Summary
התאים ביניים של קחאל (ICC) הם תאים של מערכת קוצב לב (GI) במערכת העיכול. הם יוצרים רשתות מורכבות בין לתאי שריר חלק ופוסט ganglionic סיבים עצביים להסדיר contractility העיכול. כאן, אנו מציגים שיטות immunofluorescence חתך שלם הר ויזואליזציה של Murine רשתות ICC.
Abstract
התאים ביניים של קחאל (ICC) הם mesenchymal נגזר "תאים קוצב לב" בדרכי (GI) במערכת העיכול שיוצרים גלים איטיים ספונטנית נדרש תנועה פריסטלטית לתווך קלט עצבי מ system1 העצבים enteric. תת שונים של ICC טופס רשתות נפרדות muscularis של מערכת העיכול 2,3. אובדן או פציעה של רשתות אלה קשורה עם מספר רב של הפרעות תנועתיות 4. תאים ICC לבטא את הקולטן KIT טירוזין קינאז על הממברנה פלזמה KIT immunostaining שימש במשך 15 השנים האחרונות לתווית רשת ICC 5,6. חשוב לציין, הפעילות KIT נורמלי נדרש ICC פיתוח 5,6. שינוי Neoplastic של ICC תוצאות תאים סרטניים סטרומה העיכול (GIST), כי לעתים קרובות הנמל רווח של פונקציה מוטציות KIT 7,8. אנחנו לאחרונה הראה כי ETV1 הוא גורם השושלת הישרדות ספציפית לידי ביטוי בשושלת ICC / GIST והוא רגולטור תעתיק הנדרש להיווצרות הן ICC נורמלי עבור רשת של tumorigenesis GIST 9. בנוסף, אנו להוכיח שהיא משתפת פעולה עם הפעלת מוטציות KIT ב tumorigenesis. כאן אנו מתארים שיטות הדמיה של רשתות ICC בעכברים, המבוססת בעיקרה על הפרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. לאחרונה, ערוץ כלוריד anoctamin 1 (ANO1) יש גם מאופיין כסמן קרום מסוים של ICC 11,12. בגלל לוקליזציה שלהן פלזמה הממברנה, immunofluorescence של חלבונים גם יכול לשמש כדי להמחיש את רשתות ICC. כאן אנו מתארים להדמיה של רשתות ICC ידי קבועה קפוא cyrosections וההכנות הר שלם.
Protocol
1. Dissection של העכבר בדרכי העיכול
- בעכברים מורדמים ידי הנחיות IUCAC המקומי
- פין כל איבר על משטח קלקר ולשטוף פני הבטן עם אתנול 70%. פתיחת חלל הבטן עם חתך קו האמצע ארוכה הסרעפת אל חיק. בצע חתך אחד על הוושט הדיסטלית לבין חתך השני המעי הגס הדיסטלי ולהסיר את מערכת העיכול מן הקיבה אל פי הטבעת כמקשה אחת, בזהירות חיתוך הרצועות על התריסריון ו cecum באמצעות מספריים קטנים. מקום בדרכי העיכול בצלחת פטרי עם PBS. לנתח משם mesentery באמצעות פינצטה (איור 1). כדי להפריד הקיבה, המעי הדק, המעי הגס ו, לחתוך את השוער צומת ileocecal. שוטפים את לומן של כל חלק במערכת העיכול עם PBS באמצעות מזרק 5 מ"ל מצורף מחט האכלה (עכברים מבוגרים) או מחט קהה (עכברים צעירים).
- הבטן הפתוחה, המעי הדק, המעי הגס ו לאורך הגבול mesenteric. חותכים שתי חתיכות עבור כל חלק של מערכת העיכול, אחד עבור להדמיה הר שלם ואחד cryosection.
2. הכנה שלמות הר מדגם immunostaining
- מניחים את נתח שלם של כל חלק של מערכת העיכול לתוך צינור 1.5 ס"מ microfuge מלא של 1.0 מ"ל אצטון קרח קר דגימות לתקן במשך שעה לפחות 1 ב 4 ° C. דוגמאות ניתן לאחסן עד 1 שבוע -20 ° C. אנחנו בדרך כלל לאחסן דגימות אצטון להמשיך להכין cyrosections.
- לשטוף 2X מדגם עם PBS. מניחים בצלחת פטרי מדגם עם PBS. תחת לנתח miscroscope, בזהירות לגרד שכבת הרירית עם אזמל ידי החזקת קצה אחד עם פינצטה, עוזב את muscularis.
