Summary
우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
주변 신경계 (PNS)에 그가 부상 후 제한된 범위 (탱 외., 2006)으로 재생을하는 동안 중추 신경계 (CNS)에 Axons이 재생되지 않습니다. 이것은 neurite 및 axonal 가지 필수 transcriptional 프로그램 PNS (Makwana 외., 2005)의 부상에 따라 활성화되는 인식됩니다. 그러나 생체내로의 연결을 유전자 규제를 분석에 사용할 수있는 도구가 제한되어 종종 도전하고 있습니다.
CNS와 PNS 모두 같은 소마에서 발생하는 bifurcated 축삭에 의해 innervated 때문에 지느러미 루트 신경 (DRG)는 훌륭한 상해 모델 시스템을 제공합니다. 신경은 모든 transcriptional 이벤트가 발생 세포 기관의 이산 컬렉션을 대표하고, 따라서 쉽게 reproducibly 동물에서 제거할 수 있습니다 transcriptional 활동의 명확하게 정의된 영역을 제공합니다. axonal 중생이 발생 PNS (예 : 좌골 신경)에서 신경 섬유의 부상은 재생이 장소 (예 : 척수을하지 않습니다 어디 CNS에서 비슷한 부상에 대응 사람에서 구분되는 transcriptional 프로그램의 집합을 공개합니다 ). 히스톤, 바인딩 전사 인자와 부상에서 PNS 또는 CNS 중 하나에 발생 DNA 조작을위한 사이트는 염색질 immunoprecipitation을 (칩)을 사용하여 특징하실 수 있습니다.
여기, 우리는 axonal 부상을 다음과 고정 마우스 DRG 조직을 사용하여 칩 프로토콜을 설명합니다. 이 강력한 결합은 axonal 재생을 촉진하는 데 필요한 프로 재생 염색질 환경을 특성화를위한 수단을 제공합니다.
Protocol
1. 좌골 & 지느러미 열 신경 손상
- 동물은 수술 수건에 위치하고 아래 thermopad 37에서 마우스의 체온을 유지 ° C. 절차 전반에 걸쳐 존재입니다 모든 동물은 지속적인 O / isoflurane이 관리와 수술 anesthetized 있습니다. 외과 용구는 절차 전에 autoclaved 있습니다.
- 좌골 신경통의 부상, 두 엉덩이쪽에 신중하게 면도 있으며, 왁스는 사전 Betadyne 3 회 다음 알코올로 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다.
- 좌골 신경은 4mm의 절개가 후부과 피부를 통해 중반 허벅지에있는 대퇴골을 병행함으로써 훌륭한 포셉과 팔뚝의 femoris의 간격 근육을 확산하여 노출됩니다.
- 노출된 좌골 신경이 그 부상하고, 피부가 두 봉합 클립과 함께 닫힙니다.
참고 : 동일한 절개가 좌골 신경을 노출했다지만, 상처가 가짜 부상에 대한 신경은 그대로 둔 폐쇄 봉합합니다.
- 등의 열 손상의 경우 마우스의 뒷면을 세심하게 면도하고, 왁스는 이전에 알코올 스프레이 / 강타와 함께 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다.
- 척수는 T7 약에서 T13에 2.5 cm의 절개하여 노출됩니다. 피부는 별개로 확산되고 결합 조직은 T9에서 T11로 척추를 따라 제거됩니다.
- laminectomy는 T10 수준에서 수행됩니다
참고 : 대부분의 실험은 laminectomy가 위장 부상으로 간주됩니다.
- Xylocain 몇 방울이 코드를 마취시키다하기 위해 조직에 추가되며, 두라 메이터는 척수를 만지지 않도록주의를 기울이고, 제거됩니다.
- 지느러미 열은 부상되고 근육은 다시 척수를 만지지 않도록주의를 기울이고 닫기 봉합합니다. 마지막으로, 피부 봉합 클립과 함께 폐쇄 봉합합니다. Buprenorphine (0.1 밀리그램 / kg 체중)을 48 시간 또는 더 이상 필요하지 않은까지 매일 두 번 실시한다.
2. 교차 연결
- euthanization 후 부상 생쥐에서 L4 및 L5 DRG를 해부하다. 얼음처럼 차가운 HBSS + 프로 테아제 억제제 칵테일 (2 4 동물의 총 각 동물의 부상과 2 사기 DRG)에 16 DRG 총를 수집합니다.
