Summary
Cajal (आईसीसी) के बीचवाला कोशिकाओं जठरांत्र संबंधी मार्ग (जीआई) के पेसमेकर की कोशिकाओं रहे हैं. वे चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाद ganglionic neuronal सैनिक सिकुड़ना विनियमित फाइबर के बीच जटिल नेटवर्क के रूप में. यहाँ, हम immunofluorescence पार के अनुभागीय तरीकों और पूरे माउंट murine आईसीसी नेटवर्क के दृश्य प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Cajal (आईसीसी) के बीचवाला कोशिकाओं mesenchymal व्युत्पन्न जठरांत्र (सैनिक) पथ है कि सहज धीमी peristalsis के लिए आवश्यक तरंगों को पैदा करते हैं और आंतों का तंत्रिका system1 से neuronal इनपुट मध्यस्थता के "पेसमेकर कोशिकाओं" हैं. आईसीसी के विभिन्न उपप्रकारों सैनिक पथ 2,3 के पेशीकला में अलग नेटवर्क के रूप में. हानि या इन नेटवर्कों को चोट गतिशीलता 4 विकारों के एक नंबर के साथ जुड़ा हुआ है. आईसीसी कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली और किट immunostaining पिछले 15 वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है आईसीसी नेटवर्क 5,6 लेबल पर किट रिसेप्टर tyrosine kinase व्यक्त करते हैं . महत्वपूर्ण बात, सामान्य किट गतिविधि आईसीसी 5,6 विकास के लिए आवश्यक है . आईसीसी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल stromal ट्यूमर में कोशिकाओं परिणाम (जिस्ट), कि बार - बार लाभ के समारोह किट 7,8 म्यूटेशनों बंदरगाह के neoplastic परिवर्तन. हमने हाल ही में पता चला कि ETV1 एक वंश विशेष के अस्तित्व आईसीसी / जिस्ट वंश में व्यक्त कारक है और एक मास्टर transcriptional और जिस्ट 9 tumorigenesis के लिए दोनों सामान्य आईसीसी नेटवर्क के गठन के लिए आवश्यक नियामक है . हम आगे दिखाना है कि यह tumorigenesis में किट म्यूटेशनों को सक्रिय के साथ सहयोग. यहाँ, हम चूहों में आईसीसी के नेटवर्क के दृश्य के लिए, मोटे तौर पर पहले प्रकाशित 10,11 प्रोटोकॉल पर आधारित विधियों का वर्णन. हाल ही में, क्लोराइड चैनल 1 anoctamin (ANO1) भी 11,12 आईसीसी की एक विशिष्ट झिल्ली मार्कर के रूप में लक्षण वर्णन किया गया है . अपने प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण के कारण, दोनों प्रोटीन के immunofluorescence आईसीसी नेटवर्क कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम निश्चित जमी cyrosections और पूरे माउंट तैयारी द्वारा आईसीसी के नेटवर्क के दृश्य का वर्णन.
Protocol
1. माउस सैनिक पथ के विच्छेदन
- स्थानीय IUCAC दिशानिर्देशों द्वारा euthanized चूहों
- स्टायरोफोम सतह पर प्रत्येक अंग पिन और 70% इथेनॉल के साथ पेट की सतह कुल्ला. लंबे समय डायाफ्राम से pubis midline चीरा के साथ उदर गुहा खोलें. एक बाहर का घुटकी और बाहर का बड़ी आंत में एक दूसरे में कटौती पर कटौती और पेट से गुदा के गुट एन GI पथ को हटाने के लिए, ध्यान से ग्रहणी और छोटे कैंची का उपयोग cecum स्नायुबंधन काटने. पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में प्लेस GI पथ. दूर चिमटी (चित्रा 1) का उपयोग अन्त्रपेशी काटना. पेट, छोटी आंत और बड़ी आंत, जठरनिर्गम और ileocecal जंक्शन में कटौती अलग. पीबीएस एक 5ml एक खिला (बड़े चूहों) सुई या कुंद सुई (छोटी चूहों) से जुड़ी सिरिंज का उपयोग कर के साथ GI पथ के प्रत्येक भाग के लुमेन कुल्ला.
- ओपन पेट, छोटी आंत, mesenteric सीमा पर और बड़ी आंत. GI पथ के प्रत्येक भाग के लिए दो टुकड़े, और पूरे माउंट दृश्य के लिए एक cryosection के लिए कट.
