Summary
我们目前从背根神经节组织中的染色质免疫沉淀性轴索损伤的方法。这种方法可以用来识别特定的转录因子结合位点，同时在周边及中枢神经系统受伤的轴突再生的表观遗传修饰的组蛋白与DNA的重要。
Abstract
在中枢神经系统（CNS）的轴突无法再生，而在周围神经系统（PNS），再生伤后有限的范围内（登等人，2006年）。它是公认的，突起和轴突的生长至关重要的转录程序损伤在PNS（Makwana等人，2005年）后重新启动。然而，可用的工具来分析体内神经元的基因调控是有限的，往往具有挑战性。
背根神经节（DRG）提供了一个很好的损伤模型系统，因为无论是CNS和PNS来自相同SOMA的分叉轴突支配。神经节代表一个离散集合所有转录事件发生的细胞体，从而提供明确界定的区域，可以很容易地和重复地从动物中删除的转录活性。三七总皂苷（如坐骨神经），轴突再生发生，神经纤维损伤应揭示的是那些在中枢神经系统的响应类似的伤害，其中再生不会发生（如脊髓不同的转录方案）。转录因子结合，组蛋白和DNA修饰造成的伤害无论是PNS或CNS的网站都可以使用染色质免疫沉淀（ChIP）的特点。
在这里，我们描述了一个芯片使用固定的性轴索损伤后的小鼠背根神经节组织的协议。这种强大的组合提供了一个表征亲再生染色质环境，促进轴突再生的必要手段。
Protocol
1。坐骨神经和背柱神经损伤
- 动物被放置在一个手术巾，它下面的一个thermopad是目前整个过程中鼠标体温保持在37 ° C。所有动物都进行手术麻醉，用一个连续的异氟醚/ O 2的管理。手术器械灭菌前的程序。
- 坐骨神经损伤，这两个躯仔细剃，脱毛是与一般的头发卸妆Betadyne 3倍的酒精清洁皮肤前完成。
- 坐骨神经是由4毫米的切口后，通过皮肤在大腿中部股骨平行和蔓延除了用细镊子股二头肌肌肉暴露。
- 暴露坐骨神经，然后受伤，皮肤与两个缝合剪辑封闭。
注：同一切口暴露坐骨神经，但封闭的伤口缝合神经假伤的完好。
- 背柱损伤，鼠标的背面是经过精心剃光，脱毛是与一般的头发卸妆清洁皮肤用酒精喷/刷前完成。
- 脊髓是暴露一个2.5厘米的切口约T7 T13。皮肤是分开，是沿着从T9 T11椎体删除和结缔组织。
- 一个椎板切除术是在T10的水平
注：椎板切除术对于大多数实验，被认为是深水伤害。
- Xylocain几滴组织麻醉线，硬脑膜被删除，注意不要触摸脊髓。
- 受伤和肌肉缝合关闭，再次注意不要触摸脊髓背列。最后，皮肤缝合与缝合剪辑关闭。丁丙诺啡（0.1毫克/公斤体重）应每天两次48小时或直到不再需要。
2。交联
- 剖析受伤后euthanization小鼠L4和L5背根神经节。收集到冰冷的HBSS +蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（2人受伤，并从每个动物深水DRG的共4个动物）共16 DRG的。
- 短暂离心背根神经节，然后小心地取下的HBSS，加入500μL1％甲醛的PBS +蛋白酶抑制剂的鸡尾酒，并在37℃孵育30分钟的样品° C。
关键的一步。使用新鲜，分子生物学级甲醛。
- 添加甘氨酸125毫米，停止为5分钟，在室温下的固定和孵化。
- 短暂离心，吸出的缓冲区，并组织两次用500μL冰冷的PBS +蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。
3。核准备和染色质剪切
- 吸过PBS中，加400μLSDS裂解液，转移到预冷的离心管，并破坏组织约30招与micropestle。
关键的一步。裂解和破坏组织的交联的染色质好产量至关重要。
- 超声与8个脉冲，10秒的70％输出（Bandelin，Sonoplus GM70）每个样品。