- 간단히 DRG를 원심 후, 조심스럽게 37 HBSS를 제거하고 PBS + 프로 테아제 억제제 칵테일의 1 % 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 30 분 샘플을 품어 ° C.
임계 단계. 신선한, 분자 생물학의 등급 포름 알데히드를 사용하십시오.
- 실온에서 5 분간 고정과 부화를 중지 글리신 125 MM을 추가합니다.
- 간단히, 원심 분리기 버퍼를 대기음, 500 μl 얼음처럼 차가운 PBS + 프로 테아제 억제제 칵테일과 함께 두 번 조직을 씻으십시오.
3. 핵의 준비와 염색질의 전단
- PBS를 대기음, SDS의 용해 버퍼 400 μl를 추가 미리 차게 microcentrifuge 관에 전송하고, micropestle로 약 30 스트로크와 조직을 방해.
임계 단계. 용해 및 조직의 혼란은 가교 염색질의 좋은 수율을 위해 매우 중요합니다.
- 8 펄스, 70 % 출력 (Bandelin, Sonoplus GM70) 각 10초와 샘플을 Sonicate.
주의. 염색질의 전단은 특정 sonication을 위해 최적화된되어야합니다 설정하고 염색질의 적절한 조각은 (섹션 3 참조) 실제 IP 실험을 실행하기 전에 확인하여야한다.
염색질의 참고. 파쇄도 micrococcal nuclease (MNase) 소화에 의해 수행 수 있습니다. MNase는 소화가 기본 조직 염색질의 immunoprecipitation을 위해 선호되는 동안 경험 원칙적으로, sonication에 의해 분열이 고정 조직이 선호됩니다. 교차 연결된, 가지각색 염색질은 최대 2 개월까지 -80 ° C에 보관하지만, 반복되는 동결 / 해동 사이클을 피할 수 있습니다.
4. 염색질 소화의 분석 (권장)
- 분석을위한 가지각색 염색질 샘플 10 μl를 제거합니다. 샘플에 NaCl 200 MM을 추가하고 2 시간을위한 65 ° C를 잠복기하여 상호 링크를 역방향.
- DNA를 (8 항 참조) 정화하고 1 % 아가로 오스 겔을 실행합니다. DNA는 약 200-1000 BP (그림 1)의 길이로 조각난해야합니다.
불완전한 조각이 감소 해상도 및 증가 배경에 이끌면서 염색질의주의. 오버 - 조각이 감소 신호가 발생할 수 있습니다.
5. Immunoprecipitation
- immunoprecipitation 반응의 숫자를 (아래 참고 참조) 확인하고, 마찬가지로 새로운 튜브에 샘플을 나눕니다. 각각의 볼륨을 가지고최대 칩 버퍼 + 테아제 억제제 칵테일 500 μl 수 있습니다.
- 당신의 희석 시료의 5 μl를 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다. 이것은 1 %의 입력 샘플이며 필요 때까지 그것은 (제 7) -20 ° C에 저장됩니다.
- 각 immunoprecipitation 들어, 적절한 항체 또는 일반 IgG 컨트롤을 추가하고 회전 ° C 하루 4 알을 품다.
참고. immunoprecipitation의 번호, 긍정적인 컨트롤 (예 : 히스톤 H3 항체)과 대조군 (일반 IgG)를 결정할 때 고려되어야합니다. 각 IP에 사용되는 항체의 수량 항체 사이에 다양하고 경험적으로 결정되어야합니다. 그러나, 그것은 2-10의 범위 이내인가? G / immunoprecipitation.
- 귀하의 항체 / 단백질 / DNA 복잡한 immunoprecipitate하려면, 칩 학년 단백질 G 자성 비즈의 30 μl를 추가하고 4 2 H에 대한 품어 ° C를 회전.
6. 세탁
- 풀다운 바운드 염색질 - 구슬 복잡한하려면 자기 랙에 튜브를 놓으십시오. 솔루션은 명확하고 신중하게 뜨는을 제거할 때까지 기다리십시오.
- 비즈로 낮은 소금 세척 1 ML (칩 버퍼)을 추가하고 4 품어 ° C를 회전 3~5분에 대한 다음 구슬을 내리고 단계 6.1에서와 같이 세척을 대기음. 3 세척 총에 대해이 단계를 반복합니다.