2. पूरे माउंट नमूना तैयार करने और immunostaining
- GI पथ के प्रत्येक भाग के एक 1.5 सेमी microfuge 4 में कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ के ठंडे एसीटोन और तय नमूने के 1.0 मिलीलीटर के साथ भरा ट्यूब डिग्री सेल्सियस में पूरे टुकड़ा प्लेस नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है हम आम तौर पर एसीटोन में नमूने की दुकान और आगे बढ़ना cyrosections तैयार.
- पीबीएस के साथ नमूना 2X धो लें. पीबीएस के साथ पेट्री डिश में रखें नमूना. Miscroscope विदारक के तहत, ध्यान से बंद चिमटी की एक जोड़ी के साथ एक छोर पकड़े, पेशीकला छोड़ने mucosal परत परिमार्जन एक स्केलपेल के साथ.
- बलवान विभिन्न एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना करने के लिए 5mm टुकड़ों में काटा जा सकता है. पीबीएस में अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए धुंधला हो जाना से पहले की दुकान मत करो.
- ब्लॉक और ऊष्मायन चरणों में अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से एक थाली के एक या एक 1.5ml microfuge ट्यूब में किया जा सकता है. अवरुद्ध बफर के 0.5 मिलीलीटर (5% बकरी सीरम, 0.1% ट्राइटन सी पीबीएस में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री X-100) के साथ ब्लॉक.
- प्राथमिक अवरुद्ध बफर में पतला एंटीबॉडी के साथ सेते हैं और 4 में रात भर बारी बारी से डिग्री सेल्सियस हम सफलतापूर्वक ACK-2 विरोधी किट चूहे, खरगोश विरोधी Ano1, खरगोश और पूरे माउंट immunostaining के लिए विरोधी Pgp9.5 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है.
- 2X पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंग को घुमानेवाली पेशी पर धो लें.
- माध्यमिक कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए अंग को घुमानेवाली पेशी को अवरुद्ध बफर में पतला एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. आम तौर पर हम Alexa 488 Fluor विरोधी खरगोश और alexa Fluor 594 एंटीबॉडी विरोधी चूहे का उपयोग करें.
- पीबीएस के साथ 15 3X मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंग को घुमानेवाली पेशी पर धो लें.
- स्लाइड, शीर्ष पर serosal पक्ष पर माउंट माइक्रोस्कोपी के दौरान ऊतक के उन्मुखीकरण सुनिश्चित करने के लिए. यह अभिविन्यास serosal पक्ष सुनिश्चित करें coverslip चेहरे और पहली बार सामना करना पड़ा एक के रूप में एक खुर्दबीन पर स्लाइड में केंद्रित होगा. हम एक विदारक माइक्रोस्कोप पर इस है. कभी कभी, हम संक्षेप में ठीक से उन्मुख करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत ऊतक की जांच. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए किट या Ano1 कल्पना के तहत, एक coverslip की ओर से आईसीसी - मेरा नेटवर्क पहली मुठभेड़ चाहिए. अगला, aspirate पीबीएस साथ बिना जितना संभव हो पूरी तरह से सुखाने. कठिन सेट बढ़ते मीडिया (हम गोल्ड लम्बा उपयोग) के 50 μl जोड़ें और धीरे से ऊतक के शीर्ष पर कवर पर्ची जगह. -80 पर कमरे के तापमान और दुकान स्लाइड्स पर रातोंरात बढ़ते की स्थापना की अनुमति दें डिग्री सेल्सियस
- सूक्ष्म परीक्षा के लिए, हम एक Z-ड्राइव के साथ एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया. हम या तो एक 20X हवा उद्देश्य (0.75 एनए, योजना apochromat) या 60x तेल उद्देश्य (1.4 एनए, योजना apochromat) का इस्तेमाल किया और 2 सुक्ष्ममापी या 1 सुक्ष्ममापी Z वर्गों है कि पूरे पेशीकला अवधि लिया. छवियों को बाद में Autoquant deconvolution सॉफ्टवेयर का उपयोग कर deconvoluted थे. वैकल्पिक रूप से, कई दूसरों confocal माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया है बजाय समान परिणामों के साथ.
