Summary
Nós apresentamos um método para imunoprecipitação da cromatina do tecido da raiz dorsal após lesão axonal gânglios. A abordagem pode ser usada para identificar locais de transcrição específicos fator determinante e importante modificação epigenética de histonas e DNA para a regeneração de axônios lesados tanto no sistema nervoso periférico e central.
Abstract
Axônios no sistema nervoso central (SNC) não se regeneram, enquanto as do sistema nervoso periférico (SNP) se regeneram de forma limitada após a lesão (Teng et al., 2006). Reconhece-se que os programas de transcrição essencial para crescimento de neuritos e axonal são reativados após lesão no PNS (Makwana et al., 2005). No entanto as ferramentas disponíveis para analisar regulação gênica neuronal in vivo são limitados e muitas vezes desafiador.
Os gânglios da raiz dorsal (DRG) oferecem um sistema excelente modelo prejuízo, porque tanto o CNS e PNS são inervados por um axônio bifurcada proveniente da soma mesma. Os gânglios representar uma coleção discreta de corpos celulares, onde todos os eventos ocorrem de transcrição, e assim fornecer uma região claramente definida de atividade transcricional que pode ser facilmente reproduzível e retirado do animal. Lesão de fibras nervosas no PNS (por exemplo, nervo ciático), onde a regeneração axonal ocorre, deve revelar um conjunto de programas de transcrição que são distintas das respondendo a uma lesão similar no sistema nervoso central, onde a regeneração não ocorre (por exemplo, na medula espinhal ). Sites para o fator de transcrição de ligação, histona e modificação de DNA resultante da lesão a qualquer PNS ou SNC podem ser caracterizadas usando cromatina imunoprecipitação (chip).
Aqui, nós descrevemos um protocolo chip usando tecido DRG fixo rato após lesão axonal. Esta poderosa combinação oferece um meio para caracterizar o ambiente cromatina pró-regeneração necessária para promover a regeneração axonal.
Protocol
1. Lesão do nervo ciático e coluna dorsal
- O animal é colocado sobre uma toalha cirúrgica e debaixo dela um thermopad está presente em todo o processo de manter a temperatura corporal do rato a 37 ° C. Todos os animais são anestesiados para a cirurgia com uma contínua isoflurano / O 2 administração. Os instrumentos cirúrgicos são autoclavados antes do procedimento.
- De lesão ciática, ambos posteriores são cuidadosamente raspada, e depilação completa-se com removedor de pêlos genéricas antes limpeza da pele com álcool seguido por Betadyne 3 vezes.
- O nervo ciático é exposto por uma incisão 4 milímetros posterior e paralela ao fêmur no meio da coxa através da pele e espalhando os músculos além do bíceps femoral com uma pinça fina.
- O nervo ciático é exposto em seguida, ferido, ea pele é fechada com dois clipes de sutura.
NOTA: A mesma incisão é feita para expor o nervo ciático, mas a ferida é fechada com sutura deixando o nervo intacto para a lesão farsa.
- De lesão da coluna dorsal, a parte traseira do mouse é cuidadosamente raspado, e depilação completa-se com removedor de pêlos genéricas antes limpeza da pele com álcool spray / furto.
- A medula espinhal é exposto por uma incisão de 2,5 cm de cerca de T7 a T13. A pele é afastados, e do tecido conjuntivo é removida ao longo da vértebra de T9 a T11.
- A laminectomia é realizada no nível T10
NOTA: Para a maioria dos experimentos, a laminectomia é considerada a lesão Sham.
- Algumas gotas de Xylocain são adicionadas ao tecido para anestesiar o cabo, e dura-máter é removido, prestando atenção para não tocar na medula espinhal.
- As colunas dorsal são feridos eo músculo é suturada perto, mais uma vez prestando atenção para não tocar na medula espinhal. Finalmente, a pele é fechada com sutura com grampos de sutura. Buprenorfina (0,1 peso corporal mg / kg) deve ser administrado duas vezes ao dia por 48 horas ou até que deixem de ser necessários.