- 비즈 높은 소금 세척 버퍼 1 ML (칩 버퍼 + 350 MM NaCl)을 추가하고 구슬을 내리고 단계 6.1에서와 같이 세척을 대기음 다음, 회전 3~5분을위한 부화.
7. 용출 및 상호 연결의 반전
- -20의 입력 샘플을 꺼내서 ° C는, 칩 용출 버퍼 150 μl를 추가하고 단계 7.5까지 실온에서 따로 설정할 수 있습니다.
- 6.3 단계에서 각 IP 샘플 1X 칩 용출 버퍼 150 μl를 추가합니다.
- thermomixer에 튜브를 삽입하고 ° C 부드러운 vortexing 30 분 65 샘플을 잠복기로 비즈에서 염색질을 elute.
- 자기 선반에 구슬을 아래로 당겨, 조심스럽게 새로운 튜브로 eluted 염색질 (뜨는)를 전송합니다.
- 귀하의 입력 샘플을 포함하여 모든 튜브에 2 시간 동안 NaCl 40 65 μg / Proteinase K와 부화의 반응 ° C의 200mM를 추가합니다.
참고. 용출 단계도 상온에서 수행할 수 있지만, 그것으로 효율적이지 않습니다 수 있습니다.
8. DNA 복구
- 30 초 동안 단계 7.5과 와동에서 샘플로 / 페놀 클로로포름 1 볼륨을 추가합니다.
- 5 분 룸 온도에서 microcentrifuge의 최대 속도로 원심 분리기.
- 조심스럽게 수성 (어퍼) 새로운 튜브로 위상, 수성 단계로 클로로포름 1 볼륨을 추가하고 30 초 동안 와동을 복구합니다.
- 5 분 룸 온도에서 microcentrifuge의 최대 속도로 원심 분리기.
- 조심스럽게 새로운 튜브로 수성 (어퍼) 단계를 복구 후, 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 20 μg / 글리코겐의 반응, 그리고 2.5 볼륨을 NaOAc의 300mM 추가할 수 있습니다.
주의. 같은 글리코겐으로 이동 통신사의 추가는 비교적 작은 크기의 DNA 조각의 강수량을 향상시키기 위해 필요합니다.
- ° C 2 시간 동안 침전의 DNA를 -80에서 알을 품다.
참고. 강수량 단계도 -20 ° C.에서 하룻밤을 수행할 수 있습니다
- 4 20 분 microcentrifuge의 최대 속도로 샘플을 원심 ° C.
- 조심스럽게 뜨는을 제거하고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 300 μl와 시켰던 DNA의 알약을 씻으십시오.
- 4 10 분 microcentrifuge의 최대 속도로 샘플을 원심 ° C.
- 조심스럽게만큼 뜨는 가능한 제거하고 알약은 공기 건조하게.
- 무균 H 2 O. 20 μl에 Resuspend 샘플 지금은 PCR을위한 준비, 또는 DNA는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
9. 대표 결과
좌골 신경통의 병변에 따라 DRGs의 칩 실험의 대표적인 결과는 (그림 1 및 2) 표시됩니다. 첫째, 우리는 약 200-1000 BP (그림 1)의 길이로 조각난 DNA를 보여줍니다. 둘째, 우리는 단백질 43 (GAP - 43) 전용시 좌골 신경 손상 (레인 4, 그림 2, 5 ') 관련된 성장의 근위 모터에서 PCR 신호 다음과 같은 칩을 보여줍니다. 없음 PCR 신호 동물은 가짜 상처를 받고 (레인 3) 때 존재하지 않으며 IP (레인 5와 6)에 대한 정상 혈청 IgG를 사용하는 경우. 항체의 특이성에 대한 테스트하려면, 우리는 같은 DNA 샘플을 분석,하지만 숙박이 예상되지 관심을 우리의 유전자의 3' - UTR에서 영역을 감지 제어 프라이머 세트를 사용했습니다. PCR 신호는 표준 PCR 컨트롤 같은 비 - IP DNA 샘플을 나타내는 입력 신호를 제외한 모든 차선 (차선 3-6 그림 2, 3 '), (레인 1-2, Figu에서 결석 아르다시 2). 회로도 (그림 3)에 요약로 칩 절차 중 좌골이나 척추 등의 부상 열 다음을 수행할 수 있습니다.