3. Cryosection तैयारी और immunostaining
- GI पथ, serosal नीचे की ओर, फिल्टर पेपर पर फ्लैट के प्रत्येक भाग रखें. ऊतक के आसपास फिल्टर पेपर कट. पीबीएस (हम सही उपयोग करने से पहले पीबीएस में सीलबंद शीशी में 32% paraformaldehyde पतला) में 4% (पीएफए) कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए paraformaldehyde में फिल्टर पेपर पर प्लेस ऊतक. या 12 ऊतक के आकार पर निर्भर करता है अच्छी तरह से थाली, या एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में फिक्सेशन एक 6 में किया जा सकता है. यदि थाली में किया, parafilm पीएफए जोखिम को कम करने के लिए. अब निर्धारण बार प्रतिजन मास्किंग में ACK-2 एंटीबॉडी विरोधी किट के लिए विशेष रूप से परिणाम हो सकता है.
- पीबीएस में 30% sucrose में पीएफए और जगह से ऊतक निकालें. ऊतक रात 4 में सिंक करने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस
- 30% और 1 घंटे के लिए sucrose अक्टूबर के 1:1 के अनुपात के साथ ऊतक संतुलित. फिर ऊतक खड़ी माउंट cryomold में अक्टूबर से भरा GI पथ के अनुदैर्ध्य अक्ष cyrosections के साथ समानांतर में होना चाहिए. जब अलग जीनोटाइप के साथ या अलग उपचार के साथ चूहों जांच, यह वही cryomold पर अलग चूहों से ऊतक माउंट उपयोगी हो करने के लिए समानांतर प्रसंस्करण सुनिश्चित कर सकते हैं. सूखी और भंडारण के लिए -80 ° सी फ्रीजर में बर्फ जगह पर रुक.
- कट 10 सुक्ष्ममापी cryosections-80 ° सी फ्रीजर में स्लाइड की दुकान पर. हम आम तौर पर प्रति स्लाइड दो वर्गों में कटौती. हम भी आम तौर पर एक cryosection स्लाइड के एच एंड ई धुंधला करते हैं.
- Immunofluorescence के लिए, पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए स्लाइड संतुलित. फिर ऊतक चारों ओर घेरा पीएपी पेन का उपयोग आकर्षित.
- 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर (पूरे माउंट immunostaining के लिए के रूप में ही) के 150 μl के साथ ब्लॉक.
- अवरुद्ध बफर Aspirate और 150 μl प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध बफर में पतला जोड़ने और 4 में रात भर सेते ° C एक humidified कक्ष में.
- पीबीएस के साथ 5 मिनट 2X धो लें.
- माध्यमिक कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में पतला एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. आम तौर पर हम Alexa 488 विरोधी खरगोश और एलेक्सा 594 विरोधी चूहा एंटीबॉडी का उपयोग करें.
- पीबीएस के साथ 15 3X मिनट के लिए धोएं.
- पूरी तरह से ऊतक सुखाने के बिना स्लाइड Aspirate. DAPI (हम गोल्ड लम्बा उपयोग) और # 1.5 coverslip जगह के साथ मीडिया के बढ़ते कठिन सेट की एक बूंद जोड़ें. कमरे और करने के लिए सेट के लिए -80 ° सी फ्रीजर में स्टोर करने के लिए रातोंरात तापमान पर रखें स्लाइड.