2. Cross-linking
- Dissecar DRG L4 e L5 de ratos feridos após a eutanásia. Coletar um total de 16 DRG em gelada HBSS + inibidores da protease do cocktail (2 feridos e 2 farsa DRG de cada animal, para um total de 4 animais).
- Brevemente centrifugar o DRG, em seguida, remova cuidadosamente o HBSS e adicionar 500 mL de formaldeído a 1% em PBS + cocktail inibidores da protease e incubar a amostra durante 30 minutos a 37 ° C.
Etapa crítica. Use fresca, de formaldeído de grau de biologia molecular.
- Adicionar 125 mM de glicina para parar a fixação e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Brevemente centrífuga, aspirado off buffer, e lavar o tecido duas vezes com 500 gelada mL PBS + protease cocktail inibidores.
3. Preparação núcleos e cisalhamento cromatina
- Aspirar off PBS, adicionar 400 mL de tampão de lise SDS, transferir para um tubo de microcentrífuga pré-refrigeradas, e interromper o tecido com aproximadamente 30 golpes com a micropistilo.
Etapa crítica. Lise e destruição do tecido são vitais para um bom rendimento da cromatina reticulada.
- Sonicate a amostra com 8 pulsos, 10 segundo cada um com saída de 70% (Bandelin, Sonoplus GM70).
CUIDADO. O corte da cromatina deve ser otimizado para o seu sonicação especial configurar e fragmentação da cromatina adequada deve ser verificado antes de executar o experimento IP real (ver secção 3).
NOTA fragmentação. Da cromatina também pode ser realizada por micrococcal nuclease digestão (MNase). Como regra geral, a fragmentação por sonicação é o preferido para tecido fixado, enquanto que a digestão é favorecida MNase para imunoprecipitação nativa tecido cromatina. Cruzada, cortado cromatina pode ser armazenado a -80 ° C por até 2 meses, mas evitar repetidos de congelamento / descongelamento.
4. Análise da digestão da cromatina (recomendado)
- Retire 10 ml da sua amostra cromatina cortado para análise. Adicionar 200 mM de NaCl para a amostra e reverter o cross-link, incubando a 65 ° C por 2h.
- Purificar DNA (ver secção 8) e executar um gel 1% agarose. DNA deve ser fragmentado para um comprimento de cerca de 200-1000 pb (Figura 1).
CUIDADO. Excessiva fragmentação da cromatina pode levar à diminuição do sinal, enquanto que a fragmentação incompleta levará à resolução diminuída e aumento de fundo.
5. Imunoprecipitação
- Determinar o número de reações de imunoprecipitação (ver nota abaixo), e dividir amostras igualmente em novos tubos. Reduzir o volume de cadaaté 500 mL com tampão ChIP + cocktail inibidores da protease.
- Retire 5 mL da sua amostra diluída e transferência para um novo tubo. Esta é a sua amostra de entrada de 1% e vai ser armazenadas a -20 ° C até ser necessário (Seção 7).
- Para cada imunoprecipitação, adicione anticorpos IgG controle apropriado ou normal e incubar a 4 ° C durante a noite com rotação.
NOTA. Ao determinar o número de imunoprecipitação, um controlo positivo (por exemplo, anticorpos Histone H3) e um controle negativo (IgG Normal) deve ser considerada. A quantidade de anticorpo utilizado para cada IP varia entre anticorpos e deve ser determinado empiricamente. No entanto, é geralmente dentro de uma escala de 2-10? G / imunoprecipitação.
- Para immunoprecipitate seu complexo anticorpo / proteína / DNA, adicionar 30 mL de chip de Contas da proteína G Grade Magnética e incubar por 2 horas a 4 ° C com rotação.