谨慎。剪切染色质必须为您的特定超声优化设置和适当的染色质分散在运行实际的IP实验之前，应检查（见第3节）。
注意碎裂的染色，也可以由微球菌核酸（MNase）消化。作为一个经验法则，通过超声分散是首选固定的组织，而MNase消化本地组织染色质免疫沉淀的青睐。剪切染色质交联，可存储于-80 ° C至2个月，但避免重复冻结/解冻循环。
4。染色质消化分析（推荐）
- 取出10μL剪切染色质样品进行分析。添加氯化钠200毫米的样品和2H孵育65 ° C的反向交叉链接。
- 净化DNA（见第8节），并运行一个1％的琼脂糖凝胶。 DNA应该是支离破碎，长度约200-1000 bp（图1）。
谨慎。染色质的碎片可能导致信号下降，同时不完整的碎片会导致降低分辨率和增加背景。
5。免疫沉淀
- 确定免疫反应（见下文附注），并平均分配到新管的样品。使每卷500片内缓冲+蛋白酶抑制剂的鸡尾酒液。
- 取出5μL您的稀释后的样品，并转移到新管。这是1％输入采样，它会被存储在-20 ° C，直到需要（第7条）。
- 对于每个免疫，添加相应的抗体或正常的IgG对照，在4 ° C旋转过夜孵育。
注意：当确定的免疫，阳性对照（如组蛋白H3抗体）和阴性对照（普通IgG抗体）应予以考虑。数量为每个IP使用不同的抗体和抗体之间必须凭经验确定。但是，它通常是2-10范围内克/免疫。
- 为免疫沉淀抗体/蛋白质/ DNA复合物，加入30μl和芯片级的G蛋白的磁珠孵育2 h后，在4 °旋转彗星。
6。洗涤
- 下拉约束染色珠复杂，放在磁架管。等待，直到解决方案是明确的，然后小心地取下您上清。
- 加入1毫升（片内缓冲）低盐洗珠和孵化3-5分钟旋转4 ° C，然后下拉珠和吸洗步骤6.1。重复这一步共3洗。
- 添加高盐缓冲液洗1毫升（片内缓冲+氯化钠350毫米）的珠子和孵化为3-5分钟旋转，然后下拉珠和吸洗步骤6.1。
7。洗脱和交联逆转
- 把你的输入样本在-20 ° C，加入150μl和芯片洗脱缓冲液在室温下放在一旁，直到步骤7.5。
- 每个步骤6.3 IP样品添加的1X芯片洗脱缓冲液150μL。
- 放置在thermomixer管和孵化在65℃30分钟温和的震荡样品从珠洗脱染色质。
- 下拉珠磁机架上，并小心地转移到新管洗脱染色（上清）。
- 为了所有的管子，包括您的输入样本，2小时添加NaCl和40微克/蛋白酶K孵育反应65 ° C 200MM。
注意。洗脱步骤，可以在室温下进行，太多，但它可能是效率不高。
8。 DNA回收
- 1体积酚/氯仿添加到您的样品从步骤7.5和30秒的旋涡。
- 离心机以最大速度在室温离心5分钟。
- 小心地恢复到新的管水（上）阶段，1体积的氯仿添加到水相中，和30秒的旋涡。
- 离心机以最大速度在室温离心5分钟。
- 仔细恢复到新的管水（上）阶段，再加入NaOAc 300MM，冰冷的100％的乙醇20微克/肝糖原的反应，和2.5册。
需要谨慎。载体，此外，如糖 原，提高降水相对小型的DNA片段。
- 在-80 ° C孵育2小时，以沉淀DNA。
降水步骤也可以在-20 ° C过夜注意。
- 离心机中离心20分钟最高速度的样品在4 ° C。
- 小心取出上清液，用300μL冰冷的70％乙醇沉淀DNA颗粒。
- 离心机最高速度的样品离心10分钟，在4 ° C。
- 小心取出多上清尽可能让颗粒风干。
- 悬浮于20μL无菌H 2 O。样品现已准备好进行PCR或DNA可以储存在-20 ° C
9。代表性的成果