- ट्रिपल प्रतिदीप्ति DAPI, FITC, और टेक्सास लाल फिल्टर सेट का उपयोग कर छवियों मोल.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
यहाँ, हम एक उदाहरण के रूप में बड़ी आँत का उपयोग करें. एच एंड ई sucrose के दाग संरक्षित जमी immunofluorescence के लिए इस्तेमाल किया खंड तय पता चलता है कि कुछ कलाकृतियों को एक संदर्भ आयल (चित्रा 2) अनुभाग में, की तुलना में जहां परिपत्र और अनुदैर्ध्य मांसपेशी परतों और हरे रंग की लाइन demarks के बीच पीली लाइन myenteric जाल demarks के बीच की सीमा mucosa और muscularlis. Cryosection जांच serosa से mucosa, आप पहली बार पतली अनुदैर्ध्य मांसपेशी (एल एम) मोटा परिपत्र मांसपेशी परत (मुख्यमंत्री) द्वारा पीछा परत मुठभेड़. अनुभाग अनुदैर्ध्य मांसपेशी के साथ समानांतर में है तो LM के नाभिक कुछ हद तक होना है जबकि मुख्यमंत्री के नाभिक छोटे और गोल किया जाना चाहिए लम्बी चाहिए चाहिए. LM और मुख्यमंत्री के बीच myenteric plexi न्यूरॉन्स कि Pgp9.5 साथ दाग बना रहे हैं. Pgp9.5 भी मुख्यमंत्री भर दाग neuronal प्रक्रियाओं. myenteric आईसीसी नेटवर्क (आईसीसी मेरा) myenteric जाल चारों ओर हैं और बहुध्रुवीय कोशिकाओं से बना है. अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत के भीतर, वहाँ दुर्लभ इंट्रामस्क्युलर (आईसीसी आईएमएस) ICCs जो द्विध्रुवी कोशिकाओं की मांसपेशी के साथ समानांतर में चल रहे हैं. परिपत्र मांसपेशी परत के भीतर, वहाँ आईसीसी-आईएमएस प्रचुर मात्रा में जो भी कर रहे हैं कि परिपत्र मांसपेशी के साथ समानांतर चलाने के लिए और इस कटौती के साथ पार sectioned हैं द्विध्रुवी कोशिकाओं रहे हैं. पेशीकला और submucosa के जंक्शन पर, submucosal आईसीसी आईसीसी-SMPS मिलकर नेटवर्क बहुध्रुवीय ICCs के एक फ्लैट नेटवर्क है. पूरे माउंट बड़ी आँत के immunostaining किट की जांच, एक आईसीसी मेरा नेटवर्क पहली मुठभेड़ की उम्मीद है, और चाहिए तो मुख्यमंत्री की आईसीसी IM, और आईसीसी-एसएमपी नेटवर्क, के रूप में एक coverslip से ध्यान केंद्रित (3 Figure.) . आईसीसी के नेटवर्क के बड़ा उपाय पूरे माउंट छवियों के 3D पुनर्निर्माण का उपयोग 10 में वर्णित किया गया है. व्यापक क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, कच्चे छवियों जो deconvolution के बाद हटाया जा सकता है है (चित्रा 3) के बाहर के विमान में महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति है. अधूरा mucosa की विपठ्ठन उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिणाम देगा. ANO1 आईसीसी का एक और मार्कर और किट के सह immunostaining और ANO1 आईसीसी धुंधला (चित्रा 4) के पूर्ण ओवरलैप से पता चलता है.
चित्रा 1 प्रतिनिधि माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग dissected, 13 की अनुमति के साथ reprinted.
चित्रा 2.) प्रतिनिधि एच एंड माउस तैयार के रूप में वर्णित है और संदर्भ आयल एम्बेडेड cryosections के कुछ संकोचन कलाकृतियों दिखा अनुभाग cryosections की बड़ी आंत का ई धुंधला . पीले लाइन myenteric जाल demarks और नीली रेखा पेशीकला से mucosa अलग. बी) के प्रतिनिधि किट (लाल, ACK-2) और Pgp9.5 (हरा) माउस बड़ी आँत के DAPI counterstaining (नीला) के साथ डबल immunofluorescence. LM: अनुदैर्ध्य मांसपेशी मुख्यमंत्री: परिपत्र मांसपेशी. स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3. प्रतिनिधि किट (लाल, ACK-2) एक ही क्षेत्र के तीन फोकल विमानों पर पूरे माउंट immunofluorescence आईसीसी मेरा बॉर्डर / LM मुख्यमंत्री विमान, मुख्यमंत्री में विमान आईसीसी - आईएम, और आईसीसी एसएमपी विमान पर सीमा / मुख्यमंत्री submucosa. कच्चे छवियों और deconvoluted छवियों से पता चला रहे हैं. स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4 प्रतिनिधि Ano1 (हरा) और बड़ी आंत में किट (लाल, ACK-2) के डबल immunofluorescence. स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी.