조각 길이의 적절한 범위를 sonication으로 가지각색으로 잘리고 반대로 교차 연결된 DNA의 그림 1. 아가로 오스 겔.
그림 2. acetylated p53의는 GAP - 43 48 시간 좌골 신경 손상 후 근위 발기인 지역에 바인딩되는 보여주는 좌골 신경 병변 다음 DRG 조직에서 세미 양적 PCR 결과. 제어 PCR acetylated p53의는 GAP - 43 유전자 (S = 섐 전 = 부상자)의 3' - 번역되지 않은 지역 (UTR)에있는 DNA의 제어 영역에 바인딩하지 않는 것과 같은 DRG 조직 쇼에서.
그림 3. 좌골 신경에 병변 사이트의 위치, 그리고 등의 열의를 보여주는 일반적인 다이어그램.
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Discussion
이 프로토콜은 직접 axonal 부상 다음과 같은 성인 신경계의 axonal 중생 중에 염색질 환경에 대해 문의하는 방법을 제공합니다. 그것은 PNS 또는 CNS를 하나에 부상 이후 transcriptional 및 epigenetic 환경을 탐사하기 위해 염색질 immunoprecipitation와 DRG 상해 모델을 포함합니다. 그것은 자신이 좋아하는 전사 인자에 대한 putative 구속력이 사이트를 특성화하고 싶습니다,이 사이트의 수용 인원은 부상에 대한 응답으로 발생 여부를 확인하는 조사에 특히 유용합니다. 해당 사이트에서 histones과 DNA의 Epigenetic 변경도 동시에 모니터링할 수 있습니다. 우리가 이전에 (테데스키 외., 2009)보고와 유사한 프로토콜은 얼굴 신경 핵이 brainstem의 해부와 칩으로 처리할 수 안면 신경 병변, 다음을 수행할 수 있습니다.
염색질의 immunoprecipitation의 assays에 관해서는 전형적인 프로토콜의 두 중요한 단계 (1) 효율적인 조각과 solubilization DNA - 단백질 복합, 그리고 관심의 단백질에 대한 좋은 immunoprecipitation 항체 (2) 가용성입니다. 이 두 단계를 혼란시킬 수 한 제한이 자료를 시작하는 낮은 수준이다. 조직의 비교적 적은 금액을 제공하는 DRG 등 뇌 또는 척수와 같은 다른 구조에 비해. 또한, DRG 다른 염색질 환경 수도있는 모든 뉴런뿐만 아니라 glial 세포의 혼합 인구로 구성되어 있습니다. 이것은 이기종 IP 신호로 이어질 수 있지만이 주의해야 할 점은 신경 시스템에서 찍은 대부분의 샘플에 존재합니다. 잠재적인 솔루션은 형광 활성 transgenically 찬란 분류 DRG 뉴런의 정렬 셀 (예 : YFP - H 마우스, 보그단 외., 2004 참조), 또는 자기 구슬 (리 외 통해 뉴런의 단백질 분리 후 칩을 수행하는 것입니다. , 2005). 그러나 이러한 두 가지 방법이 DRGs의 칩에 대한 검증해야하고 가능성이 시작 물질의 증가 금액이 필요합니다.
우리는 성공적으로 알려진 재생 관련 유전자의 프로 모터에 여러 전사 요소 및 coactivators에 대한 구속력이 사이트를 식별하려면이 메서드를 사용하여 있고, 우리는 immunoprecipitated DNA를 감지하는 세미 양적 및 양적 모두 PCR 방법을 사용했습니다. 이 프로토콜을 하나의 미래 또한 최종 DNA 신호를 감지하는 수단으로, 칩 (칩 - 온 - 칩) 다음과 같은 타일 microarrays의 사용을 수 있습니다. 칩 - 온 - 칩 크게 높은 처리량 편견적인 접근을 통해 확인된 전사 사이트의 수를 증가합니다. 또한 두 개 이상의 전사 인자들이 협력 게놈 수준에서 상호 작용하는 방법을 연구를 위해 허용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 미세 조정 칩에 대한 조건에 자신의 기여에 대한 실험과 리코 린드너의 초기 칩 실험 설정에 대한 도움 안드레아 테데스키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Hertie 재단에 의해 지원되었다; 포춘 그랜트, Tuebingen 대학 및 DFG DI 1497/1-1 보조금 (모든 시몬 디 지오 바니 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
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- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
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