen lopen parallel met de spier. Binnen de cirkelvormige spierlaag, zijn er in overvloed ICC-IMS, die ook bipolaire cellen die parallel lopen met de ronde spier en zijn cross-delig met deze verlaging. Op de kruising van de muscularis en submucosa, de submucosale ICC netwerk van ICC-SMP is een vlakke netwerk van multipolaire ICC. Het onderzoeken van de hele berg Kit immunokleuring van de dikke darm, moet men verwachten dat de ICC-MY-netwerk eerste ontmoeting, en vervolgens de ICC-IM van de CM, en de ICC-SMP-netwerken, als een zich vanaf het dekglaasje (Figure. 3) . Volumetrische meten van ICC-netwerken met behulp van 3D-reconstructie van de hele berg foto's zijn beschreven 10. Het gebruik van wide-field microscoop, er aanzienlijke out-of-plane fluorescentie in de ruwe beelden die kunnen worden verwijderd na deconvolutie (figuur 3). Onvolledige strippen van de mucosa zal resulteren in hoge achtergrond fluorescentie. ANO1 is een andere marker van ICC en co-immunokleuring van KIT en ANO1 toont volledige overlap van ICC kleuring (figuur 4).
Figuur 1. Vertegenwoordiger ontleed muis maag-darmkanaal, met toestemming overgenomen 13.
Figuur 2. A) Representatieve H & E kleuring van de muis dikke darm van vriescoupes bereid zoals beschreven en referentie in paraffine ingebedde sectie laten zien krimpen artefacten van vriescoupes. De gele lijn markeert de myenterische plexus en de blauwe lijn scheidt het slijmvlies van de muscularis. B) Representatieve Kit (rood, ACK-2) en Pgp9.5 (groen) dubbele immunofluorescentie met DAPI (blauw) tegenkleuring van de muis dikke darm. LM: longitudinale spieren CM: kringspier. Schaalbalk 20 urn.
Figuur 3. Vertegenwoordiger Kit (rood, ACK-2) hele-mount immunofluorescentie van hetzelfde veld op drie centrale vliegtuigen, het ICC-mijn vliegtuig bij de LM / CM grens, het ICC-IM vliegtuig in de CM, en het ICC- SMP vliegtuig op de CM / submucosa grens. RAW-beelden en deconvoluted beelden worden getoond. Schaalbalk 20 urn.
Figuur 4. Representatieve dubbele immunofluorescentie van Ano1 (groen) en Kit (rood, ACK-2) in de dikke darm. Schaalbalk 20 urn.
Discussion
Interstitiële cellen van Cajal werden aanvankelijk gekenmerkt door Santiago Ramóón y Cajal precies een eeuw geleden met behulp van methyleenblauw en zilver chromaat vlekken van gastro-intestinale muscularis. Cajal in eerste instantie gedacht ICC werden neuronen op basis van hun processen, die doen denken aan axonen en dendrieten. Gedurende vele jaren daarna, heeft studie van ICC biologie beperkt door het ontbreken van specifieke markers tot de ontdekking van die KIT niet alleen uitgedrukt in ICC, maar is ook nodig voor hun ontwikkeling 6. Sindsdien is KIT immunofluorescentie op grote schaal gebruikt in de studie van ICC biologie en heeft ook geleid tot de waardering van ICC in andere contractiele organen zoals de blaas. Onlangs heeft ANO1 is geïdentificeerd als een seconde betrouwbare ICC marker.
Er zijn tal van publicaties over de afgelopen 15 jaar met behulp van immunofluorescentie om ICC te identificeren met behulp van verschillende fixatie en montage technieken. In onze handen "fixed-bevroren 'vriescoupes die zijn voorafgegaan door paraformaldehyde en beschermd sucrose werkt het beste in vergelijking met aceton of paraformaldehyde post-fixatie na cryosectioning. Voor de hele mounts, hebben we ontdekt dat aceton fixatie gevolgd door mucosale dissectie van de meest robuuste resultaten geeft.
Historisch gezien is de ACK-2 is de Kit antilichaam van de keuze voor de muis ICC identificatie. Het is een monoklonaal rat die de extracellulaire domein herkent en het is ook een blokkerende antistof die ileus veroorzaakt bij toediening aan muizen leven. Echter, de ACK-2 epitoop langzaam vernietigd door paraformaldehyde fixatie en wordt niet gered door standaard antigen retrieval methoden. We hebben gevonden dat de ACK-4 epitoop is beter bestand tegen paraformaldehyde fixatie. In vergelijking met vaste bevroren blokken en secties, in paraffine ingebedde blokken en secties behoudt morfologie beter en is meer vatbaar voor lange termijn archivering (figuur 4). Noch ACK-2, noch ACK-4 met succes gebruikt in paraffine secties. We hebben gekenmerkt dat D13A2, een nieuw konijn monoklonaal antilichaam, werkt uitstekend in zowel vaste-bevroren en paraffine secties van het maag-darmkanaal.
Kit is uitgedrukt in verschillende andere typen cellen, inclusief melanocyten, hematopoietische cellen, geslachtscellen, en in het bijzonder mestcellen, die ook zijn te vinden in het maag-darmkanaal. Gelukkig zijn de meeste mestcellen gevonden is het slijmvlies en niet in de muscularis. Dubbele kleuring met konijnen anti-Ano1 en rat anti-Kit kan elimineren niet-specifieke kleuring van elk antilichaam (figuur 4). Het is ook vermeldenswaard dat de relatieve expressie van Kit en Ano1 tussen subklassen van ICC verschillende lijkt. Bijvoorbeeld, in de dunne darm, Kit kleuring is veel intenser in myenterische ICC in vergelijking met ICC van de diepe spieren plexus terwijl Ano1 kleuring is vergelijkbaar.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute (K08CA140946, tot YC), (5F32CA130372, naar PC), (R01CA102774 en R01HL055748 naar PB), het Ministerie van Defensie (PC094302 naar YC), het Shuman Family Fonds voor GIST Onderzoek (naar PC), en het Starr Kanker Consortium (naar PC, YC, CLS en PB). We willen graag Katia MANOVA, Ning Fan, en Mesurh Turkekul van de MSKCC Moleculaire Cytologie kernfaciliteit bedanken voor hun hulp bij cryosectioning en immunokleuring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , Forthcoming (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