- שרירים ניתן לחתוך לחתיכות 5mm עבור מכתים עם נוגדנים שונים. אין לאחסן יותר מ 2 ימים לפני PBS מכתים.
- צעדים חסום הדגירה יכול להיעשות באחת היטב צלחת 24 באר או בצינור microfuge 1.5ml. בלוק עם 0.5 מ"ל של חיץ חסימה (נסיוב עיזים 5%, 0.1% Triton X-100 ב PBS שעה 1 ב 4 ° C).
- דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל חסימת חיץ ולסובב לילה בשעה 4 ° C. השתמשנו בהצלחה ACK-2 עכברוש אנטי קיט, ארנבת אנטי Ano1, ואנטי Pgp9.5 ארנב נוגדנים immunostaining הר שלם.
- שטפו במשך 5 דקות 2X עם PBS על הכתף בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם נוגדנים משני מדולל חיץ חסימת עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר על הכתף. אנו משתמשים בדרך כלל אלקסה פלואוריד 488 נגד ארנב אלקסה פלואוריד 594 אנטי עכברוש נוגדנים.
- שטפו במשך 15 דקות 3X עם PBS על הכתף בטמפרטורת החדר.
- הר בשקופית, לצד serosal על מנת להבטיח את הכיוון של רקמות במהלך במיקרוסקופ. אוריינטציה זו תבטיח את הצד serosal להתמודד coverslip ולהיות נתקל בה לראשונה כאחד מתמקד לשקופית על מיקרוסקופ. אנו עושים זאת על מיקרוסקופ לנתח. לפעמים אנחנו בקצרה לבחון את הרקמה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי להתמצא כראוי. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין קיט או Ano1, יש המפגש ICC-MY הרשת הראשונה מהצד של coverslip. בשלב הבא, לשאוב PBS ככל האפשר מבלי לייבש לחלוטין. הוסף 50 μl של התקשורת מוגדר קשה הרכבה (אנו משתמשים להאריך זהב) ומניחים בעדינות להחליק לכסות על גבי רקמות. אפשר הגדרה של הרכבה לילה בטמפרטורת החדר שקופיות חנות ב -80 ° C.
- עבור בדיקה מיקרוסקופית, אנו השתמשו במיקרוסקופ שדה רחב עם Z-Drive. השתמשנו גם מטרה 20X אוויר (NA 0.75, apochromat התוכנית) או אובייקטיבי שמן 60x (NA 1.4, apochromat התוכנית) ולקח 2 מיקרומטר או 1 מיקרומטר Z-הסעיפים ההיקף muscularis כולו. התמונות היו deconvoluted לאחר מכן באמצעות תוכנת deconvolution Autoquant. לחלופין, רבים אחרים השתמשו במיקרוסקופ confocal במקום עם תוצאות דומות.
3. Cryosection הכנה immunostaining
- מניחים כל חלק של מערכת העיכול, לצד serosal למטה, שטוח על נייר הסינון. חותכים נייר לסנן סביב הרקמה. מקום הרקמה על הנייר מסנן paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS (אנחנו לדלל paraformaldehyde 32% בקבוקון חתום לתוך PBS ממש לפני השימוש) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. קיבוע ניתן לעשות 6 - או 12 גם צלחת בהתאם לגודל של רקמות, או בצינור מ"ל 1.5 microfuge. אם נעשה צלחת, parafilm כדי לצמצם את החשיפה PFA. פעמים קיבוע ארוך יותר עלול לגרום מיסוך אנטיגן, במיוחד עבור הנוגדן אנטי Kit ACK-2.
- הסרה של רקמה PFA ומניחים סוכרוז 30% ב-PBS. אפשר רקמות לשקוע לילה 4 ° C.
- לאזן רקמות עם יחס של 1:01 סוכרוז 30% עבור אוקטובר 1 שעה. ואז הר רקמות אנכית cryomold מלא אוקטובר ציר האורך של מערכת העיכול צריכה להיות במקביל cyrosections. כאשר בוחנים עכברים עם גנוטיפים שונים או עם טיפולים שונים, זה עשוי להיות שימושי לעלות רקמות מעכברים שונים על cryomold אותו כדי להבטיח עיבוד מקבילי. Freeze על הקרח במקום יבש במקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
- גזור cryosections 10 מיקרומטרלשקופית ולאחסן במקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. בדרך כלל אנחנו לחתוך לשני חלקים לכל שקופית. כמו כן, אנו בדרך כלל לבצע H & E מכתים שתי שקופיות cryosection.