一个代表在坐骨神经病变的病种付费的芯片实验结果显示（图1，图2）。首先，我们支离破碎的DNA长度约200-1000 bp（图1）。第二，我们展示了从相关蛋白43（GAP - 43）只有在坐骨神经损伤（泳道4，图2，5'）的增长近端启动子的PCR信号以下芯片。无PCR信号是当动物只收到一个假伤（3巷），以及IP（巷5和6）当使用正常的抗体血清。要测试的特异性抗体，我们相同的DNA样本进行分析，但用于控制的引物，它可以检测在我们没有入住，预计感兴趣的基因3' - UTR一个地区。 PCR信号缺席所有车道（车道3-6，图2，3'），代表作为标准的PCR控制非IP DNA样本，除输入信号，（1-2车道，Figu再2）。这种芯片的程序，可以执行以下任一坐骨神经或脊髓后柱损伤，在原理图（图3）汇总。
图1。超声已被剪切片段长度适当的范围内，扭转了交联的DNA琼脂糖凝胶电泳。
图2。背根神经节组织的半定量PCR结果表明p53的乙酰化结合坐骨神经损伤后48小时内GAP - 43的近端启动子区域的坐骨神经病变。控制PCR方法从同一DRG组织表明，乙酰化P53不绑定到一个位于3' -端非编码区的GAP - 43的基因（S =深水，我=受伤）（UTR）的DNA控制区。
图3。一个图显示坐骨神经病灶部位的位置，和背柱。
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Discussion
该协议提供了一种方法，直接在成年神经系统轴突再生性轴索损伤后在染色质环境要求。它采用了染色质免疫沉淀的背根神经节损伤模型探测后要么PNS或中枢神经系统损伤的转录和表观环境。这是调查谁愿意来描述假定为自己喜爱的转录因子结合位点，而这些网站的占用，以确定是否发生损伤反应特别有用。表观遗传修饰的组蛋白和DNA在这些网站也可以同时监控。以下的面部神经病变，面神经核可以从脑干解剖和处理的芯片，可以进行类似的协议，因为我们以前报告 （特德斯奇等， 2009）。
至于染色质免疫沉淀分析的典型，在协议中的两个关键步骤，（1）高效分散和增溶的DNA -蛋白质复合物，和（2）对您感兴趣的蛋白质提供一个良好的免疫抗体。的限制，可能会混淆这两个步骤之一是水平低的起始原料。相比其他结构，如脑或脊髓，背根神经节提供了一个组织的量相对较小。此外，背根神经节组成的神经元以及神经胶质细胞，所有这些都可能有不同的染色质环境的混合人口。这可能会导致不同种类的IP信号;然而，这需要注意的是在神经系统所采取的最样品。一个潜在的解决方案执行后transgenically荧光标记DRG神经元的排序荧光激活细胞，（例如YFP - H的小鼠， 波格丹等 ，2004年），或通过磁珠（Lee 等人的神经细胞的免疫隔离芯片。 ，2005）。然而，这两种方法需要在病种付费的芯片验证，可能会需要一个起始原料的数量增加。
我们已经成功地使用这种方法来确定几个转录因子和已知再生相关基因的启动子的共激活因子的结合位点，我们已经使用了两个半定量和定量PCR方法检测免疫沉淀的DNA。这个协议的一个未来除了可以使用平铺芯片，芯片（芯片片上），为手段，以检测DNA的最后信号。片上芯片将大大增加通过高通量不带偏见的方式确定的转录。它也可以允许两个或两个以上的转录因子可能如何合作互动的一个基因组水平上上的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢帮助安德烈特德斯奇设置的最初在实验室和Ricco林德纳芯片的实验，他的贡献，以微调芯片的条件。这项工作是由Hertie基金会的支持;财富补助金，图宾根大学，和东风集团的DI 1497/1-1补助（授予西蒙娜迪乔万尼）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
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