6. Lavagem
- Para suspenso ligado complexo cromatina talão, colocar o tubo na cremalheira magnética. Aguarde até que a solução é clara e, em seguida, remova cuidadosamente o seu sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de lavar baixo teor de sal (buffer ChIP) para as contas e incubar a 4 ° C por 3-5 minutos, com rotação, em seguida, puxe para baixo e aspire contas off lavar como no passo 6.1. Repita esta etapa para um total de 3 lavagens.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem de alta sal (buffer ChIP + 350 mM NaCl) para as contas e incubar por 3-5 minutos, com rotação, em seguida, puxe para baixo e aspire contas off lavar como no passo 6.1.
7. Eluição e reversão de cross-linking
- Colher amostras a sua entrada fora do -20 ° C, adicionar 150 mL de tampão de eluição ChIP e reserve em temperatura ambiente até Passo 7.5.
- Adicionar 150 mL de tampão 1x ChIP eluição de cada amostra IP a partir do Passo 6.3.
- Colocar os tubos em um Thermomixer e eluir a cromatina dos grânulos, incubando amostras a 65 ° C por 30 minutos com vortex gentil.
- Suspenso contas no rack magnético, e transferir cuidadosamente a cromatina eluída (sobrenadante) em tubos de novo.
- Em todos os tubos, incluindo amostras de sua entrada, adicione 200mM de NaCl e 40 g / reação de Proteinase K e incubar a 65 ° C por 2 horas.
NOTA. A etapa de eluição pode ser realizado à temperatura ambiente, também, mas pode não ser tão eficiente.
8. Recuperação de DNA
- Adicionar 1 volume de clorofórmio Fenol / com suas amostras a partir do Passo 7.5 e vortex por 30 segundos.
- Centrifugar a velocidade máxima em microcentrífuga a temperatura ambiente por 5 minutos.
- Cuidadosamente a fase de recuperação (superior) aquosa para novos tubos, adicionar 1 volume de clorofórmio para a fase aquosa e vórtice por 30 segundos.
- Centrifugar a velocidade máxima em microcentrífuga a temperatura ambiente por 5 minutos.
- Cuidadosamente a fase de recuperação (superior) aquosa para novos tubos, em seguida, adicione 300mM de NaOAc, 20 mg / reação de glicogênio, e 2,5 volumes de etanol gelado de 100%.
CUIDADO. A adição de uma transportadora, como o glicogênio, é necessária para aumentar a precipitação de relativamente pequenos fragmentos de DNA de tamanho.
- Incubar a -80 ° C por 2 horas para DNA precipitado.
NOTA. A etapa de precipitação também pode ser realizada durante a noite a -20 ° C.
- Centrifugar as amostras a velocidade máxima em microcentrífuga por 20 minutos a 4 ° C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante e lavar os pellets de DNA precipitado com 300 l de etanol gelado 70%.
- Centrifugar as amostras a velocidade máxima em microcentrífuga por 10 minutos a 4 ° C.
- Cuidadosamente remover o máximo possível sobrenadante e deixar o pellets de ar seco.
- Ressuspender em 20 l de H 2 O. estéril Amostras estão agora prontos para PCR, ou o DNA pode ser armazenado a -20 ° C.
9. Resultados representante
Um resultado representativo de uma experiência de chip em DRGs após lesão ciática é mostrado (Figuras 1 e 2). Primeiro, vamos mostrar DNA fragmentado para um comprimento de cerca de 200-1000 pb (Figura 1). Segundo, nós demonstramos um Chip sinal PCR seguintes do promotor proximal do crescimento associado a proteína-43 (GAP-43) somente após lesão do nervo ciático (faixa 4, Figura 2, 5 '). Não há sinal de PCR está presente quando o animal recebe uma lesão farsa só (pista 3), e quando se usa soro normal de IgG para o IP (faixa 5 e 6). Para testar a especificidade do anticorpo, foram analisadas as amostras de DNA mesmo, mas usou um conjunto de primers de controle que detecta uma região no 3'-UTR do nosso gene de interesse onde não há ocupação é esperado. Sinais de PCR estão ausentes de todas as pistas (pistas 3-6, Figura 2, 3 '), exceto para o sinal de entrada, representando amostras de DNA não-IP como padrão PCR controles (faixa 1-2, FIGUre 2). Este procedimento chip pode ser realizada tanto após a lesão de coluna vertebral dorsal ciático ou conforme resumido em um esquema (Figura 3).