- עבור immunofluorescence, תחילה לאזן שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. ואז לצייר עיגול סביב רקמות באמצעות עט PAP.
- בלוק עם 150 μl של חיץ חסימה (זהה עבור immunostaining הר שלם) עבור 1 שעה.
- לשאוב חיץ חסימת ולהוסיף 150 נוגדן ראשוני μl מדולל חסימת חיץ דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified.
- לשטוף 5 דקות 2X עם PBS.
- דגירה עם נוגדנים משני מדולל חסימת חיץ עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. אנו משתמשים בדרך כלל אלקסה 488 נגד ארנב אלקסה 594 אנטי עכברוש נוגדנים.
- שטפו במשך 15 דקות 3X עם PBS.
- לשאוב שקופיות ללא לחלוטין ייבוש רקמות. הוסף טיפה של קבוצה קשה גובר בתקשורת עם DAPI (אנו משתמשים להאריך זהב) ומקום # 1.5 coverslip. מקום להחליק בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לקבוע ולאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
- לרכוש תמונות פלואורסצנציה משולשת באמצעות DAPI, FITC, וטקסס האדום קובע הסינון.
4. נציג תוצאות:
כאן, אנו משתמשים המעי הגס כדוגמה. H & E כתם של סוכרוז מוגן קבוע בסעיף קפוא המשמש immunofluorescence מראה ממצאים מסוימים לעומת סעיף התייחסות פרפין (איור 2), שם הקו הצהוב מסמן מקלעת myenteric בין שכבות השריר מעגלי האורך ואת מסמן הקו הירוק את הגבול בין רירית muscularlis. בחינת cryosection, מן serosa כדי רירית, אתה הראשון המפגש שריר רזה האורך (LM) שכבת ואחריו שכבת השריר עבה עגול (CM). הסעיף צריך להיות במקביל שריר האורך כך גרעינים של LM צריך להיות מוארך מעט בעוד גרעינים של סי צריך להיות קטן ועגול. בין LM ו CM הם plexi myenteric עשויים נוירונים עם כתם Pgp9.5. Pgp9.5 גם כתמים תהליכים עצביים לאורך CM. Myenteric ICC רשת (ICC-MY) מקיפים את מקלעת myenteric והם עשויים תאים קוטבי. בתוך שכבת השריר האורך, יש נדירים ICCs תוך שרירית (IMS-ICC) שהם תאים דו קוטבית פועל במקביל השריר. בתוך שכבת השריר מעגלי, יש שפע של ICC-IMS שגם הם תאים דו קוטבית הפועלות במקביל השריר עגולים הם בחתך לחתוך עם זה. בצומת של muscularis ו submucosa, רשת submucosal ICC המורכב ICC-SMPs היא רשת שטוחה של ICCs קוטבי. בחינת ערכת הר שלם immunostaining של המעי הגס, יש לצפות במפגש ICC-MY הרשת הראשונה, ולאחר מכן את ICC-IM של CM, ואת ICC-SMP ברשתות, כמו אחד מתמקד מן coverslip (Figure. 3) . למדוד נפחית של רשתות ICC באמצעות שחזור 3D של כל הר תמונות תוארו 10. שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ, יש הקרינה משמעותית מחוץ למטוס בתמונות הגלם אשר ניתן להסירו לאחר deconvolution (איור 3). הושלמה הפשטה של רירית תגרום הקרינה רקע גבוה. ANO1 עוד סמן של ICC של ושיתוף immunostaining של קיט ANO1 מראה חפיפה מלאה של הכתמה ICC (איור 4).
נציג באיור 1. גזור בדרכי העיכול העכבר, והודפס מחדש באישור 13.
איור 2.) נציג H & E מכתים של המעי עכבר גדול של cryosections מוכן כמתואר ונפט התייחסות בסעיף מוטבע מראה כמה חפצים הצטמקות של cryosections. הקו הצהוב מסמן מקלעת myenteric לבין הקו הכחול המפריד בין רירית מן muscularis. ב) נציג Kit (אדום, ACK-2) ו Pgp9.5 (ירוק) immunofluorescence כפול עם counterstaining (כחול) DAPI של המעי עכבר גדול. LM: CM אורך השריר: שריר עגול. סולם בר 20 מיקרומטר.