Discussion
Cajal के बीचवाला कोशिकाओं शुरू सैंटियागो Ramóón y Cajal द्वारा ठीक एक सदी पहले विशेषता methylene नीले और चांदी जठरांत्र पेशीकला के chromate दाग का उपयोग कर. Cajal शुरू सोचा था कि आईसीसी उनकी प्रक्रियाओं के आधार पर न्यूरॉन्स कि axons और dendrites की याद ताजा कर रहे हैं. कई आगामी वर्षों में, आईसीसी जीव विज्ञान के अध्ययन है कि किट की खोज न केवल आईसीसी में व्यक्त किया है जब तक विशिष्ट मार्करों की कमी के द्वारा सीमित किया गया है, लेकिन यह भी अपने विकास के लिए 6 आवश्यक है. तब से, किट immunofluorescence व्यापक रूप से किया गया है आईसीसी जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है और भी मूत्राशय के रूप में अन्य सिकुड़ा अंगों में आईसीसी की सराहना करने के लिए नेतृत्व. हाल ही में, ANO1 एक दूसरे विश्वसनीय आईसीसी मार्कर के रूप में पहचान की गई है.
Immunofluorescence का उपयोग करने के लिए आईसीसी की पहचान विभिन्न निर्धारण और बढ़ते तकनीकों का उपयोग पिछले 15 साल से अधिक कई प्रकाशनों किया गया है. हमारे हाथ में "निर्धारित जमी" cryosections कि paraformaldehyde और संरक्षित sucrose के साथ लगाया गया है सबसे अच्छा या cryosectioning बाद पोस्ट - निर्धारण paraformaldehyde एसीटोन की तुलना में काम करता है. पूरे mounts के लिए, हमने पाया है कि एसीटोन निर्धारण mucosal विच्छेदन के बाद सबसे मजबूत परिणाम देता है.
ऐतिहासिक, ACK-2 माउस आईसीसी पहचान के लिए पसंद की किट एंटीबॉडी किया गया है. यह एक मोनोक्लोनल चूहा है कि कोशिकी डोमेन पहचानता है और यह भी एक अवरुद्ध एंटीबॉडी कि आन्त्रावरोध का कारण बनता है जब चूहों को जीने के लिए दिया है. हालांकि, मिलान ACK-2 धीरे धीरे paraformaldehyde निर्धारण द्वारा नष्ट हो जाता है और मानक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति विधियों द्वारा बचाया नहीं है. हमने पाया है कि मिलान ACK-4 paraformaldehyde निर्धारण के लिए प्रतिरोधी है. आकारिकी तय जमे हुए ब्लॉक और वर्गों, आयल एम्बेडेड ब्लॉक और वर्गों की तुलना में बेहतर बरकरार रखता है और अधिक लंबे शब्द संग्रह (चित्रा 4) के लिए उत्तरदायी है. न तो ACK-2 और न ही ACK-4 सफलतापूर्वक किया गया है पैराफिन वर्गों में प्रयोग किया जाता है. हम विशेषता है कि D13A2, एक नया खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, GI पथ के दोनों तय स्थिर और आयल वर्गों में असाधारण अच्छी तरह से काम करता है.
किट melanocytes, hematopoietic कोशिकाओं, जर्म कोशिकाओं, और विशेष रूप से मस्तूल कोशिकाओं में जो भी GI पथ में पाया जाता है सहित कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त किया है. सौभाग्य से, सबसे मस्तूल कोशिकाओं पाए जाते हैं और पेशीकला में नहीं mucosa है. खरगोश विरोधी Ano1 और चूहे विरोधी किट के साथ डबल प्रत्येक एंटीबॉडी का धुंधला धुंधला गैर विशिष्ट (चित्रा 4) को समाप्त कर सकते हैं. यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि किट और Ano1 आईसीसी के उपवर्गों के बीच के रिश्तेदार अभिव्यक्ति अलग लगता है लायक है. उदाहरण के लिए, छोटी आंत में, किट धुंधला गहरी मांसपेशी जाल के आईसीसी की तुलना में जबकि Ano1 धुंधला तुलनीय है myenteric आईसीसी में ज्यादा तीव्र है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (K08CA140946, YC के लिए), (5F32CA130372, पीसी के लिए), (R01CA102774 और R01HL055748 पंजाब), रक्षा विभाग (PC094302 YC), जिस्ट अनुसंधान के लिए शुमन परिवार फंड (करने के लिए द्वारा समर्थित किया गया पीसी), और स्टार कैंसर कंसोर्टियम (पीसी के लिए, YC, CLS और पीबी). हम Katia Manova, Ning फैन, और MSKCC आण्विक कोशिका विज्ञान कोर सुविधा के Mesurh Turkekul cryosectioning और immunostaining के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
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