Figura 1. Gel Agarose de DNA invertido cruzado que foi cortado por sonicação para a faixa adequada de comprimentos de fragmentos.
Figura 2. Resultados Semi-PCR quantitativo do tecido DRG seguintes lesão do nervo ciático mostrando que p53 acetilada se liga ao GAP-43 região promotora proximal 48 horas após a lesão do nervo ciático. Controle de PCR a partir do mesmo show DRG tecido que p53 acetilada não se liga a uma região controle do DNA localizado na região 3'-não traduzida (UTR) do gene GAP-43 (S = Sham, I = lesionados).
Figura 3. Um diagrama geral mostrando a localização dos locais de lesão no nervo ciático ea coluna dorsal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo fornece um método para solicitar directamente sobre o meio ambiente cromatina durante a regeneração axonal no sistema nervoso adulto após lesão axonal. Ele incorpora o modelo de lesão DRG com imunoprecipitação da cromatina para sondar o ambiente de transcrição e epigenéticos após a lesão ou o PNS ou CNS. É particularmente útil para pesquisadores que gostariam de caracterizar suposta sítios de ligação para o seu fator de transcrição favorito, e para determinar se a ocupação destes locais ocorre em resposta a ferimentos. Modificação epigenética de histonas e DNA nesses locais também podem ser monitoradas simultaneamente. Um protocolo semelhante pode ser realizado após lesão do nervo facial, onde os núcleos do nervo facial pode ser dissecada a partir do tronco cerebral e processados por Chip como relatado anteriormente (Tedeschi et al., 2009).
Como típicos para os ensaios de imunoprecipitação da cromatina, a dois passos críticos no protocolo são, (1) fragmentação eficiente e solubilização do complexo DNA-proteína, e (2) a disponibilidade de um anticorpo imunoprecipitação bom para a sua proteína de interesse. Uma limitação que pode confundir estas duas etapas é o baixo nível de matéria-prima. Em comparação com outras estruturas como o cérebro ou da medula espinhal, DRG fornecer uma quantidade relativamente pequena de tecido. Além disso, DRG consiste em um mix população de neurônios, bem como células gliais, que poderia ter ambientes diferentes cromatina. Isso pode levar a sinais de IP heterogênea, no entanto esta advertência está presente na maioria das amostras retiradas do sistema nervoso. Uma solução potencial é realizar ChIP após fluorescentes celulares ativados classificação de transgenicamente fluorescente etiquetado neurônios DRG, (ver, por exemplo YFP-H camundongos, Bogdan et al., 2004), ou imuno-isolamento dos neurônios através de esferas magnéticas (Lee et al. , 2005). No entanto, estas duas abordagens precisam ser validados por chip em DRGs e provavelmente vai precisar de um aumento da quantidade de matéria-prima.
Temos utilizado com sucesso este método para identificar sítios de ligação para fatores de transcrição e vários coativadores no promotor de genes conhecidos associados a regeneração, e nós usamos ambos os métodos semi-quantitativos e quantitativos PCR para detectar o DNA immunoprecipitated. Uma adição futuro para este protocolo pode ser o uso de microarrays de azulejos seguintes ChIP (chip-on-chip), como meios para detectar o sinal de DNA final. Chip-on-chip aumentaria consideravelmente o número de sites de transcrição identificados através de uma abordagem de alto rendimento imparcial. Poderia também permitir o estudo de como duas ou mais fator de transcrição pode interagir de forma cooperativa em um nível genômico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Andrea Tedeschi para ajudar na definição das experiências ChIP inicial em laboratório e Lindner Ricco por sua contribuição para afinar as condições para ChIP. Este trabalho foi financiado pela Fundação Hertie, o Grant Fortune, Universidade de Tuebingen, ea DFG concede DI 1497/1-1 (todos concedida a Simone Di Giovanni).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