איור 3. נציג Kit (אדום, ACK-2) כל הר immunofluorescence של אותו שדה בשלושה מטוסי מוקד, ICC-MY מטוס בגבול LM / CM, המטוס ICC-IM ב CM, ואת ICC- SMP מטוס בגבול CM / submucosa. תמונות גלם תמונות deconvoluted מוצגים. סולם בר 20 מיקרומטר.
איור 4. הנציג פעמיים immunofluorescence של Ano1 (ירוק) קיט (אדום, ACK-2) בתוך המעי הגס. סולם בר 20 מיקרומטר.
Discussion
תאים ביניים של קחאל התאפיינו תחילה על ידי סנטיאגו Ramóón אי חז'אל בדיוק לפני מאה שנה באמצעות כחול וכסף מתילן כרומטי כתמי muscularis העיכול. קחאל בהתחלה חשבתי ICC היו של נוירונים המבוססת על התהליכים שלהם המזכירים אקסונים דנדריטים. במהלך השנים שלאחר מכן רבים, המחקר של בית הדין הפלילי הבינלאומי ביולוגיה הוגבל על ידי חוסר סמנים ספציפיים עד גילוי KIT כי לא רק מתבטא ICC, אך נדרש גם עבור הפיתוח שלהם 6. מאז, KIT immunofluorescence כבר בשימוש נרחב במחקר של ICC ביולוגיה הובילה גם הערכה של ICC באיברים אחרים כגון התכווצות שלפוחית השתן. לאחרונה, ANO1 זוהה הסמן השני ICC אמין.
היו פרסומים רבים על פני 15 השנים האחרונות באמצעות immunofluorescence לזהות ICC באמצעות קיבוע שונים וטכניקות הרכבה. בידיים שלנו "קבוע קפוא" cryosections כי כבר ולפניה paraformaldehyde ו סוכרוז מוגן עובד בהשוואה הטובה ביותר אצטון או paraformaldehyde שלאחר קיבוע לאחר cryosectioning. עבור mounts כולו, מצאנו כי הקיבעון אצטון ואחריו לנתיחה הרירית נותן את התוצאות הכי חזקים.
מבחינה היסטורית, ACK-2 כבר את ערכת נוגדן הבחירה של העכבר ICC זיהוי. זוהי חולדה חד שבטיים המכירה תחום תאי וזה גם נוגדן חסימת שגורם ileus כאשר נתון לחיות עכברים. עם זאת, epitope ACK-2 הוא נהרס לאט על ידי קיבוע paraformaldehyde ואינו חולץ על ידי שיטות אחזור תקן אנטיגן. מצאנו כי epitope ACK-4 עמיד יותר קיבעון paraformaldehyde. לעומת בלוקים קפואים סעיפים קבועים, בלוקים פרפין מוטבע וחתכים משמר מורפולוגיה טוב יותר הוא נוח יותר לטווח ארוך אחסון (איור 4). לא ACK-2 ולא ACK-4 שימשו בהצלחה בסעיפים פרפין. יש לנו מאופיין כי D13A2, נוגדן חד שבטי ארנב חדש, עובד מצוין בשני חלקים קבועה קפוא פרפין של מערכת העיכול.
ערכת מתבטא בכמה סוגי תאים אחרים, ובהם המלנוציטים, תאים hematopoietic, בתאי הנבט, וכן תא הפיטום מסוים אשר נמצאים גם במערכת העיכול. למרבה המזל, תא הפיטום ביותר נמצאים היא רירית ולא muscularis. צביעה כפולה עם ארנבת אנטי Ano1 ואת עכברוש אנטי ערכת יכולים לחסל הלא ספציפית של נוגדן כל מכתים (איור 4). זה גם ראוי לציין כי את הביטוי היחסי של קיט Ano1 בין subclasses של ICC נראה שונה. לדוגמה, במעי הדק, מכתים קיט היא הרבה יותר אינטנסיבי בכאל myenteric לעומת ICC של השריר מקלעת עמוק בעוד Ano1 מכתים דומה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (K08CA140946, כדי י"ס), (5F32CA130372, למחשב), (ו R01CA102774 R01HL055748 על PB), משרד הביטחון (PC094302 אל י"ס), קרן משפחת שומן למחקר GIST (ל PC), לבין קונסורציום סרטן סטאר (למחשב, י"ס, CLS ו PB). ברצוננו להודות קטיה Manova, מניפה נינג, ו Mesurh Turkekul של מתקן הגרעין MSKCC מולקולרית ציטולוגיה לעזרה עם cryosectioning ו immunostaining.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , Forthcoming (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
